Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Целлюлозосоодержащие материалы (ЦСМ) 9
1.1. Виды и запасы ЦСМ 9
1.2. Состав и структура ЦСМ 10
1.3. Предварительная обработка ЦСМ 13
ГЛАВА 2. Ферментативное разрушение целлюлозосодержащих материалов (ЦСМ) 15
2.1. Современные представления о классификации карбогидраз 15
2.2. Основные ферменты целлюлазного комплекса 15
2.3. Современные представления о механизме действия целлюлазного комплекса 18
2.4. Факторы, влияющие на эффективность ферментативного гидролиза целлюлозы.. 20
2.5. Штамм Penicillium verruculosum и секретируемые им ферменты 22
ГЛАВА 3. Основные подходы для увеличения продуктивности штаммов микроорганизмов 24
3.1. Влияние условий ферментации на эффективность биосинтеза ферментов грибными продуцентами 24
3.2. Получение генетически измененных штаммов P. Verruculosum
3.2.1. Ненаправленный мутагенез 27
3.2.2. Генетическая инженерия 27
Глава 4. Использование карбогидраз в различных биотехноло гических процессах 33
4.1. Использование ферментов в качестве кормовых добавок 33
4.2. Использование ферментов для отбеливания целлюлознобумажной пульпы 33
4.3. Применение ферментов в текстильной промышленности 34
4.3.1. Биоотварка хлопчатобумажных тканей 34
4.3.2 Биодепигментация и биополировка хлопчатобумажных изделий 35
4.4. Применение ферментов в производстве альтернативного топлива 36
Экспериментальная часть 38
Глава 5. Объекты исследования и методы экспериментов 38
5.1. Исходный штамм-продуцент 38
5.2. Использованные вещества 38
5.2.1. Ферментные препараты 38
5.2.2. Субстраты и реактивы 38
5.2.3. Состав питательных сред 39
5.3. Методы 40
5.3.1. Мутагенез и селекция штаммов 40
5.3.2. Метод получения протопластов 41
5.3.3. CaCh/PEG трансформационный метод 41
5.3.4. Культивирование гриба P. verruculosum в колбах 42
5.3.5. Культивирование гриба P. verruculosum в ферментерах 42
5.3.6. Метод определения Сахаров 44
5.3.7. Метод определения концентрации белка 44
5.3.8. Методы определения активности ферментов 44
5.3.9. Определение гидролитической способности ферментных препаратов 44
5.3.10. Оценка "кормовой" эффективности ферментов 45
Результаты и их обсуждение 46
ГЛАВА 6. Получение рекомбинантных штаммов - продуцентов целевых ферментов 46
6.1. Получение маркерного штамма-реципиента для последующей трансформации целевыми генами р-глюкозидазы ((3Glu) и эндоглюканазы (EGII) 46
6.1.1. Получение споровой суспензии штамма гриба P. verruculosum В221-151 и подготовка к УФ - мутагенезу 46
6.1.2. Проведение УФ - мутагенеза 47
6.1.3. Отбор мутантов на селективной среде с хлоратом натрия 48
6.1.4. Скрининг устойчивых к хлорату натрия niaD мутантов среди колоний штамма Penicillium verruculosum В221-151, тестирование их по способности усваивать различные источники азота 48
6.1.5. Отбор истинных niaD мутантов 50
6.2. Трансформация штамма-реципиента P. verruculosum В 537 51
6.2.1. Первичный скрининг и анализ трансформантов, содержащих
гомологичный ген эндоглюканазы II P. verruculosum 52
ГЛАВА 7. Оптимизация условий глубинного культивирования рекомбинантных штаммов-продуцентов р-глюкозидазы и эндоглюканазы ii в 1-литровом ферментере 56
7.1. Культивирование рекомбинантных штаммов-продуцентов ЭГП в 1-литровых ферментерах 56
7.1.1. Оптимизация процесса подачи подпитывающего раствора при культивировании штамма P. verruculosum ЭГИ-40 57
7.1.2. Влияние температуры и рН ферментационной среды на биосинтез ферментов штаммом P. verruculosum ЭГП-40 59
7.1.3. Оптимизация состава питательной среды при культивировании штамма P. verruculosum ЭГП-40 60
7.2. Культивирование рекомбинантных штаммов-продуцентов (3-глюкозид азы в 1-литровых ферментерах 61
7.2.1. Оптимизация процесса подачи подпитывающего раствора при культивировании штамма P. verruculosum F10 63
7.2.2. Влияние температуры и рН ферментационной среды на биосинтез ферментов штаммом P. verruculosum F10 66
7.2.3. Оптимизация состава питательной среды при культивировании штамма P. verruculosum F10 67
7.3. Совместное культивирование рекомбинантных штаммов P. verruculosum ЭГП-40 и F10 с исходным штаммом P. verruculosum В537 68
7.3.1. Совместное культивирование штаммов P. verruculosum В537 и F10 69
7.3.2. Совместное культивирование штамма P. verruculosum В537 и ЭГ Н-44 71
ГЛАВА 8. Индукция целлюлаз штамма P. Verruculosum ЭГП-40 различными дисахаридами 74
8.1. Получение смеси продуктов реакции поликонденсации с помощью ферментных препаратов P. verruculosum В537 и F10 74
8.2. Полная или частичная замена МКЦ на смесь Сахаров при культивировании штамма P. verruculosum ЭГП-40 в колбах 77
8.3. Исследование влияния различных дисахаридов на биосинтез целлюлаз штаммом
P. verruculosum ЭГП-40 при культивирования в колбах 79
8.4. Полная или частичная замена МКЦ на смесь Сахаров при культивировании
штамма P. verruculosum ЭГП-40 в 1 -литровых ферментерах 80
ГЛАВА 9. Культивирование трансформанта P. Verruculosum ЭГП-40 на различных целлюлозосодержащих субстратах 82
9.1. Исследование возможности полной замены МКЦ на альтернативные
целлюлозосодержащие субстраты при культивировании рекомбинантного штамма
ЭГП-40 82
ГЛАВА 10. Исследование гидролитической способности ферментных препаратов, полученных с помощью рекомбинантных штаммов p. verruculosum, по отношению к различным видам ЦСМ 87
10.1. Результаты гидролиза измельченной осиновой древесины 87
10.2. Результаты гидролиза измельченной обессмоленной сосновой древесины 93
10.3. Результаты гидролиза измельченной багассы 98
ГЛАВА 11. Исследование способности полученых ферментных препаратов к увеличению питательной ценности кормов животных и птиц 104
11.1. In vitro "кормовые" испытания препаратов ЭГП-40 и ЭГП-34 на различных типах кормов 104
Выводы 108
Список литературы
- Состав и структура ЦСМ
- Современные представления о механизме действия целлюлазного комплекса
- Получение генетически измененных штаммов P. Verruculosum
- Биоотварка хлопчатобумажных тканей
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Микробная деградация целлюлозы и гемицеллюлозы, являющихся самыми распространенными биополимерами на Земле, в настоящее время предоставляет растущему человечеству способы решения экологических проблем, освоения новых источников сырья, энергии и пищи. Природная древесина, отходы ее переработки, отходы целлюлозно-бумажного и пергаментного производств являются дешевым и возобновляемым сырьем для получения моно- и олигосахаридов, спиртов, а также промышленных ферментов, в частности, карбогидраз (Berlin, Gilkes, 2005).
Основными продуцентами промышленных карбогидраз являются мицелиальные грибы рода Trichoderma, обладающие высокой секреторной способностью (Godfrey, West, 1996). Однако грибы рода Penicillium также по праву занимают одно из главных мест в списке промышленно важных продуцентов, поскольку способны синтезировать ферментные комплексы целлюлаз и гемицеллюлаз (эндоглюканаз, целлобиогидролаз, ксиланаз и P- глюкозидаз) более сбалансированного состава, чем у Trichoderma, и эффективнее расщеплять целлюлозные субстраты; кроме того, индивидуальные ферменты обладают более высокой удельной активностью и операционной стабильностью (Кастельянос, 1995).
Одним из важнейших факторов рентабельности процессов биоконверсии лигноцеллюлозных материалов, наряду со стоимостью самого сырья, является эффективность гидролитического действия целлюлазных полиферментных комплексов, которая, в свою очередь, определяется как свойствами индивидуальных ферментов, так и их взаимодействием в составе этого комплекса, а также стоимость ферментационного процесса. С целью снижения затрат на получение конечного продукта (целлюлазного ферментного препарата) в лаборатории биосинтеза ферментов ИБФМ РАН вот уже более 15 лет активно ведется работа по созданию новых штаммов - суперпродуцентов внеклеточных карбогидраз в том числе и с помощью методов генетической инженерии, а также проводится оптимизация ферментационных сред и условий культивирования. На сегодняшний день наиболее известными и широко используемыми являются высокопродуктивный мутант P.verruculosum В221-151 и рекомбинантный штамм, полученный на его основе, P.verruculosum F10 - продуцент гетерологичной Р-глюкозидазы из A.niger. Были предприняты попытки клонирования и экспрессии самых разных генов целевых ферментов, наиболее успешными из которых оказались в отношении гомологичной эндо-Р-1,4-глюканазы II (ЭГ36П) P.verru^losum - одного из ключевых компонентов мультиферментного комплекса, продуцируемого этим грибом.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение особенностей биосинтеза внеклеточных карбогидраз как новыми, так и ранее полученными рекомбинантными штаммами, созданными на основе мицелиального гриба P.verruculosum. В соответствии с этой целью были сформулированы следующие задачи:
Создать на основе штамма P. verruculosum В1 -221-151 новый рекомбинантный штамм- продуцент с повышенным уровнем экспрессии гомологичной эндоглюканазы II.
Оптимизировать условия культивирования и состав питательной среды для нового рекомбинантного штамма-продуцента ЭГП P. .verruculosum ЭГП-40 и ранее полученного рекомбинантного штамма-продуцента Р-глюкозидазы (БГЛ) P.verruculosum F10.
Исследовать индуцирующее действие продуктов реакции поликонденсации глюкозы (целлобиозы, гентиобиозы, софорозы) на биосинтез целлюлаз новым рекомбинантным штаммом P.verruculosum ЭГП-40.
Исследовать биосинтез целлюлаз штаммом P.verruculosum ЭГП-40 при культивировании на различных целлюлозосодержащих материалах (ЦСМ).
Исследовать гидролитическую способность ферментных препаратов, полученных с помощью рекомбинантных штаммов P. verruculosum - продуцентов ЭГП.
Исследовать способность ферментных препаратов, полученных с помощью рекомбинантных штаммов P.verruculosum - продуцентов ЭГП, к увеличению питательной ценности кормов.
Научная новизна работы. Впервые созданы рекомбинантные штаммы-продуценты эндоглюканазы II P.verruculosum ЭГП-40 и ЭГП-34 на основе штамма-реципиента P.verruculosum В537 с помощью новой плазмидной конструкции, содержащей соответствующий ген целевого фермента под контролем собственного индуцибельного промотера cbhI гена мажорного секреторного белка целлобиогидролазы I (ЦБП). В ходе оптимизации условий культивирования в 1-литровых ферментерах трансформантов P.verruculosum ЭГП-40 и F10 впервые установлено, что рН-оптимумы синтеза целевых ферментов находятся в интервале значений 4,5-5,5, температурный оптимум - 32С, оптимальным способом подачи подпитывающего раствора является дробный способ. Впервые установлено, что 2% МКЦ в составе исходной питательной среды достаточно для обеспечения высоко уровня синтеза основных ферментов трансформантами P.verruculosum ЭГП-40 и F10. Впервые исследовано индуцирующее влияние различных дисахаридов (целлобиозы, софорозы, гентиобиозы) на биосинтез внеклеточных карбогидраз рекомбинантным штаммом P.verruculosum ЭГП-40 и установлено, что наиболее сильным индуктором целевых ферментов является гентиобиоза. Впервые показана возможность полной замены дорогостоящей микрокристаллической целлюлозы (МКЦ) в составе ферментационной среды на пергамент при культивировании штамма P.verruculosum ЭГП-40 в 1-литровых ферментерах. На основе штаммов P.verruculosum ЭГП-40 и ЭГП-34 впервые получены новые ферментные препараты, обладающие повышенной гидролитической способностью по отношению к различным природным целлюлозным субстратам, а также некрахмальным полисахаридам сельскохозяйственных кормов по сравнению с коммерческими аналогами.
Практическая значимость работы. В ходе проведенных исследований удалось снизить количество основного дорогостоящего компонента питательной среды (МКЦ) с 6 до 2% без существенных потерь в активностях ферментов при культивировании рекомбинантных штаммов P.verruculosum ЭГП-40 и F10, что позволит значительно уменьшить стоимость получаемых ферментных препаратов. Выявлена возможность замены дорогостоящей МКЦ в составе исходной ферментационной среды для P.verruculosum ЭГП-40 на более дешевый целлюлозосодержащий субстрат (пергамент). Показана возможность частичной замены МКЦ в составе исходной питательной среды на смесь дисахаридов, что также может привести к положительному экономическому эффекту. Применение нового ферментного препарата ЭГП- 40 при гидролизе различных видов ЦСМ (измельченной осиновой древесины, измельченной сосновой древесины, измельченной багассы) позволяет увеличить выход сбраживаемых сахаров на 10-15% по сравнению с существующими лабораторными и коммерческими ферментными препаратами. Показана более высокая эффективность действия нового ферментного препарата ЭГП-40 на некрахмальные полисахариды кормов по сравнению с коммерческими аналогами, что, вероятно, позволит значительно снизить дозировки добавляемого на практике ферментного препарата.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на школах- конференциях молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2009, 2010 гг.); на международных конференциях: «BIOCATALYSIS 2007, 2009: Fundamental&Applications» (Санкт-Петербург 2007, Архангельск 2009), московской международной научно-практической конференции «БИОТЕХНОЛОГИЯ: экология крупных городов» (Москва 2010), втором международном конгресс-партнеринге и выставке по биотехнологии, биоэнергетике и биоэкономике «EURASIABIO» (Москва 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе, 3 статей в журналах из списка ВАК и 7 тезисов.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 119 страницах, иллюстрирована 16 таблицами и 54 рисунками. Библиографический указатель содержит 211 источников литературы.
Состав и структура ЦСМ
Другими основными составляющими растительных тканей, заполняющими пространства между микрофибриллами целлюлозы, являются гемицеллюлозы, пектины и лигнин [14, 15]. В зависимости от источника (и способов вьщеления), молекулы гемицеллюлоз могут иметь как линейную, так и разветвленную структуру [16, 17]. Большинство изученных гемицеллюлоз являются гетерополисахаридами. В состав звеньев основной цепи полимерных молекул могут быть включены: D-ксилоза, D-манноза, D-галактоза, D-глюкоза, D-глюкуроновая кислота, D-4-О-метилглюкуроновая кислота, L-арабиноза, а также присоединенные через сложноэфирные связи остатки уксусной, феруловой и кумаровой кислот [18].
Гемицеллюлозы осуществляют взаимосвязь основных компонентов клеточной стенки за счет формирования промежуточного слоя между ними. В первичной клеточной стенке они объединяют пектин и целлюлозу, во вторичной - целлюлозу и лигнин. Присоединение лигнина осуществляется для большинства растений посредством образования диферуловых (дикумаровых) мостиков между ксиланом и лигнином. СП гемицеллюлоз значительно меньше, чем у целлюлозы и варьирует от 50 до 200 [17].
Арабиноглюкуроноксилан (арабиноксилан) - гетерополисахарид, составляющий 7-8% от сухой массы мягкой (хвойной) древесины. Основная цепь его состоит из 1,4-P-D-ксилопиранозных звеньев, а боковые группы представляют собой 4-0-метил-В-глюкуроновую кислоту (а-1,2-связь, 20%) и L-арабинофуранозу (а-1,2-связь и а-1,3-связь 10-15%) [17, 19].
Ацетилглюкуроноксилан (глюкуроноксилан) - основной ксилан твердых (лиственных) пород деревьев. Содержание его варьирует от 13 до 30% от сухой массы древесины. В основной цепи глюкуроноксилан содержит D-ксилопиранозные остатки, соединенные Р-1,4 связями. В среднем к каждому десятому ксилозному звену в качестве боковой группы присоединена а-1,2-связью молекула 4-0-метил-0-глюкуроновой кислоты. СП глюкуроноксиланов твердых пород деревьев составляет 100-200 [17]. Галактоглюкоманнан - преобладающий компонент гемицеллюлоз мягких (хвойных) пород деревьев. Основная цепь галактоглюкоманнана сформирована Р-1,4 связанными остатками D-маннопиранозы и D-глюкопиранозы, а боковые цепи -остатками D-галактозы, соединенные с основной цепью а-1,6-связями [17].
Глюкоманнан, составляющий 2-5% от сухой массы твердой древесины - это сополимер, Р-1,4 связанных D-маннопиранозных и D-глюкопиранозных остатков [17].
Арабиногалактаны входят в качестве компонентов гемицеллюлозы деревьев лиственных пород, а также в состав пектинов растений. Основная цепь арабиногалактанов построена из чередующихся звеньев галактозных и арабинозных олигомеров. Боковые цепи, образованные галактозой и арабинозой, присоединены к гликопротеинам клеточной стенки через серии и гидроксипролин.
Ксилоглюканы служат связующим звеном между целлюлозой и другими полисахаридами в первичной клеточной стенке, а также в семенах однодольных и двудольных растений. Основная цепь ксилоглюкана построена из 3-1,4-связанных D-глюкопиранозных остатков, к которым присоединена (а-1,6-связью) D-ксилопираноза или О-ксилопиранозил-Р-О-1,2-галактоза [17].
Пектины входят в состав многих растительных тканей. Они выполняют важную функцию: регулируют водный обмен, являясь промежуточным звеном в поглощении и транспорте ионов. Под термином пектины подразумевают группу полисахаридов, общим признаком которых является наличие неразветвленных блоков а-1,4-связанных остатков D-галактоуроновой кислоты или ее метилового эфира.
Изучение пектинов из разных растительных источников показало, что молекулы пектина имеют основную цепь, состоящую из остатков а-1,4-галактуроновой кислоты с вставками 1,2-связанных остатков L-рамнопиранозы [20]. Доля остатков рамнозы обычно составляет 1-4%. Боковые цепи пектина преимущественно представлены остатками D-галактозы, L-арабинозы, D-ксилозы. Редко встречаются остатки D-глюкозы, D-маннозы, L-фукозы, D-глюкуроновой кислоты [19].
Лигнин является одним из важнейших компонентов растительной биомассы, по распространенности на земной поверхности уступая только целлюлозе. Это материал сложного состава с трехмерной структурой и молекулярной массой от нескольких сотен до миллиона [21]. Лигнин представляет собой нерегулярный полимер с разветвленными макромолекулами, построенными в основном из замещенных фенилпропановых звеньев. Основными мономерными звеньями являются 4-оксикоричный (л-кумаровый), З-метокси-4 оксикоричный (конифериловый) и 5-метокси-4-оксикоричный (синаповый) спирты (рис.1), которые соединяются углерод-углеродными и простыми эфирными связями [22]. НО-(0}-СН=СН-СН2 -ОН п-Кумаровый спирт
Как известно, реакционная способность природных целлюлозосодержащих материалов невелика, что приводит к задержке начального роста гриба при культивировании на целлюлозосодержащих субстратах, а также снижению эффективности ферментативного гидролиза ЦСМ. Следовательно, для решения этой проблемы необходимо проведение предварительной обработки, направленной на разрушение кристаллической структуры целлюлозы и удаление лигнина.
Способы предобработки подразделяются на биологические, механические, физические и химические [14]. Биологические способы подразумевают расщепление лигнина с помощью микроорганизмов, способных избирательно по отношению к целлюлозе утилизировать лигнин, используя его в качестве источника углерода [23]. Частичный гидролиз ЦСМ, не вызывающий их глубокой деструкции, с помощью целлюлазных ферментных препаратов также можно отнести к биологическим способам предобработки. К механическим способам относятся различные виды измельчения материалов на различных видах мельниц (шаровые, коллоидные, вибромельницы), дезинтеграторах, дробилках и т.д. [24-27]. К физическим методам относятся: облучение у-лучами, обработка микроволновым излучением и паровой (газовый) взрыв. В последнем случае ЦСМ (древесину) подвергают кратковременному воздействию перегретого пара под давлением (несколько секунд; 240-300С; 3,5-7,5 МПа) в присутствии или без SO2. Далее давление сбрасывают, что вызывает паровой взрыв ЦСМ. При таких условиях лигнин плавится, частично разрушается и выходит из структуры целлюлозы, кроме того, происходит частичная дезинтеграция целлюлозы и частичный гидролиз гемицеллюлоз [26-28]. Химические методы более разнообразны и многочисленны. Они основаны на обработке ЦСМ различными органическими реагентами. Для примера можно привести делигнификацию разбавленными растворами щелочи или аммиака при кипячении или автоклавировании, сульфатную или сульфитную варку [27, 29, 30, 31, 32], разбавленными растворами неорганических кислот [33], а также экстракцию лигнина водным раствором этанола или бутанола [14, 34, 35].
Каждый из методов предобработки имеет свои недостатки. Основным из них является высокая стоимость в силу их материало- и энергоемкости, необходимость использовать специальное оборудование, нейтрализовать и регенерировать реагенты и т.д.
Современные представления о механизме действия целлюлазного Комплекса
К факторам, влияющим на эффективность гидролиза, относятся следующие: качественный и количественный состав целлюлазного комплекса, ингибирование продуктами гидролиза, инактивация целлюлолитических ферментов, изменение реакционной способности субстрата в ходе гидролиза. Часто эти факторы взаимосвязаны, а их роли в процессе трудно разделимы [58,96-98].
Качественный и количественный состав целлюлазного комплекса. Эффективностьгидролиза целлюлозы во многом зависит от сбалансированности состава целлюлазного комплекса, а также активности отдельных компонентов. По мнению авторов [90,99] одним из основных требований к составу целлюлазного комплекса заключается в том, чтобы он имел высокую эндоглюканазную и целлобиогидролазную активности. Кроме того, необходима достаточно высокая целлобиазная активность [97]. Состав целлюлазных комплексов в зависимости от происхождения и видов продуцентов довольно разнообразен [97,100], однако лишь некоторые из описанных в литературе комплексов можно рассматривать как реальных кандидатов на осуществление эффективного гидролиза целлюлозы [101,102].
Ингибирование продуктами реакции. Ферменты целлюлазного комплекса подвержены в той или иной степени ингибирующему воздействию продуктов - глюкозы и/или целлобиозы [102,103]. Гидролиз целлюлозы сильно замедляется или прекращается вообще, если концентрация продуктов в реакционной среде достигает значений 3-10% [103]. Ингибирование можно отнести к одному из важнейших негативных факторов, влияющих на эффективность ферментативного гидролиза целлюлозы.
Условия гидролиза. К факторам, отражающим условия проведения гидролиза, относятся концентрация субстрата, рН, температура, ионная сила, перемешивание. Из значений констант Михаэлиса для целлюлолитических ферментов, которые обычно находятся в районе 10-30 г/л [104], следует, что насыщающая концентрация целлюлозы в реакционной смеси составляет 40-100 г/л. рН-оптимум большинства грибных целлюлаз находится в области рН 4-5,5 [97]. При этом ферменты сохраняют стабильность в более широком диапазоне рН. Например, ферменты A. niger стабильны при 25С в интервале рН 1-9. Ионная сила мало влияет на эффективность ферментативного гидролиза в реакторе периодического перемешивания (без отвода продуктов), однако может оказать заметное влияние в проточном реакторе, поскольку известно, что понижение ионной силы буфера способствует десорбции целлюлаз с поверхности и их транспорту из реактора. Между тем, высокая ионная сила понижает активность ферментного комплекса.
Инактивация ферментов. Процесс гидролиза ЦСМ обычно проводят при температуре 45-50С [104,105]. При длительном проведении реакции в таких условиях происходит постепенная термоинактивация целлюлолитических ферментов. Наиболее стабильной, как правило, является эндоглюканаза. Целлобиогидролаза и целлобиаза уступают ей в стабильности. При 65С время полуинактивации наиболее широко используемых целлюлаз Trichoderma и Aspergillius варьирует от нескольких минут до нескольких часов [106].
Инактивация целлюлаз может происходить на поверхности раздела фаз расвор-воздух при интенсивном перемешивании среды. Это явление особенно заметно проявляется у очищенных ферментов [107]. В таком случае для увеличения стабильности целлюлаз в растворе при перемешивании добавляют поверхностно- активные вещества (поливинилпирролидон, Triton Х-100, зонил), белки (лизоцим, бычий сывороточный альбумин), декстраны, полиэтилен- и полипропиленгликоли [107].
Изменение реакционной способности субстрата. Уменьшение реакционной способности целлюлозы обусловлено изменением ее физико-химических и структурных параметров в процессе гидролиза [103]. В начальный момент гидролизуются аморфные участки, о чем свидетельствует некоторое увеличение индекса кристалличности (ИК) на начальных стадиях гидролиза (до глубины гидролиза 30-40%), причем для более кристаллической целлюлозы эффект увеличения ИК менее заметен [108]. С увеличение глубины гидролиза увеличивается относительное содержание высокоупорядоченных участков целлюлозы, которые гораздо медленнее расщепляются ферментами [103,109].
Изменение реакционной способности субстрата в значительной степени зависит от содержания в ней негидролизуемых примесей. В состав целлюлозных материалов, потенциально пригодных для ферментативного получения глюкозы, входит лигнин. Присутствие последнего оказывает негативное влияние на эффективность гидролиза [105,106,107]. Во-первых, лигнин затрудняет доступ целлюлолитических ферментов к поверхности целлюлозы, т.е. оказывает экранирующее действие. Во-вторых, лигнин способен адсорбировать целлюлолитические ферменты, таким образом, выводя их из реакции [103,110]. В-третьих, в результате контакта с лигнином целлюлазы могут необратимо инактивироваться. Так как по мере гидролиза целлюлозы в лигноцеллюлозных материалах относительное содержание лигнина увеличивается, его отрицательное воздействие на эффективность гидролиза становится более выраженным.
Образование целлюлаз в полученных штаммах индуцибельно и подвержено катаболитной репрессии. Однако особенность полученных мутантов P. verruculosum заключается в редуцированной репрессии катаболизма. Целенаправленные изменения рН в процессе ферментации позволяют влиять на состав целлюлазного комплекса. Некоторые побочные активности, как например, ксиланазная, амилазная и целлобиазная становятся выше при более высоких значениях рН [111]. Следует отметить, что получение перспективных штаммов с устойчивой способностью к сверхсинтезу необходимых ферментов является весьма непростой задачей, так как многие мутантные штаммы со временем теряют свои способности к сверхсинтезу тех или иных ферментов, поэтому для поддержания штаммов в активном состоянии требуется поддерживающая селекция. Например, в результате ненаправленного мутагенеза дикого штамма Т. viride QM (в последствии переименнованного в Т. reesei) был получен устойчивый сверхпродуцент целлюлаз - штамм RUT С-30. Он был отобран в результате скриннинга 800 тыс. мутантных колоний [112].
Основные целлюлолитические ферменты P. verruculosum частично описаны в работах [3,49-53]. В результате разделения комплекса P. verruculosum было получено около 17 ферментов. Молекулярные массы изменялись в широком диапазоне: от 19100 до 114800 Да. Практически все выделенные ферменты были гликопротеинами, содержание углеводов в которых изменялось от 4,13 до 48,3 %. Изоэлектрические точки изменялись в диапазоне от 2 до 5,8. Значения рН-оптимумов действия находились в узком диапазоне 4-5,5, температурные оптимумы варьировали в более широком диапазоне 50-80С.
По данным работы [111] выявлены прочносорбирующиеся на целлюлозе ксиланазы III и IV (Ксил III, Ксил IV), также установлено, что основным тополитическим ферментом комплекса является эндоглюканаза V (ЭГ V). С помощью ограниченного протеолиза папаином доказано наличие бифункциональной организации в структуре Ксил III, выделены каталитические и адсорбционные домены. Для ЭГ V расшифрована первичная последовательность и предложена модель ее вторичной и третичной структуры.
В работе [113] изучен процесс трансгликозилирования под действием целлобиазы и установлено, что константа скорости трансгликозилирования почти в 600 раз превышает константу скорости гидролиза целлобиозы.
В работе [114] с помощью современных высокоэффективных методов хроматографии были выделены и охарактеризованы четыре целлобиогидролазы, четыре эндоглюканазы, две ксилоглюканазы, 3-глюкозидаза, ксиланаза, а-галактозидаза и глюкоамилаза. Было показано, что Р-глюкозидаза играет ключевую роль в процессах биоконверсии целлюлозных материалов. Кроме того, было установлено, что ферментные препараты, полученные на основе нового мутантного штамма P. verruculosum В221-151, по сравнению с исходным штаммом P. verruculosum В1 содержат более «разнообразный» комплекс ферментов.
Получение генетически измененных штаммов P. Verruculosum
Природные (дикие) штаммы вырабатывают ограниченное количество ферментов (необходимое для обеспечения пищевых потребностей микроорганизма). Уровень секреции ферментов природными штаммами в большинстве случаев слишком низок для того, чтобы использовать их в крупномасштабных биотехнологических процессах. Поэтому их подвергают генетическим изменениям, направленным на увеличение продукции интересующих ферментов. В качестве основных способов улучшения природных штаммов-продуцентов ферментов можно выделить ненаправленный (классический) мутагенез и генетическую инженерию [141,142].
Ненаправленный мутагенез - классический способ увеличения эффективности синтеза ферментов природными микроорганизмами, до сих пор является одним из основных способов улучшения штаммов. Для получения продуцента с высокой продуктивностью по заданному ферменту (или ферментам) его подвергают мутагенезу. Для этого споры микроорганизмов подвергают воздействию мощных мутагенов: химических (нитрозогуанидин, нитрозометилмочевина) или физических (УФ-облучение, у-облучение, облучение ускоренным пучком электронов). В результате такого воздействия выживает очень небольшая часть клеток. Эти клетки имеют нарушения в генетическом аппарате, в них могут быть ослаблены регуляторные механизмы, и поэтому они могут быть основой для получения новых высокопродуктивных штаммов [112]. Получение мутантов с устойчивой способностью к сверхсинтезу необходимых ферментов является непростой задачей, так как многие мутантные штаммы постепенно со временем теряют свои способности к сверхсинтезу тех или иных ферментов, тем не менее, имеется ряд ярких примеров получения штаммов суперпродуцентов. В США на основе дикого штамма Trichoderma viride QM 6а (впоследствии переименован в Trichoderma reesei) было получено несколько устойчивых мутантов, способных к сверхсинтезу целлюлаз.
Использование ненаправленного мутагенеза позволило повысить производительность природных штаммов Trichoderma reesei до экономически оправданного уровня. Существующие на сегодняшний день штаммы Trichoderma reesei (подавляющая часть которых получена при помощи ненаправленного мутагенеза) позволяют получать на выходе из ферментера 30-40 г/л внеклеточных целлюлаз и гемицеллюлаз.
С развитием техники молекулярной генетики и систем переноса генов для микроскопических грибов все большее распространение получил метод генетической инженерии улучшения штаммов грибных продуцентов. Данный метод позволяет клонировать интересующие (гетерологичные) ферменты из одних микроорганизмов в другие, более быстро растущие, а также мультикопировать собственные (гомологичные) ферменты в микроорганизме.
В целом концепция получения сверхпродуктивных штаммов при помощи генетической инженерии состоит в следующем. На первом этапе создания штамма-продуцента проводится скрининг штаммов с целью выявления микроорганизма, который функционально отвечает требованиям исследователя, т.е. штамм должен секретировать необходимый комплекс ферментов. Далее, штаммы подвергаются мутагенезу (например, с использованием УФ-облучения) для повышения продуктивности, т.е. увеличения выхода секреторного белка [143]. На этой же стадии проводятся селекционные работы для изменения, если требуется, состава секретируемого ферментного комплекса. Следующим .важным этапом является получение штамма-реципиента, способного к акцепции чужеродной ДНК на селективных средах, т.е. штамма, обладающего селективным маркерным признаком - ауксотрофным или доминантным, что приводит к росту такого штамма-реципиента на селективной среде [144]. Затем осуществляется создание экспрессионных конструкций - плазмид, несущих гомологичные или гетерологичные гены тех белков, экспрессию которых предполагается увеличить. Экспрессионные кассеты, т.е. те части плазмид, которые участвуют в интеграции ДНК в хромосому гриба, должны содержать регуляторные элементы (промоторы и терминаторы) генов наиболее хорошо экспрессируемых белков (т.н. «мажорные» белки) для обеспечения гомологичной рекомбинации экспрессионной кассеты и хромосомы гриба. После этого, проводится котрансформация штамма-реципиента плазмидой, несущей ген целевого белка, совместно с трансформирующей плазмидой, несущей маркерный ген. При высевании протопластов на селективные среды, колонии образуют только те протопласты, в хромосому которых встроился маркерный ген. Из литературных данных известно, что соотношение экспресионной плазмиды к трансформирующей должно быть 10:1 [144]. В этом случае частота котрансформаций максимальна. Трансформация проводится различными методами, некоторые из них описаны ниже, наиболее популярным является CaCb/PEG метод.
Системы переноса генов. Для генетических манипуляций в грибах необходимы системы переноса генов, позволяющие ввести экзогенную ДНК. А также системы отбора трансформированных клеток. Такой отбор возможен при ковалентной вставке ДНК в вектор, содержащий селективный маркер. Частоту трансформации и тип трансформантов варьируют, используя различные виды векторов.
Селективные маркеры. Селективный отбор трансформированных клеток происходит по одному из трех типов маркеров, а именно: ген, кодирующий супрессор тРНК, ауксотрофные маркеры и доминантные селективные маркеры.
Статей, в которых описано использование гена супрессора тРНК (su-8) в качестве селективного маркера не так много [145], хотя этот тип маркера потенциально можно использовать для любой грибной ДНК, содержащей мутации в супрессируемых участках терминации.
Наиболее широко в селекции трансформантов используют ауксотрофные маркеры. В табл. 3 приведен обзор используемых ауксотрофных маркеров. Как видно из этой таблицы, для трансформации грибов можно использовать как гомологичные, так и гетерологичные маркеры.
Биоотварка хлопчатобумажных тканей
На данном этапе работы с целью подбора оптимального количества основного углеродного компонента (МКЦ) в составе исходной питательной среды проводили периодическое культивирование в ферментере отобранного рекомбинантного штамма P. verruculosum ЭГП-40. В ходе данного эксперимента были исследованы четыре варианта с различным количеством МКЦ в составе исходной ферментационной среды: 0, 2, 4 и 6% с добавлением или без добавления 3 порций МКЦ в ходе ферментации. Отметим сразу, что дальнейшее повышение количества МКЦ в составе исходной питательной среды ( 6%) приводит к затруднению работы перемешивающего устройства, а также существенному снижению эффективности процесса массообмена, что обусловлено повышенной гигроскопичностью данного субстрата. Длительность культивирования составляла 168 часов. В табл. 11 представлены результаты измерений активностей ферментов и общего содержания внеклеточного белка в пробах слива.
Из полученных данных, видно, что самые высокие значения активностей исследуемых ферментов (КМЦ-азы, ксиланазы, авицелазы и (3-глюкозидазы), а также содержание внеклеточного белка в КЖ, наблюдаются при 6% МКЦ в исходной питательной среде и составляют примерно 1315, 1090, 17 и 71 ед/мл и 37 мг/мл, соответственно.
Отметим, что во всех случаях добавление 3 порций МКЦ в процессе ферментации положительно сказывалось на биосинтезе ферментов. Так, увеличение активности основных исследуемых ферментов в вариантах с питательной средой, содержащей 0, 2, 4 и 6% МКЦ при осуществлении 3 добавок МКЦ, наблюдалось на 5, 16, 24 и 18%, а количество внеклеточного белка в КЖ - на 0, 20, 19 и 20 %, соответственно.
При уменьшении количества МКЦ до 4% в случае без 3 добавок МКЦ наблюдается снижение уровня синтеза общего внеклеточного белка и основных ферментов в среднем на 5-10%. Подобное снижение можно отметить как не очень существенное. Дальнейшее снижение количества МКЦ в исходной среде, если процесс культивирования вести без трех добавок МКЦ, сопровождается сильным снижением уровня синтеза целевых ферментов (примерно на 20 - 65%), что делает это экономически нецелесообразным.
Таким образом, в ходе данного эксперимента показано, что для достижения высокого уровня синтеза целевой Р-глюканазы (КМЦ-азы) достаточно 4% МКЦ в составе исходной питательной среды или 2 % МКЦ, осуществляя 3 добавки МКЦ в процессе ферментации. Снижение стоимости питательной среды при этом по предварительным подсчетам составит примерно 25%.
Было проведено периодическое культивирование Р-глюкозидазных трансформантов, ранее полученных в лаборатории биосинтеза ферментов, на стандартной среде для P. verruculosum (КС-среде) по отработанной ранее ферментационной схеме, т.е. 6 % МКЦ в исходной среде и 3 добавки МКЦ в ходе ферментации, дробная подпитка 50%-ным раствором глюкозы, начиная с 48 часов роста культуры. Условия культивирования: рН среды 5, рОг 30% от насыщения, расход воздуха 0,4 л/мин, начальная скорость перемешивающего устройства 300 об/мин, продолжительность культивирования 168 ч. В ходе ферментации каждые 24 ч отбирали пробы КЖ, в которых измеряли значения активности ферментов и общего количества внеклеточного белка. Значения активностей КМЦ-азы, ксиланазы, Р-глюкозидазы, а также внеклеточного белка в КЖ, измеренные в конце ферментации, представлены на рис. 9.
Рисунок 9. Значения активностей ферментов и внеклеточного белка в КЖ исходного штамма P. verruculosum В537 и трансформантов - продуцентов Р-глюкозидазы при культивировании в 1-литровых ферментерах.
Как видно из полученных данных, у трансформантов первой группы (№ 4, 9, 13, 23) активность целевого фермента (Р-глюкозидазы) увеличена в 3 - 12 раз по сравнению с исходным штаммом, у которого она составила 63 ед/мл. Активности КМЦ-азы и ксиланазы у тарнсформантов при этом снижены в среднем на 12 и 35%, соответственно, относительно контроля (КМЦ-аза - 660 ед/мл, ксиланаза - 875 ед/мл). Общее количество внеклеточного белка в КЖ трансформантов снижено в среднем на 20% относительно контроля (31 мг/мл).
Вторая группа трансформантов (№ 12, 14, 18, 25) характеризуется очень высоким уровнем синтеза р-глюкозидазы на фоне значительного снижения активности других ферментов. Биосинтез продуктов трансформантами данной группы весьма схож между собой, однако, клон № 18 отобран как наиболее перспективный продуцент Р-глюкозидазы, активность которой составила 1261 ед/мл, что, в свою очередь, в 20 раз выше контрольного значения. Активность КМЦ-азы и ксиланазы при этом снижена на 75 и 88%, соответственно, а общее количество внеклеточного белка в КЖ - на 45% относительно контроля.
На электрофореграмме (рис. 10) у рекомбинантного штамма отчетливо видна полоса в районе 120 кДа (отмечена стрелкой), соответствующая Р-глюкозидазе, которая еле заметна у исходного штамма. Другие же белки базового ферментного комплекса еле заметны или практически отсутствуют.
Таким образом, клон № 18 (далее P. verruculosum F10) является наиболее привлекательным с точки зрения биосинтеза монопродукта (Р-глюкозидазы). Поэтому этот штамм был взят в качестве объекта исследования в дальнейших экспериментах по оптимизации питательной среды и условий культивирования.
На данном этапе работы было проведено культивирование штамма P. verruculosum F10 в ферментере с двумя различными способами подачи подпитывающего раствора: 1) дробный способ; 2) по парциальному давлению рОг.
Из полученных данных (рис. 11) можно заключить, что оптимальным способом подачи подпитки является 1 способ, поскольку общее количество внеклеточного белка в КЖ было получено на 5% выше по сравнению со 2 способом. Анализ значений активностей всех исследуемых ферментов также указывает на преимущество 1 способа. Разница в величинах КМЦ-азы, ксиланазы и Р-глюкозидазы при разных способах подачи подпитки составила 7, 13 и 5%, соответственно.
