Содержание к диссертации
Введение
1 Аналитический обзор 9
1.1 Классификация антиоксидантов и их общая характеристика 9
1.2 Основные классы природных антиоксидантов 13
1.2.1 Фенольные соединения 13
1.2.2 Витамины 20
1.2.3 Убихинон (коэнзим Q) 22
1.2.4 Аминокислоты 22
1.2.5 Органические кислоты 23
1.3 Определение антиоксидантной активности индивидуальных веществ, растительного сырья и пищевых продуктов 23
1.3.1 Определение активности антиоксидантов по их способности ингибировать окисление жиров и жиросодержащих субстратов 24
1.3.2 Определение активности антиоксидантов по их способности взаимодействовать с кислородными радикалами 38
1.3.3 Определение активности антиоксидантов по их способности взаимодействовать со стабильными окрашенными радикалами 45
1.3.4 Использование окислительно-восстановительных систем для определения антиоксидантной активности 48
1.4 Выводы к аналитическому обзору 52
2 Экспериментальная часть и обсуждение результатов 54
2.1 Материалы, реактивы и используемое оборудование 54
2.2 Приготовление используемых в работе растворов 55
2.2.1 Приготовление комплексного реагента 55
2.2.2 Приготовление головных (стандартных) и рабочих растворов восстановителей органической природы 56
2.2.3 Приготовление 0,5 М раствора фторида натрия 57
2.2.4 Приготовление 0,02 М раствора ЭДТА 57
2.2.5 Приготовление экстрактов лекарственного сырья и чая 57
2.3 Методики для проведения дополнительных исследований 58
2.3.1 Методика определения фенольных соединений в вине 58
2.3.2 Методика определения цветовых характеристик вина 59
2.3.3 Методика определения ванадатной окисляемости 60
2.4 Исследование системы Ре(Ш)/Ре(П)-о-фенантролин для оценки антиоксидантнои способности природных объектов 62
2.4.1 Обоснование возможности использования системы Fe(III)/Fe(II)-о-фенантролин для оценки антиоксидантнои способности 62
2.4.2 Оптимизация состава комплексного реагента Fe(III)-о-фенантролин 63
2.4.3 Изучение влияния индивидуальных восстановителей и их смесей на индикаторную систему Ре(ІІІ)/Ре(ІІ)-о~фенантролин 67
2.5 Антиоксидантная активность пищевых продуктов как обобщающая характеристика показателя их качества 74
2.5.1 Разработка способа оценки антиоксидантнои способности природных объектов 74
2.5.2 Сопоставительный анализ известных суммарных показателей и величин антиоксидантнои активности пищевых продуктов 93
2.6 Метрологическая аттестация методик определения антиоксидантнои активности вина, пива и растительного сырья 107
2.7 Влияние экологической ситуации территории на величину антиоксидантнои активности растительных материалов 118
Выводы 123
- Основные классы природных антиоксидантов
- Определение активности антиоксидантов по их способности взаимодействовать с кислородными радикалами
- Методики для проведения дополнительных исследований
- Метрологическая аттестация методик определения антиоксидантнои активности вина, пива и растительного сырья
Введение к работе
Цепные реакции с участием свободных радикалов являются основной причиной окислительного разрушения клеточных мембран, денатурации белков и нуклеиновых кислот, что приводит к возникновению различных патологических состояний.
В нормальном состоянии образование свободных радикалов в организме регулируется действием антиоксидантной защитной системы, включающей ферменты, сывороточные белки, гормоны, витамины, низкомолекулярные сульфидные соединения и органические кислоты. Присутствуя даже в незначительных количествах, антиоксиданты способны стабилизировать активные свободные радикалы, значительно замедляя или ингибируя, протекающие по цепному механизму, окислительные реакции. Однако, воздействие неблагоприятных факторов окружающей среды, приводит к избыточному образованию свободных радикалов, тем самым, вызывая дисбаланс в антиоксидантном статусе человека. Такое состояние называется окислительным стрессом.
Дополнительными источниками антиоксидантов для человека могут служить пищевые продукты растительного происхождения: овощи, фрукты, ягоды, соки, вино, чай, кофе и какао. Антиоксидантные свойства пищевых продуктов обусловлены такими биологически активными веществами как фенольные соединения, витамины, протеины, сахара, карбоновые и аминокислоты. Поэтому антиоксидантная активность (АОА) пищевых продуктов является одним из основных показателей, определяющих их биологическую ценность.
Антиоксиданты также широко используются для предотвращения окислительной порчи масел, жиров и жиросодержащих продуктов в процессе производства и хранения. Однако применение синтетических антиоксидантов ограничено из-за их возможного токсического действия. Это проводит к необходимости поиска альтернативных соединений среди растительного
сырья, обладающих высокой антиоксидантнои активностью и безвредных для человека.
В настоящее время наиболее популярны методы оценки антиоксидантнои активности, основанные на окислении различных липидных субстратов с последующим определением продуктов окисления. Несмотря на доступность, большинство методов, относящихся к данной группе, являются длительными и дают плохо воспроизводимые результаты. В связи с этим, разработка новых методов, сочетающих экспрессность с достоверностью и высокой воспроизводимостью полученных данных, остаются актуальной задачей.
Диссертационная работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты № 03-03-96548, № 06-03-96616).
Цель работы: Исследование индикаторной системы Fe(III)/Fe(II)-o-фенантролин и разработка на её основе способа определения интегральной антиоксидантнои активности растительного сырья и пищевых продуктов.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
теоретически обосновать и экспериментально доказать возможность использования индикаторной системы Ре(Ш)/Ре(П)-о-фенантролин для разработки спектрофотометрического способа оценки антиоксидантнои активности растительного сырья и пищевых продуктов;
исследовать влияние индивидуальных восстановителей органической природы и их смесей на индикаторную систему;
оценить суммарную антиоксидантную активность и провести сопоставительный анализ ее величины с известными суммарными характеристиками ряда пищевых продуктов и растительного сырья.
В ходе решения поставленных задач в диссертационной работе предложена и изучена индикаторная система Ре(Ш)/Ре(П)-офенантролин для оценки антиоксидантнои активности пищевых продуктов и растительных материалов.
Исследовано влияние восстановителей фенольной и нефенольной
природы на индикаторную систему и показан суммарный характер
измеряемой величины антиоксидантнои активности.
Показана возможность использования величины суммарной антиоксидантнои активности для характеристики качества пищевых продуктов и растительного сырья.
Предложен способ определения суммарной антиоксидантнои
активности пищевых продуктов и лекарственных препаратов на основе і
растительного сырья с использованием индикаторной системы
Ре(Ш)/Те(11)-о-фенантролин.
Проведена метрологическая аттестация методик определения
антиоксидантнои активности вин и лекарственных растений. Методика
апробирована на образцах вина, пива, соков, чая, лекарственных трав и
настоек.
Основные классы природных антиоксидантов
Фенольные соединения представляют собой один из наиболее распространенных и многочисленных классов природных соединений, обладающих антиоксидантными свойствами. Отличительной особенностью этих соединений является наличие свободного или связанного феноксильного радикала. Растительные фенольные соединения встречаются как в свободном (агликоны), так и в связанном с сахарами (гликозиды) виде. Сахарная часть гликозидов представлена главным образом простейшими сахарами, преимущественно глюкозой, и реже дисахаридами и олигосахаридами. Феноксильный гидроксил нередко бывает алкилирован, среди алкильных производных обычно встречаются метоксильные (-СН3). Фенольные соединения чрезвычайно распространены в растительном мире и встречаются во всех органах растений. Кроме того, они определяют биологические свойства, а также цвет и вкус многих пищевых продуктов: фруктов, овощей, зерновых, чая, кофе, какао, и продуктов их переработки, таких как соки, вино, пиво [14]. Фенольные соединения классифицируют с учетом их структур следующим образом [15]: - соединения Сб - Сі ряда, состоящие из ароматического ядра и одноуглеродной боковой цепи (оксибензойные кислоты и соответствующие альдегиды и спирты); - соединения Сб - Сз ряда, состоящие из ароматического ядра и трехуглеродной боковой цепи (оксикоричные кислоты и соответствующие спирты, кумарины); - соединения Сб - Сз - Сб ряда, состоящие из двух ароматических ядер, соединенных между собой трехуглеродным фрагментом (флавоноиды); - олигомерные и полимерные фенольные соединения (танины). Простые фенольные соединения (Сб), например, оксибензолы (пирокатехин, гидрохинон, резорцин, флороглюцин) и их метиловые эфиры, встречаются в растениях очень редко. Среди фенольных соединений с одним ароматическим кольцом наиболее распространены фенольные кислоты: производные бензойной кислоты (я-оксибензойная, салициловая, [3-резорциловая, сиреневая и галловая кислоты), которые встречаются в растениях как в свободном виде так и виде эфиров и гликозидов; производные коричной кислоты (и-оксикоричная, и-кумаровая, кофейная, феруловая и синаповая кислоты), встречающиеся в основном в виде эфиров [16]. Фенольные кислоты являются многофункциональными антиоксидантами.
Они способны нейтрализовать пероксирадикалы, действуя как цепь-обрывающие антиоксиданты, являются «ловушками» супероксидных анионов и синглетного кислорода, связывают ионы металлов, участвующие в реакции Фентона, которая является одним из основных механизмов образования активных форм кислорода [17]: Fe2+ + Н2О2 — Fe3+ + НО + ОН" (1.7). Антиоксидантная активность фенольных кислот связана с их химической структурой. Установлено [18], что производные коричной кислоты, содержащие -СН=СН-СООН группу являются более активными антиоксидантами, чем производные бензойной кислоты, содержащие -СООН группу, что объясняется влиянием на стабильность феноксильного радикала двойной связи. Введение гидроксильных или метоксильных заместителей в орто- и пара- положение также увеличивает антиоксидантную способность фенольных кислот. Флавоноиды (бензо-у-пираны) - наиболее распространенная группа мономерных фенольных соединений, имеющая ароматический заместитель в пирановом кольце. Из-за большой биологической важности их выделяют в особый класс. Образование циклической структуры флавоноидов происходит путем внутримолекулярной реакции Михаэля - присоединением фенольной гидроксильной группы по активированной двойной связи халкона [19]. В зависимости от степени окисления пиранового кольца (трехуглеродного фрагмента) флавоноиды можно разделить на 14 групп, -основные из которых: катехины, лейкоантоцианидины, антоцианидины, флаваноны, флавоны, флавоноли. Наиболее восстановленной группой I являются катехины, наиболее окисленной - флавонолы [20]. Катехины (катехин, галлокатехин, катехингаллат и . галлокатехингаллат) содержат два асимметричных углеродных атома (С2 и С3), поэтому для каждого из катехинов возможны четыре изомера и два рацемата. В природе обнаружены все изомерные формы катехинов, которые в сравнительно мягких физических и химических условиях способны переходить друг в друга [15].
Катехины являются основным компонентом фенольных соединений зеленого чая. Листья зеленого чая содержат шесть основных катехинов: (+)-катехин, (-)-эпикатехин, (-)-галлокатехин, (-)-эпикатехин галлат, (-)-эпигалокатехин, (-)-эпигалокатехин галлат, преобладающим из которых является (-)-галлокатехин. Катехины составляют около 30 % сухой массы зеленого чая и их содержание наиболее велико в молодых листьях [21]. Во время ферментации катехины зеленого чая превращаются в окрашенные продукты окисления и конденсации, оранжевые теафлавины и коричневые теабургины [11], которые обуславливают специфический аромат, цвет и вкус черного чая. Значительное количество катехинов также содержатся в винограде, цитрусовых, яблоках, грушах, айве, вишне, смородине [22]. Лейкоантоцианидины (лейкопеларнонидин, лейкоцианидин, лейкодельфинидин) встречаются в составе очень многих растений [23]. В молекуле лейкоантоцианидина имеется три хиральных углеродных атома (Сг, С3, С4) и, следовательно, возможно существование восьми стереоизомеров. Однако каждый флавандиол в природе представлен одним вполне определенным стерическим вариантом. Перехода из одной формы в другую, как в случае катехинов, не наблюдается. Для лейкоантоцианидинов, как и для катехинов, не характерно гликозилирование и образование галлоильных эфиров [15]. Лейкоантоцианидины - весьма неустойчивые соединения, которые легко полимеризуются, образуя димеры, олигомеры и окрашенные полимеры (флобафены). Олигомеры лейкоантоцианидинов и катехинов (флобатаннины) являются составной частью негидролизуемых (конденсированных) танинов [19]. Антщианидины (пеларгонидин, цианидин, пеонидин, дельфинидин, петунидин, мальвидин) являются красящими пигментами растений и придают плодам, ягодам, листьям и цветам самые разнообразные оттенки -от розового до темно-фиолетового [24, 25]. Биогенетически они образуются из лейкоантоцианидинов путем отщепления молекулы воды и удалением протона в результате окисления. В растительных тканях антоцианидины присутствуют исключительно в виде гликозидов, которые называются антоцианами [19]. Антоцианы широко распространены в природе [1]. В антоцианах остаток сахара присоединяется в положение Сз, в случае моногликозидов, и в положение С3 и С5, в случае дикликозидов. Из Сахаров, входящих в состав антоцианов, наиболее часто встречается глюкоза, намного реже арабиноза, рамноза и галактоза. Кроме того, некоторые антоцианидины могут образовывать соединения с ароматическими кислотами (и-оксикоричной, п-оксибензойной, гс-кумаровой, кофейной), образуя ацилированные пигменты [15]. Антоцианы способны образовывать резонансные структуры при изменение рН, что обуславливает большое разнообразие цветов: от красного различной интенсивности в кислой среде (рН 5) до синего в щелочной (рН 6-8). В сильно щелочной среде образуются феноляты зеленого цвета [26]. Цвет антоцианов также зависит от характера металла, образующего с ним комплекс: с молибденом - фиолетовая окраска, с железом - синяя, с никелем и медью - белая [27].
Определение активности антиоксидантов по их способности взаимодействовать с кислородными радикалами
Известно довольно много методов определение антиоксидантной активности, основанных на способности антиоксидантов, связывать свободные радикалы, для генерирования которых используют различные системы. Для получения супероксид анион радикалов (О "г) используются системы: ксантин/ксантин оксидаза [83], гипоксантин/ксантин оксидаза [84], окисление NADH (никотин амид аденин динуклеотид) [85]. Для генерирования гидроксил радикалов (ОН-) используются системы: FeSOV H202 [83], FeS04 - ЭДТА/Н202 [86, 87], пероксидаза хрена/Н202, CuSOV Н202 [88], СоС12 - ЭДТА/Н202, CoS04/H202 [158], H202/FeCI3 /аскорбиновая кислота [50,89,90]; гидрохлорид анионов (OCl")-NaOCI, пероксинитрит анионов (ONOCT) - NaN02/H202 [83], перокси-радикалов (ROO")-термическое разложение 2,2-азобис(-амидинопроран гидрохлорид)-ААРН- [91]. Разработан способ оценки антиоксидантной активности фенольных соединений по способности связывать супероксид анион радикалы, генерируемые в системе гипоксантин/ксантин оксидаза [84]. При рН 7,4, супероксид анионы восстанавливают тетразоний голубой до формазана, содержание которого определяют спектрофотометрически при X = 560 нм. Оптическая плотность пропорциональна количеству 0 "2. Фенольные соединения подавляют образования формазана голубого, что вызывает уменьшение абсорбции. Антиоксидантную активность выражали количеством антиоксиданта, необходимым для уменьшения первоначальной концентрации О" 2 на 50 % в моль/дм . Описан метод оценки антиоксидантной активности аскорбиновой и галловой кислоты [90], фенольных соединений [92], вин [93], некоторых специй (базилика, лавра, петрушки, укропа, имбиря и др.) [50], основанной на ингибировании реакции разложения 2 диокси-Б-рибозы, вызванной гидроксильными радикалами ОН", генерируемыми в системе H202/FeCI3 /аскорбиновая кислота. Реакционную смесь инкубировали при 37 С в течение 30-60 мин, затем степень окислительного разрушения 2-диокси-Б-рибозы определяли тиобарбитуратным методом.
Антиоксидантную активность выражали в эквивалентах маннитола [50], или в процентах восстановления относительно контрольного раствора, не содержащего исследуемый образец [93]. Использование метода хемилюминесценции для определения антиоксидантной активности Реакция рекомбинации радикалов (супероксид анион-радикалов, гидроксильных и липидных радикалов) сопровождается очень слабым свечением, которое может быть усилено добавлением активатора. На этом свойстве радикалов основаны хемилюминесцентные методы определения антиоксидантной активности, заключающиеся в измерение интенсивности свечения до и после добавления в систему ингибитора радикалов (антиоксиданта). Преимуществом реакций хемилюминесценции является их высокая чувствительность. Существующие методы различаются способом и типом генерируемого свободного радикала, а также используемого активатора хемилюминесценции. В качестве активаторов хемилюминесценции (ХЛ) используют люминол [83,94-99], родамин 6Ж [70,100], гомованиловую кислоту [8, 101], акридин [102], флуоресцеин [103] и другие соединения. Наиболее популярным является метод, основанный на использование люминолзависимой ХЛ. Люминол и родственные ему соединения легко окисляются активными формами кислорода (0 "2, ОН", Н202, ОСП, ONOO") до люминесцирующего продукта 3-аминофталат аниона [83]. Добавление антиоксиданта, приводит к тушению хемилюминесценции, обычно с определенным периодом индукции. В литературе описаны методы определения антиоксидантной активности аскорбиновой кислоты [83], аминокислот и трипептида глутатиона [97] растительного сырья [94, 99], экстрактов чая [98], биологических жидкостей [95, 96] с использованием люминола в качестве активатора ХЛ. Хемилюминесцентный анализ успешно используется как для определения антиоксидантной активности индивидуальных веществ, так и пищевых продуктов. Спектрофлуориметрическим методом, основанным на окислении гомованиловой кислоты до ее флуоресцирующего димера пероксидом водорода (Н202) определена антиоксидантная активность природных и синтетических антиоксидантов (феруловой кислоты, бутилгидроксианизола, пирогаллола, кофейной, хлорогенновой, ванилиновой кислот), чая и лекарственных трав [8], белых и красных вин [101]. Антиоксидантную активность образцов выражали в тролокс эквивалентах. Интенсивность флуоресценции измеряли при длине волны возбуждения (315 нм) и испускания (425 нм). Линейная зависимость между концентрацией антиоксиданта и процентом ингибирования окисления гомованиловой кислоты наблюдалась для тролокса в интервале: 0,2-1,6 мМ, бутил гидроксианизола: 0,02 - 0,3 мМ, феруловой кислоты: 0,005 - 0,2 мМ, кофейной кислоты: 0,05 - 2,5 мМ, хлорогеновой кислоты: 0,025 - 2,5 мМ, протокатехиновой кислоты: 0,05-6,0 мМ, ванилиновой кислот: 2,0 - 20 мМ, пирогаллола: 0,2 - 1,7 мМ, щавелевой кислоты: 2,0 - 30 мМ. Среди растительных экстрактов наибольшую антиоксидантную активность показали мелиса, зеленый и черный чай, мята [8].
Антиоксидантная активность красных вин выше, чем белых и обусловлена фенольными соединениями винограда, антиоксидантные свойства белых вин, в основном определяют фенольные соединения, образующиеся в процессе изготовления вина [101]. Предложен чувствительный и простой метод оценки антиоксидантной способности водных экстрактов оливкового и подсолнечного масла с использованием люцигенина (N,N - диметил-9,9 -биакридин динитрата) [104], Установлено, что антиоксидантная способность оливкового масла в 2 -10 раз, чем подсолнечного масла, за счет более высокого содержания фенольных соединений. Антиоксидантную активность аскорбиновой кислоты, мочевой кислоты, кверцетина, рутина и сыворотки крови определяли методом, основанным на флуоресценции 6-карбокси флуоросцеина в присутствии пероксил радикалов, образующихся при разложении ААРН [105]. Интенсивность флуоресценции измеряли при длине волны испускания - 520 нм. Наибольшая антиоксидантная активность характерна для кверцетина, который по активности почти в 10 раз превосходит аскорбиновую кислоту. Метод, основанный на флуоресценции флуоресцеина при взаимодействии с гидроксил радикалами, генерируемыми в системе H2O2/C0SO4, применен для оценки антиоксидантной активности экстрактов граната [103]. Определена антиоксидантная активность пищевых добавок (аскорбиновой, лимонной, винной, фумаровой кислот и тролокса) по способности ингибировать ХЛ, вызванную фотолизом акридина в присутствие гидроксида калия [102]. Добавление антиоксиданта вызывает уменьшение интенсивности свечения при длине волны испускания 357 нм. Максимальный ингибирующий эффект для всех веществ наблюдалась в интервале концентраций от 10"3-10"2М. Среди исследованных пищевых добавок наибольшую антиоксидантную активность проявляют адипиновая кислота, наименьшую - лимонная кислота и тролокс. Хемилюминесцентным методом определена антиоксидантная активность пищевых продуктов (соков, вин, пива, чая, кофе) [106] по способности ингибировать фотоокисление пептида глицилтриптофана. Антиоксидантную активность выражали относительно активности рутина. Наиболее высокой антиоксидантной активностью обладают сухие виноградные вина. Антиоксидантная активность столовых вин и настоек ниже. Темные сорта пива активнее светлых. Антиоксидантная активность свежеотжатых соков выше, чем заводского производства. Из черных сортов чая наибольшей антиоксидантной активностью обладает пакетированный, затем - гранулированный, затем крупно- и средне-листовой. У растворимого черного кофе антиоксидантная активность выше, чем у кофе в зернах. Метод, основанный на фотосенсибилизированной хемилюминесценции глицилтриптофана также был использован для оценки антиоксидантной активности лекарственного растительного сырья [107].
Методики для проведения дополнительных исследований
Для проведения сопоставительного анализа и доказательства правильности разработанного спектрофотометрического способа определения АОА с использованием индикаторной системы Fe(III)/Fe(II)-o-фенантролин необходима оценка исследуемых образцов по таким суммарным показателям как содержание фенольных соединений в вине, экстрактивных веществ в пиве и чае, цветовые характеристики вина, ванадатная окисляемость. Определение содержания экстрактивных веществ в образцах пива и чая проводили в соответствии с ГОСТ 12787-81 [160] и ГОСТ 28851-90 [161]. 2.3.1 Методика определения фенольных соединений в вине Методика основана на взаимодействии фенольных соединений с реактивом Фолина - Чиокальтеу, при котором происходит окисление фенольных групп вина и восстановление реактива до смеси окислов, окрашенных в голубой цвет. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию фенольных веществ [27]. При определении используют реактив Фолина - Чиокальтеу торговой марки или приготовленный по следующей методике: 100 г фосфовольфрамата натрия и 25 мг молибдата натрия растворяют в 700 см бидистиллированной воды, добавляют 50 см3 85% -ной фосфорной кислоты, 100 см3 концентрированной соляной кислоты. Раствор кипятят в перегонной колбе с обратным холодильником в течение 10 ч, затем добавляют 150 г сульфата лития, несколько капель брома и снова кипятят в течение 15 мин. Охлаждают и объем доводят водой до 1 дм . При определении содержания фенольных соединений в красных винах в колбу вместимостью 100 см помещали 1 см вина, предварительно разведенного в 5 раз водой, 1 см3 реактива Фолина - Чиокальтеу и 10 см3 20%-ного раствора Na2C03- Объем доводили до метки бидистиллированной водой и через 30 мин измеряли оптическую плотность раствора в кювете 10 мм при % = 630 нм. Раствор сравнения готовили так же, заменив 1 см3 вина таким же количеством воды. Анализ образцов белых вин проводили без предварительного разбавления. Для построения калибровочной кривой 1,0; 2,0; 5,0; 10,0 и 20,0 см3 стандартного раствора танина помещали в мерные колбы на 100 см, добавляли по 1 см реактива Фолина — Чиокальтеу и 10 см 20%-ного раствора Na2C03. Объем содержимого колб доводили бидистиллированной водой до метки. Через 30 мин измеряли оптическую плотность, как указано выше. Уравнение регрессии получали, обрабатывая полученные данные методом наименьших квадратов. 2.3.2 Методика определения цветовых характеристик вина Под цветовыми характеристиками вина понимают его яркость и цветность.
Яркость соответствует его прозрачности. Она изменяется обратно пропорционально интенсивности окраски вина. Цветность соответствует доминирующей длине волны (которая характеризует оттенок) и чистоте. Условно цветовые характеристики красных и розовых вин определяют спектрофотометрическим методом по интенсивности окраски и по оттенку, согласно которому они имеют условное выражение (общепринятый метод) [27]. Интенсивность определяли как сумму величин поглощающей способности при толщине кюветы 10 мм при излучении волн длиной 420, 520 и 620 нм: - = А20 + 520 + 620 Оттенок определяли как отношение поглощающей способности при 420 нм к поглощающей способности при 520 нм: Л 520 2.3.3 Методика определения ванадатной окисляемости Приготовление 0,1 Мраствора соли Мора. Взвешивали 32,214 г соли Мора, переносили в колбу вместимостью 1000 см , растворяли в 500 см раствора серной кислоты, разбавленной 1 : 10, и доводили объем до метки дистиллированной водой. Приготовление 0,01Мраствора аммония ванадиевокислого. Навеску 1,1698 г аммония ванадиевокислого помещали в колбу вместимостью 1000 см , растворяли в 100 см раствора серной кислоты, разбавленной 1:1, и доводили объем до метки дистиллированной водой. Приготовление 0,2 % раствора фенилантраниловой кислоты. Навеску 20 г фенилантраниловой кислоты помещали в колбу вместимостью 100 см и растворяли в 0,2 % растворе карбоната натрия. Определение ванадатной окисляемости [150]. В коническую колбу вместимостью 250 см с обратным холодильником помещали 100 см раствора аммония ванадиевокислого с концентрацией 0,01 М, добавляли 5 см концентрированной серной кислоты и п см разбавленного образца (2 см3 бидистиллированной воды для холостого опыта), выдерживали на кипящей водяной бане 30 мин. Раствор охлаждали, добавляли несколько капель фенилантраниловой кислоты и титровали ОДМ раствором соли Мор до перехода окраски от бордовой к ярко-зеленой. Ванадатную окисляемость (X) в мМ/г рассчитывали по формуле: Анализ литературных данных показал, что существующие в настоящее время методы определения антиоксидантной активности в большинстве случаев основаны на способности антиоксидантов взаимодействовать со свободными радикалами.
Для оценки антиоксидантной активности индивидуальных веществ и реальных объектов обычно используют радикалы, образующиеся в процессе окисления липидсодержащих субстратов, таких как линолевая кислота, метиллинолеат, растительные масла, липопротеины низкой плотности (радикалы RO", ROO"), либо генерируемые в различных системах (Fe(III) - Н2О2, гипоксантин - ксантин оксидаза, пероксидаза хрена - Н202) радикалы ОН , О "г. Методы, основанные на ингибировании антиоксидантами окисления липидов, дают более достоверные результаты, поскольку характеризуют способность исследуемого объекта подавлять свободно-радикальные окислительные процессы в организме. Однако данные методы являются длительными и трудоемкими, а полученные результаты плохо воспроизводимы и зависят от многих параметров: природы окисляемого субстрата, концентрации инициатора, начальной скорости окисления. Антиоксидантное действие большинства биологически активных соединений связано с их способностью легко окисляться, отдавая электрон или атом водорода, что положено в основу определения индивидуальных восстановителей по их воздействию на окислительно-восстановительную систему, содержащую комплексные соединения ионов переходных металлов: Fe(III) - пиридин-2,6 дикарбоновая кислота [140], Fe(III) - 2,2 дипиридил [141,142], Cu(II) - неокупроин [143], Ru - 2,2 дипиридил [144]. Введение в окислительно-восстановительную систему Fe(III)/Fe(II) органического лиганда - офенантролина увеличивает величину стандартного редокс-потенциала полуреакции [Fe(Phen)3]+3 + 8 [Fe(Phen)3] до Е = 1,10 В, расширяя круг определяемых веществ. Следует также отметить, что способность органического лиганда образовывать с восстановленной формой железа устойчивый в широком диапазоне рН (2 - 9) окрашенный хелат со значительным молярным коэффициентом поглощения (є = 11100) создает условия для высокочувствительного и селективного определения [162]. Это позволило рекомендовать окислительно-восстановительную систему Ре(Ш)/Ре(П)-о-фенантролин в качестве индикаторной, при разработке спектрофотометрического способа определения антиоксидантной способности растительного сырья и продуктов на его основе. 2.4.2 Оптимизация состава комплексного реагента Fe(III)—о-фенантролин Окислительно-восстановительная способность выбранной индикаторной системы и чувствительность определения зависят от количества и соотношения Fe(III) и офенантролина, которые целесообразно вводить в реакцию совместно в виде комплексного реагента, что делает необходимым проведение оптимизации состава комплексного реагента. Для оптимизации состава комплексного реагента Fe(IH)-o фенантролин использовали метод «Латинского квадрата», относящийся к многофакторному планированию эксперимента и предусматривающий изменение в каждом опыте всех изучаемых факторов в соответствии с программой эксперимента.
Метрологическая аттестация методик определения антиоксидантнои активности вина, пива и растительного сырья
Метрологическую аттестацию методик выполнения измерений суммарной антиоксидантной активности красных сухих вин, пива и растительного сырья проводили с целью установления значений характеристик погрешности измерений в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725 [166 - 169] и МИ 2336 - 2002 [170] методом добавки с использованием реальных образцов. Характеристики погрешности измерений, установленные при метрологической аттестации, представляют собой гарантируемые значения характеристик погрешности для измерений, выполняемых при всех допускаемых вариациях уровней влияющих факторов пробы и методики, и характеризуют точность любого из результатов измерений, которые могут быть получены по данной методике при ее строгом соблюдении. В ходе метрологической аттестации по результатам экспериментальных данных были оценены следующие метрологические характеристики: - показатель повторяемости (СКО повторяемости), Р = 0,95; - показатель воспроизводимости (СКО воспроизводимости), Р = 0,95; - показатель точности (границы, в которых находится погрешность f методики), Р = 0,95; - предел повторяемости (для двух результатов параллельных определений), Р = 0,95; - предел воспроизводимости (для двух результатов измерений), Р = 0,95. При оценке показателей точности, правильности, прецизионности методик анализа в рамках принятой модели были сделаны следующие допущения: распределения случайной погрешности результата анализа и неисключенной систематической погрешности методики анализа принимают нормальными; влияющие факторы пробы не оказывают значительного влияния на погрешность результата анализа; образцы для оценивания стабильны во время проведения эксперимента; применение метода добавок позволяет провести оценивание мультипликативной (пропорционально изменяющейся) части систематической погрешности методики анализа; образцами для оценивания являются рабочие пробы материала и рабочие пробы материала с известной добавкой; специально приготовленные пробы с известной добавкой однородны, соответствуют составу проб веществ (материалов), погрешность их приготовления не вносит дополнительную систематически значимую погрешность в приписанную характеристику систематической погрешности методики анализа; распределение погрешности аттестованного значения добавки является равномерным. Для оценивания характеристик погрешности результатов измерений суммарной антиоксидантной активности были отобраны пробы, объем (масса) каждой отобранной пробы должен быть не менее 2 L объема (массы), необходимого для получения одного результата измерения содержания определяемого по методике компонента. Каждую исходную пробу делили на две равные части.
Первую часть оставляли без изменения и анализировали в точном соответствии с прописью аттестуемой методики. Во вторую часть пробы вводили добавку вещества-стандарта - аскорбиновой кислоты, составляющую 75 - 125 % от содержания вещества-стандарта в пробе. Полученную таким образом рабочую пробу с добавкой анализировали в точном соответствии с прописью аттестуемой методики. При анализе соблюдали условия внутрилабораторной воспроизводимости: разные операторы, разное время, разные партии реактивов одного типа, разные наборы мерной посуды. Число параллельных определении для получения результата анализа соответствовало установленному в методике и равнялось двум. Метрологическую аттестацию «Методики выполнения измерений суммарной антиоксидантнои активности красных сухих вин» проводили с использованием образца красного сухого вина «Каберне Фанагории» (производитель ОАО АПФ «Фанагория»). Этот образец успешно прошел дегустационную оценку и сертификационные испытания. Экспериментальные данные для оценивания прецизионности методики выполнения измерений суммарной антиоксидантнои активности сухих красных вин приведены в таблице 33. Расширенная обработка результатов измерений суммарной антиоксидантной активности красных сухих вин и растительного сырья была проведена в аккредитованной метрологической службе НИЛ Микропримесей Томского политехнического университета. Свидетельства о метрологической аттестации и прописи стандартов организации представлены в Приложении. 2.7 Влияние экологической ситуации территории на величину антиоксидантной активности растительных материалов Одним из подходов оценки состояния окружающей среды является реакция растений на различные виды загрязнений. Содержание биологически активных веществ, а, следовательно, и антиоксидантные свойства растений зависят, прежде всего, от видовой принадлежности, а также места произрастания, климатических условий, геохимического состояния почвы, времени вегетации и других экологических факторов. Для установления влияния неблагоприятных факторов окружающей среды на характер изменения суммарных показателей тест-растений и доказательства возможности их использования в целях экологического мониторинга был разработан алгоритм (рис.7), включающий обоснование выбора необходимых физико-химических показателей, которые могут влиять на изучаемые параметры объектов исследования; методы и методики анализа; программу отбора проб, ориентированную как на отношение к источнику загрязнения, так и учитывающую период вегетации выбранного тест-растения; обработку и обобщение результатов.
Предварительное определение величины АОА растительных материалов: коры дуба, зверобоя, эхинацеи пурпурной, крапивы двудомной и др. (таблица 23) позволило выбрать в качестве тест-растения крапиву двудомную, так как она обладает достаточно высокой антиоксидантной активностью, а также характеризуется широким ареалом распространения, высокой толерантностью к температуре и количеству осадков, продолжительным вегетационным периодом и развитой поверхностью листа. При выборе необходимых для контроля физико-химических показателей учитывали взаимосвязь величины АОА с содержанием биологически активных веществ, обладающих восстановительными свойствами, таких как дубильные вещества. На содержание последних в растительных материалах может оказывать влияние загрязнение окружающей среды, например, токсичными металлами (Zn, Cd, Pb, Си), которые могут поступать в растения, в первую очередь, из почвы. Исходя их возможных значений выбранных физико-химических показателей, был проведен выбор методик анализа. Для определения тяжелых металлов (Zn, Cd, Pb, Си) - метод инверсионной вольтамперометрии (ИВ), антиоксидантной активности - спектрофотометрический метод, дубильных веществ - титриметрический. . При определении тяжелых металлов в крапиве двудомной пробоподготовку проводили способом «сухой» минерализации в соответствии с ГОСТ 26929-86 «Сырье и продукты пищевые. Подготовка проб. Минерализация для определения содержания токсичных элементов» или «мокрой» минерализацией в автоклавах с СВЧ облучением. Для ИВ анализа почв на соединение тяжелых металлов готовили солянокислую вытяжку, упаривали ее досуха, остаток прокаливали в муфельной печи при температуре 450 ± 10 С. Ориентируясь на источник загрязнения - автомагистраль, отбор проб осуществляли на расстоянии 7 и 200 м от него в разные вегетационные периоды. Исследования, проведенные в период с 2004 по 2006 гг. показали, что содержание Zn и РЬ в пробах крапивы двудомной, отобранных в 7 м от дороги примерно в 2 и 3 раза больше, чем в образцах, отобранных на расстоянии 200 м. Концентрация свинца в образцах, отобранных у дороги, превышает ПДК для пищевых продуктов. В то же время анализ проб почвы показал, что содержание кислотных и подвижных форм свинца, цинка и меди меньше, чем ПДК для их валового содержания, а для кадмия - на уровне фоновых значений для чернозема (таблица 45). Суммарное содержание восстановителей (АОА) и дубильных веществ в образцах крапивы двудомной уменьшается с приближением к источнику загрязнений (таблица 46), что, вероятно, связано с защитной реакцией растения на действие загрязнителя.
