Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время основа процесса биоконверсии растительной биомассы состоит в ферментативном гидролизе целлюлозы до глюкозы с последующим сбраживанием ее в этанол, или получении иных продуктов микробного синтеза. Природная древесина, отходы ее переработки, сельскохозяйственные целлюлозосодержащие отходы представляют потенциальный интерес как дешевое и возобновляемое сырье для получения различных химических продуктов и топлива. Эффективность гидролитического действия целлюлазных комплексов, а также стоимость предобработки сырья являются основными факторами, влияющими на рентабельность процессов биоконверсии лигноцеллюлозной биомассы.
Глубокая деструкция целлюлозы с образованием растворимых Сахаров осуществляется под действием полиферментной системы целлюлаз, включающей в себя эндоглюканазы, целлобиогидролазы и Р-глюкозидазы. Свойства индивидуальных ферментов, а также их взаимодействие в составе целлюлазного комплекса определяют его эффективность при гидролизе целлюлозосодержащих субстратов.
В настоящее время во многих странах ведется активный поиск новых микроорганизмов - продуцентов эффективных целлюлаз и гемицеллюлаз, интесивно проводятся работы по получению штаммов - суперпродуцентов ферментов. Среди различных организмов - промышленных продуцентов целлюлаз и гемицеллюлаз - грибы рода Trichoderma получили наибольшее распространение поскольку обладают высокой секреторной способностью. В отличие от Trichoderma, грибы рода Penicillium синтезируют ферментные комплексы целлюлаз и гемицеллюлаз более сбалансированного состава и эффективнее расщепляющие целлюлозу и целлюлозосодержащие отходы, при этом индивидуальные ферменты Penicillium обладают высокой каталитической активностью и операционной стабильностью. Поэтому получение высокопродуктивных штаммов Penicillium и исследование свойств секретируемого комплекса целлюлолитических и сопутствующих им ферментов является задачей, имеющей большое научное и практическое значение.
Цели и задачи исследования. В диссертационной работе были поставлены следующие цели и задачи:
Разработать эффективный метод разделения компонентов ферментного комплекса, секретируемого новыми мутантными высокопродуктивными штаммами гриба P.verruculosum, полученными в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов (ИБФМ) РАН, на основе этого метода определить состав комплекса и получить очищенные индивидуальные ферменты.
Исследовать биохимические и кинетические свойства индивидуальных ферментов.
Сравнить компонентный состав ферментных комплексов, продуцируемых различными мутантными штаммами P.verruculosum.
Сравнить гидролитическую способность различных целлюлазных полиферментных систем по отношению к различным типам предобработанной древесины.
Выявить вклад слабо и прочно адсорбирующихся целлюлаз в эффективность ферментативного гидролиза целлюлозосодержащих субстратов.
Оценить роль Р-глюкозидазы в процессе гидролиза.
Научная новизна работы. Впервые охарактеризованы и детально изучены 14 основных внеклеточных ферментов P.verruculosum. В гомогенном виде было выделено: четыре целлобиогидролазы - СВН 45(11), СВН 50(11), СВН 55(1) и СВН 66(1); четыре эндоглюканазы - EG 25(111), EG 33(11), EG 36(11) и EG 52(1); две ксилоглюканазы - XG 25 и XG 70; Р-глюкозидаза - b-GL 116; ксиланаза - Xyl 23; а-галактозидаза a-Gal 60; глюкоамилаза - GA 66. На основании анализа субстратной специфичности и детального анализа аминокислотных последовательностей целлобиогидролазы, эндоглюканазы, ксилоглюканазы, а-галактозидаза и ксиланаза классифицированы по их принадлежности к конкретным семьям гликозид-гидролаз.
Практическая значимость работы. Предложена и реализована схема аналитического разделения ферментов P.verruculosum, основанная на использовании высокоэффективной белковой хроматографии среднего давления. Используемый подход позволил также получить индивидуальные ферменты в препаративном количестве, необходимом для исследования.
На основании результатов испытаний ферментов по эффективности их действия на хлопчатобумажную ткань в процессе биодепигментации и биополировки, а также по воздействию ферментов на водорастворимые некрахмальные полисахариды показана перспективность применения некоторых эндоглюканаз P.verruculosum в текстильной промышленности и в качестве кормовых добавок для сельскохозяйственных животных и птиц.
На основании результатов сравнения гидролитической способности ферментных препаратов показана перспективность использования ферментных препаратов P.verruculosum в биотехнологических процессах глубокого осахаривания целлюлозосодержащего сырья, в том числе для производства топливного биоэтанола.
Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на международных конференциях "Биокатализ-2002" (Москва, 2002), "Биокатализ-2005" (Санкт-Петербург - Кижи - Валаам, 2005), "Биотехнология будущего" (Санкт-Петербург, 2006), а также на конференции молодых ученых "Разработка и подготовка промышленного освоения технических ферментов" (Институт биохимии им. А.Н. Баха, Москва, 2006).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения; литературного обзора (четыре главы); отдельной главы, посвященной материалам и методам исследования; четырех глав, в которых приведены результаты и их обсуждение; выводов и списка литературы, содержащего 200
ссылок на публикации в отечественных и зарубежных журналах. Объем диссертации составляет 170 страниц и включает 68 рисунков и 29 таблиц.
