Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Методы определения антиоксидантов в различных объектах (литературный обзор)
1.1. Классификация антиоксидантов 11
1.2. Методы определения отдельных классов антиоксидантов в различных объектах
1.2.1. Пищевые продукты 15
1.2.2. Лекарственные травы И фармпрепараты 21
1.2.3. Биологические жидкости... 28
1.2.4. Применение других инструментальных методов для определения антиоксидантов 31
1.3. Способы оценки суммарной антиоксидантнои способности
пищевых продуктов и биологических жидкостей 38
1.3.1. Пищевые продукты и фитопрепараты 38
1.3.2. Биосубстраты 42
Глава 2. Экспериментальная часть
2.1. Приборы 45
2.2. Электроды 46
2.3. Растворы и реактивы 47
2.4. Объекты исследования 48
2.5. Методики и условия проведения эксперимента 54
Глава 3. Кулонометрическое определение индивидуальных антиоксидантов с помощью электрогенерированных окислителей
3.1. Ионол .2. Жирорастворимые витамины 60
3.3. Водорастворимые витамины 63
3.4. Сорбиновая кислота 64
3.5. Серосодержащие аминокислоты 68
3.6. Мочевая кислота 72
Глава 4. Вольтамперометрическое определение индивидуальных антиоксидантов
4.1. Определение ионола на стеклоуглеродном и золотом электродах.. 75
4.2. Определение серосодержащих аминокислот на платиновом электроде 79
4.3. Определение мочевой кислоты 80
Глава 5. Оценка бромной аншоксидантнои способности пищевых продуктов и фитопрепаратов
5.1. Соки плодов, ягод и овощей 86
5.2. Жировые продукты 89
5.3. Чай 93
5.4. Пиво 97
5.5. Лекарственные травы и биологически активные добавки 99
Глава 6. Исследование других систем для оценки антиоксидантной способности
6.1. Электрохимическая генерация активных частиц кислорода 109
6.2. Применение редокс-индикаторов для определения ионола 113
6.3. Оценка вклада аскорбиновой кислоты в интегральную антиоксидантную способность потенциометрическим методом 114
Заключение 120
Выводы 122
Литература
- Пищевые продукты
- Объекты исследования
- Серосодержащие аминокислоты
- Определение серосодержащих аминокислот на платиновом электроде
Пищевые продукты
Некоторые аспекты применения физико-химических методов для анализа пищевых продуктов рассмотрены в работе [20]. Для определения различных групп антиоксидантов используют спектрофотометрический, кондуктометрический [21], осциллополярографический [22] методы анализа, а также тонкослойную (ТСХ) [23] и высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) с УФ- [24] и электрохимическим детектированием [25]. Для определения пропилгаллата в кукурузных и картофельных хлопьях предложено использовать вольтамперометрический метод с использованием электрода на основе полипиррола, модифицированного комплексом тетрасульфоната никеля (II) с фталоцианином [26]. Гидрофобные образцы растительных масел, содержащих синтетические АО - пропилгаллат, октилгаллат, додецилгаллат и другие, анализируют методом жидкостной хроматографии с прямым вводом пробы в колонку без предварительной экстракции. Пробоподготовка заключается в растворении образца в микроэмульсии вода - додецилсульфат натрия- н-пентанол. Разделение компонентов происходит на колонке, заполненной сорбентом типа Qg, при УФ детектировании на полосе 284 нм [27]. Реакция пропилгаллата с тербием (III), в присутствии додецилсульфата натрия, сопровождающаяся хемилюминесценцией, положена в основу селективного кинетического метода определения пропилгаллата в растительных маслах. Градуировочный график линеен в интервале 0,08н-3,0 мкг/мл, а предел обнаружения составляет 0,02 мкг/мл пропилгаллата, а относительное стандартное отклонение не превышает 2% [28].
Количественное определение синтетических АО - бутилоксианизола (БОА), бутилокситолуола (БОТ) и трет-бутилгидрохинона (ТБГХ) в образцах подсолнечного масла проводят с использованием УФ-видимой спектрофотометрии. Диапазон определяемых концентраций этого типа АО лежит в пределах 10 - 200 мкг/мл для бутилокситолуола и 2 - 80 мкг/мл для остальных АО [29].
Стандартный метод определения содержания БОТ в животных жирах основан на выделении его из жира отгонкой с водяным паром с последующим определением количества его в дистилляте цветной реакцией с хлорным железом и а,а -дипиридилом при 515 нм. Содержание БОА определяют путем экстракции его 72% спиртом из раствора жира в петролейном эфире с последующим определением количества БОА в экстракте с помощью цветной реакции с 2,6-дихлорхинонхлоримидом при 615 нм [30].
В работе [31,32] исследовали электрохимическое поведение БОА и БОТ. Описано вольтамперометрическое поведение БОТ и БОА на угольно-пастовом электроде, модифицированном фталоцианином никеля и предложен метод определения этих АО, основанный на их окислении на этом электроде. Циклическая вольтамперометрия позволила зафиксировать хорошо разрешенный пик БОТ при потенциале приблизительно 200 мВ, более низком чем пик, полученный на не модифицированном электроде. Окисление БОТ проводили в 35% водно-метанольном растворе, с концентрацией модификатора 2% при рН 2. Величина тока электрохимического окисления Ni(I), полученного в результате химического восстановления фталоцианинового комплекса Ni(II) бутилокситолуолом линейна в интервале 1-50 мг/л, а предел обнаружения составляет 0,17 мг/л БОТ. Для БОА градуировочный график линеен в интервалах 1,0-к30,0 , 0,10ч-1,0 и 0,02- 0,10 мг/л, предел обнаружения равен 0,0036 мг/л ( 2,0х10"8 моль/л ). Предложенный метод апробирован на образцах некоторых пищевых продуктов. Определение содержания БОА в сухом печенье поводили проточно-инжекционным методом с амперометрическим детектированием на стеклоуглеродном электроде, модифицированном полимером фталоцианина никеля [33]. На аналитический сигнал не влияет присутствие других АО: БОТ, ТБГХ, пропилгаллата, аскорбиновой и лимонной кислот. Применение проточно-инжекционного метода позволило снизить предел обнаружения БОА до 2,7 мкг/л (1,5х10"8 моль/л).
Исследована возможность применения биосенсора не основе фермента тирозиназы, выполняющего функцию амперометрического детектора в проточно-инжекционном определении БОА в образцах пищевых продуктов [34].
С помощью методов дифференциальной импульсной полярографии и квадратно-волновой вольтамперометрии возможно определение ТБГХ в растворах эмульсий. Предел обнаружения (ПрО) ТБГХ при этом составляет -6,2x10"8 моль/л [35]. Разработанный метод был применен для определения ТБГХ в попкорне после экстрагирования этилацетатом образца.
Предложена экспрессная методика определения витамина Е (токоферола) в образцах масла с использованием экстракции на силиконовой мембране и последующем определении методом ВЭЖХ с электрохимическим детектором [36]. Определение токоферолов (ТФ) в кальмаровом жире [37], маргарине, детском питании [38] и некоторых итальянских сырах проводят также с помощью ВЭЖХ с двумя последовательно соединенными спектрофотометрическим и флуориметрическим детекторами [39]. ПрО ТФ при этом составляет 0,1 мкг/мл [38]. Известен способ определения ТФ в растительных маслах с помощью жидкостного хроматографа с капиллярной колонкой с последующим амперометрическим детектированием на двух поляризованных платиновых электродах с ПрО ТФ на уровне 260 пг [40]. При определении витамина Е в растительном масле имеет значение стадия пробоподготовки. Она состоит в растворении и гидролизе образца в среде метанолriton Х-100-вода с последующей мембранной экстракцией. Полученную фазу разделяют далее на колонке RP-18, связанной с кулонометрическим детектором. Преимущество этого способа состоит в высокой чувствительности и возможности автоматизации анализа [41]. Коэффициент вариации при определении витамина Е в течении 10 дней составил 6,7% [42].
Объекты исследования
В качестве растворителя использовали ацетонитрил, который обеспечивает генерацию вышеуказанных титрантов со 100% выходом по току, а также хорошую растворимость в нем ионола и витамина Е. Электрогенерацию галогенов в ацетонитриле проводили при постоянной силе тока, на гладком платиновом электроде, на фоне 0,2М НСЮ4 или 0,5М NaC104. Серебро (I) и ванадий (V) генерировали путем анодного окисления соответствующих металлических электродов в среде ацетонитрила на фоне 0,2М НСЮ4. Выход по току кулонометрических титрантов - ионов металлов определяли титрованием стандартных растворов аскорбиновой кислоты. а-Токоферилацетат устойчив к окислению галогенами и ионами металлов Ag (I) и V(V), поэтому точно известную навеску исходного раствора а-токоферилацетата (0,6-0,8 г.) омыляли в а-токоферол трехкратным избытком спиртового раствора КОН в течение 10-15 минут на водяной бане в колбе с обратным холодильником. Полученный прозрачный спиртовый раствор витамина Е переносили в мерную колбу, доводили до метки спиртом и, после стандартизации, использовали в качестве стандарта.
Стандартные растворы витаминов Вь В2, В3, Вб, Вд, С, РР и К, лимонной и щавелевой кислот квалификации х.ч. готовили по точной навеске ( 0,1 - 0,2 г.), растворяли в 25 мл бидистиллированной воды, а навеску витамина Р ( 0,1 г.) - в 0,5 М NaOH. Стандартный раствор сорбиновой кислоты готовили по точной навеске (0,1 г.) с добавкой небольших количеств буры для увеличения растворимости сорбиновой кислоты и стабилизации приготовленного раствора.
Соки плодов, ягод и овощей готовили следующим образом: взвешивали по 100 г очищенных от кожуры и сердцевины плодов и овощей, отжимали сок, разбавляли в 3 раза бидистиллированной водой и центрифугировали при 5000 об/мин.
Анализу подвергали свежеприготовленный сок, сок после кипячения в течение 15 мин в колбе с обратным холодильником (тепловая обработка), а также сок после трехдневного хранения при температуре 2-г-б С.
Экстракты чая готовили согласно методике [167]. К навеске чая (1 г) приливали 50 мл доведенной до кипения бидистиллированной воды и экстрагировали в течение 5 мин. Экстракт отфильтровывали и кулонометрически оттитровывали бромом.
Отвары из лекарственного сырья готовили следующим образом: навеску (10 г.) высушенных и измельченных частей растений высыпали в заранее подогретую круглодонную колбу; заливали бидистиллированной водой (200 мл) комнатной температуры. Кипятили в колбе с обратным холодильником на водяной бане в течение 15 мин, настаивали 45 мин и процеживали. Полученный настой доводили бидистиллированной водой до 200 мл.
В кулонометрическую ячейку вносили 20,0 мл фонового раствора и аликвоту исследуемого раствора (0,2- 2,0 мл). Для титрования брали аликвоты с таким расчетом, чтобы время титрования не превышало 5 мин. Фиксировали изменение индикаторного тока во времени. По перегибу на индикаторных кривых находили конечную точку титрования (к.т.т.) и рассчитывали количество электричества в кулонах, затрачиваемое на 100 г продукта по формуле: Q=3ItV!/V2, где I - сила тока, A; t - время достижения к.т.т., с; V! - объем сока, полученного из 100 г ягод и овощей, мл; V2 - объем аликвоты, мл.
Кулонометрическое определение жирорастворимых антиоксидантов проводили следующим образом: в ячейку на 50,0 мл вводили 20,0 мл фонового раствора, опускали электроды и включали генераторную цепь. По достижении определенного значения индикаторного тока (50,0 мкА) в ячейку вносили аликвоту исследуемого раствора в ацетонитриле и одновременно включали секундомер. Конечную точку титрования фиксировали по достижению первоначального значения индикаторного тока. При этом выключали секундомер и отключали генераторную цепь. Время одного титрования составляет 3-5 минут.
Волыпамперометрическое определение ионола проводилось следующим образом: в электрохимическую ячейку объемом 50,0 мл вводили 25,0 мл фонового электролита, состоящего из смеси ацетонитрил-вода (9:1) и 0,1 М NaC104, и аликвоту исследуемого раствора. Опускали рабочий, вспомогательный и хлоридсеребряный электроды; снимали циклические вольтамперные кривые с линейной разверткой потенциала со скоростью 20 мВ/с.
Вольтамперограммы растворов серосодержащих аминокислот и мочевой кислоты на различных электродах снимали на фонах 0,5 М NaOH, боратного (рН 9Д8) и фосфатного (рН 6,86) буферных растворов.
Вольтамперометрическое определение антиоксидантной способности пива проводили по следующей методике. В электрохимическую ячейку объемом 50,0 мл вносили 20,0 мл 1,0x10"3 М раствора ванадата натрия и аликвоту исследуемого раствора, помещали рабочий и вспомогательный электроды, электрод сравнения, и снимали циклические вольтамперограммы восстановления V(V), начиная со значения стационарного потенциала платинового электрода.
Фотометрическое определение суммы флавоноидов в экстрактах чая проводили на приборе КФК-2 с кюветами толщиной 5,065 мм по методикам [168, 169]. Оптическую плотность растворов снимали при 400 нм.
При потенциометрическом определении аскорбиновой кислоты в ячейку объемом 50,0 мл вносили 20,0 мл фонового раствора и аликвоту исследуемого раствора, опускали индикаторный электрод (платиновый модифицирован йодом или графитовый - пленкой берлинской лазури) и насыщенный каломельный электрод. Потенциал индикаторного электрода измеряли по установлении равновесного значения.
При определении ионола с использованием редокс-индикаторов в коническую колбу наливали от 0,1 до 1,2 мл (2,28х10 2 М) раствора ионола в ацетонитриле, добавляли до объема 3,0 мл ацетонитрила или спирта. Содержимое колбы титровали из микробюретки 0,007 М раствором окисленной формой ферроина до получения устойчивой красной окраски.
Серосодержащие аминокислоты
Антиоксидантная способность жировых продуктов определяется содержанием токоферолов, каротиноидов, витаминов А и D. В продукты с низким содержанием природных антиоксидантов иногда добавляют синтетические АО, чаще всего ионол.
Экстракция петролейным эфиром и спиртом. Жирорастворимые антиоксиданти экстрактов сока моркови, растительных масел и рыбьего жира извлекали петролейным эфиром и этиловым спиртом (1:1) по стандартной методике [181]. При экстракции петролейным эфиром и этиловым спиртом витаминов- антиоксидантов в экстракт могут переходить токоферолы, каротин, витамины А и D и некоторые другие соединения, обладающие свойствами восстановителей. Все эти соединения способны реагировать с электрогенерированным бромом. Было установлено, что однократная экстракция в этих условиях обеспечивает их количественное извлечение. На основе результатов титрования оценивали антиоксидантную способность экстрактов (таблица 18).
Как видно из таблицы 18, рыбий жир обладает наибольшей бромной антиоксидантной способностью, что обусловлено высоким содержанием в нем витаминов А и D2. Среди рафинированных растительных масел масло "Злато" имеет более высокие значения бромной антиоксидантной способности. Возможно, это связано с дополнительным введением синтетического витамина Е или присутствием других веществ, например, некоторых псевдотокоферолов, обладающих свойствами восстановителей, но не проявляющих витаминную активность.
Экстракция ацетонитрилом. Для извлечения жирорастворимых антиоксидантов из растительного масла применяли четырехкратную экстракцию ацетонитрилом. Установлено, что оптимальное время однократной экстракции составляет 5 мин. Проведена оценка суммарного содержания жирорастворимых антиоксидантов в подсолнечных рафинированных маслах по данным бромной антиоксидантной способности исследуемых экстрактов. Результаты определения в пересчете на витамин Е представлены в таблице 19.
Результаты, представленные в данной таблице, свидетельствуют о соответствии суммарного содержания жирорастворимых антиоксидантов в этих маслах естественному значению. Полученные данные хорошо согласуются с результатами таблицы 18, что указывает на возможность использования этого способа экстракции для извлечения жирорастворимых антиоксидантов.
Определение ионола в растительном масле. Для обеспечения антиокислительной стойкости рафинированного растительного масла, в него вводят добавки синтетического витамина Е или других малотоксичных антиоксидантов, например ионола. Поэтому была изучена возможность кулонометрического определения ионола в экстрактах растительных масел.
Возможность экстракции ионола из растительного масла изучали с помощью диметилформамида, пропиленкарбоната и ацетонитрила. Степень извлечения ионола из масла определяли кулонометрически с помощью электрогенерированного хлора. Установлено, что при однократной экстракции пропиленкарбонатом степень извлечения ионола составляет 25%, диметилформамидом - 36%, а ацетонитрилом - 76%. Наиболее подходящим растворителем оказался ацетонитрил. Была изучена зависимость степени извлечения ионола из масел от кратности и времени экстракции. Оказалось, что 4-х кратная экстракция ацетонитрилом обеспечивает количественное извлечение ионола.
Для того, чтобы обеспечить наиболее высокую степень извлечения при экстракции, в ацетонитрил вводили стандартные количества солей ванадия (V) или Се (IV). Исходя из значений стандартных окислительно-восстановительных потенциалов соли этих металлов должны количественно окислять ионол. Окисление ионола ванадием (V) или Се (IV) в ходе экстракции позволило бы, с одной стороны, изменить коэффициент распределения, а с другой стороны, по расходу окислителя найти кулонометрически или вольтамперометрически количество ионола в анализируемой пробе. Оказалось, что Се (IV) частично переходит в масло, а ванадий (V) окисляет ионол только в сильнокислых средах, что не дало возможность улучшить экстракцию ионола из масел. На основе проведенных исследований разработаны методики определения ионола в масле. Определение содержания ионола в аликвотах экстракта (0,2 - 1,0 мл) производили методом кулонометрического титрования электрогенерированным хлором. Результаты определений ионола представлены в таблице 20.
Следует отметить, что метод добавок показывает возможность определения ионола в подсолнечном масле. Однако в суммарные результаты определения основной вклад вносят токоферолы, искусственно вводимые в масло в качестве антиоксиданта, а также ненасыщенные жирные кислоты, такие как олеиновая и линолевая. Таблица 20. Результаты определения ионола в подсолнечных рафинированных маслах (п=5;
Созревший чайный лист содержит около 130 различных веществ [182]. Антиоксидантная способность чайного напитка определяется содержанием в нем танина, катехинов, полифенолов, витаминов А, Е и аскорбиновой кислоты. Помимо этих составляющих чайного напитка, в его химическую композицию входят кофеин, теофиллин, теобромин, углеводы, органические кислоты и эфирные масла.
После изучения реакций индивидуальных компонентов чая, проявляющих антиоксидантные свойства, была предпринята попытка оценить антиоксидантную способность экстрактов различных сортов чая с помощью электрогенерированного брома.
Параллельно в экстрактах чая определяли суммарное содержание флавоноидов фотометрическим методом по реакции комплексообразования с хлоридом алюминия. В качестве стандартного образца применен рутин. Результаты определения суммы ФЛ в пересчете на рутин выражали в мг на 100 г чая.
Определение серосодержащих аминокислот на платиновом электроде
Была изучена возможность индикации активных частиц кислорода, образующихся при электрохимическом восстановлении Н202 с помощью методов амперометрии и потенциометрии на различных твердых металлических и модифицированных электродах. Эффективность электровосстановления Н2О2 по току, установленная перманганатометрически, в условиях эксперимента составляет примерно 90%. Несмотря на высокий выход продуктов по току, регистрировать образование продуктов восстановления известными электрохимическими методами не удалось. Для регистрации образующихся активных частиц кислорода далее исследовалась возможность применения редокс-индикаторов: дифениламина, фенилантраниловой кислоты и ферроина. Окисление дифениламина и изменение окраски раствора происходило уже до проведения электролиза, вероятно самим пероксидом водорода. Фенилантраниловая кислота и ферроин не окислялись активными частицами кислорода даже при длительном электролизе и варьировании концентраций компонент системы и силы тока.
Для изучения окислительных свойств промежуточных соединений восстановления пероксида водорода, по-видимому, лучше всего подойдут системы, моделирующие процессы окисления пептидов, например, глицилтриптофана, или внутренние стандарты - аскорбиновая кислота, рутин, витамин Е и т.п. Используя такие модельные системы и активные частицы кислорода, генерируемые электрохимически, можно будет определить антиоксидантные свойства пищевых продуктов, лекарственных препаратов и биосубстратов. Исследования в этом направлении продолжаются.
Кроме того, достаточно полезную информацию об интегральной антиоксидантной способности изученных растительных объектов и биосубстратов могут дать вольтамперограммы на твердых стационарных электродах, где значения потенциалов полуволн окисления растворов будут говорить о природе биоантиоксидантов, а суммарные их высоты об интегральном количестве антиоксиданта. Корректность такого пути исследований подтверждает работа, появившаяся недавно в печати [191].
Исследовалась возможность титриметрического определения ионола окисленными формами некоторых редокс-индикаторов (ферроина, дифениламина, N-фенилантраниловой кислоты). Ферроин представляет собой комплекс железа (II) с фенантролином — Fe(Phen)32+. Окислительно-восстановительный потенциал системы составляет 1,06 В. Установлено, что прямым синтезом (смешивая соли Fe (III) и 1, 10-фенантролином) получить окисленную форму ферроина — Fe(Phen)33+ не удается. Попытка получить Fe(Phen)33+ из хлорида железа (III) при различных рН раствора привела также к неудовлетворительным результатам. Вероятно, Fe(III) в растворе находится в виде устойчивых гидроксокомплексов. Поэтому Fe(Phen)33+ получали окислением комплекса Fe(Phen)32+ перманганатом калия в кислой среде. Приготовленным таким образом раствором ферроина титровали модельные растворы ионола в среде ацетонитрила и спирта. При этом наблюдается переход окраски индикатора от синей до красной. При титровании модельных растворов ионола окисленным ферроином установлено, что на результаты титрования в значительной степени влияет природа растворителя.
На основе этих исследований был приготовлен тест-индикатор на восстановители, в том числе на ионол. Бумага для хроматографии пропитывалась окисленной формой ферроина. К сожалению, индикаторная бумага оказалась неустойчивой. Ее окраска при хранении на воздухе быстро изменяется. На основе той же редокс-системы, но в несколько измененных условиях, была предпринята еще одна попытка изготовить тест индикатор. Для этого фильтровальная бумага пропитывалась раствором соли железа (III) и 1, 10-фенантролином, при этом бумага приобретала желтую окраску. Как уже говорилось ранее, комплекс железа (III) с фенантролином в этих условиях не образуется. При погружении полоски бумаги в раствор, содержащий ионол, железо (III) восстанавливается до железа (II) и образуется комплекс с фенантролином красной окраски. Интенсивность окраски зависит как от времени выдерживания, так и от концентрации ионола. Однако, при малых концентрациях ионола образование данной окраски идет очень медленно. Оценка вклада аскорбиновой кислоты в интегральную антиоксидантную способность потенциометрическим методом
Известно, что по величине окислительно-восстановительного потенциала аскорбиновая кислота среди антиоксидантов является одним из наиболее сильных восстановителей и, следовательно, потенциалопределяющей редокс-парой на инертных электродах по всей вероятности является пара аскорбиновая/ дегидроаскорбиновая кислота.
В качестве электродов с потенциометрическим откликом на содержание аскорбиновой кислоты исследованы платиновый электрод, модифицированный йодом, а также графитовый и стеклоуглеродный электроды, покрытые берлинской лазурью. Электроды, содержащие в своем составе эти медиаторные редокс- системы являются окислительно-восстановительными по отношению к аскорбиновой кислоте.
Ранее проведенные исследования показывают, что металлическая платина хорошо адсорбирует как йодид-ионы, так и молекулярный йод [192]. По мере того, как увеличивается время "йодирования" электрода, йод и йодид-ионы не только адсорбируются на поверхности, но и проникают в глубь платины. Удалить адсорбированный йод с электрода можно лишь прокаливанием платины в пламени газовой горелки, катодно-анодной поляризацией электрода или длительным промыванием его 2М раствором КОН. Установлено, что модифицированный йодом платиновый электрод становится чувствительным на восстановители, особенно на аскорбиновую кислоту, вероятно за счет быстрых редокс- реакций на поверхности электрода.
