Содержание к диссертации
Введение
1 АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР 2
1.1 Распространение грибов рода Trichoderma 2
1.2 Физиологические особенности грибов рода Trichoderma 7
1.3 Грибы рода Trichoderma как продуценты ферментов и биологически активных веществ 19
1.4 Получение биопрепаратов на основе грибов рода Trichoderma
и их применение 23
2 МЕТОДИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ 38
2.1 Объекты исследования 38
2.2 Условия культивирования грибов рода Trichoderma на лигноуглеводных субстратах 41
2.3 Методы изучения химического состава субстратов до и после культивирования грибов рода Trichoderma 43
2.4 Методы изучения физиологических потребностей и циклов развития грибов рода Trichoderma 45
2.5 Методы изучения ферментативной активности грибов рода Trichoderma 49
2.6 Методы оптимизации процесса культивирования штамма «МГ-97» Trichoderma asperellum на одубине коры лиственницы сибирской 51
2.7 Методы выделения моноспоровых культур рода Trichoderma и оценки их антагонистической активности 52
2.8 Методика наработки опытной партии биопрепарата 55
2.9 Методы оценки влияния биопрепарата на семена растений и почвенные микроорганизмы 55
3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 61
3.1 Влияние источников питания на интенсивность роста мицелия и спорообразования грибов рода Trichoderma 61
3.2 Онтогенез грибов рода Trichoderma 71
3.3 Влияние вида субстрата и дозы спорового посевного материала на прорастание, интенсивность спорообразования и целлюлолитическую активность грибов рода Trichoderma 77
3.4 Влияние вида субстрата на лигнолитическую активность грибов рода Trichoderma 84
3.5 Биоконверсия лигноуглеводных субстратов грибами рода Trichoderma 91
3.6 Оптимизация процесса культивирования штамма «МГ-97»
Trichoderma aspereUiim на одубине коры лиственницы сибирской 96
3.7 Естественная изменчивость грибов рода Trichoderma и отбор
стабильного моноспорового клона для получения биопрепарата 100
3.8 Влияние биопрепарата на развитие фузариоза сеянцев лиственницы сибирской и биологическую активность почвы 106
4 ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ 111
4.1 Технологическая схема получения биопрепарата «Триходермин-6» и технико-экономические показатели производства 111
ВЫВОДЫ 116
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 118
ПРИЛОЖЕНИЕ 136
- Распространение грибов рода Trichoderma
- Объекты исследования
- Влияние источников питания на интенсивность роста мицелия и спорообразования грибов рода Trichoderma
Введение к работе
В настоящее время для защиты сеянцев хвойных пород от сосудистых микозов применяется искусственное обогащение почв лесопитомников грибами рода Trichoderma. В публикациях последних лет подчеркивается целесообразность использования в практике защиты растений аборигенных штаммов грибов этого рода (Громовых, 2002).
Успех использования биологического метода защиты растений зависит не только от подбора высокоэффективного штамма рода Trichoderma, но и в равной мере от возможности получения биопрепарата на его основе. Для массовой наработки биопрепарата поверхностным способом в разных странах мира используются отходы сельского хозяйства: зерно, отруби, солома пшеницы и сорго, шелуха подсолнечника и др. (Lewis, Papavizas, 1991). Проблема ресурсов доступного и дешевого сырья для промышленной биотехнологии остается весьма актуальной, поэтому перспективным является расширение сырьевой базы для производства биопрепаратов за счет использования отходов деревообрабатывающей промышленности и нетрадиционных сельскохозяйственных отходов. К числу таких отходов относятся кора и одубина коры лиственницы сибирской, стебли топинамбура.
Разработка технологии получения биопрепаратов на основе аборигенных штаммов грибов рода Trichoderma и оценка воздействия штаммов на лигноуглеводные субстраты является весьма актуальной задачей. Успешное решение этой задачи позволит в более широком масштабе использовать биометод защиты растений и решить в какой-то мере проблему утилизации лигноуглеводных отходов.
Распространение грибов рода Trichoderma
Грибы рода Trichoderma Pers. Fr. {Eumicotina, Denteromycotina, Hyphomycetes; телеоморфа относится к род) Нуросгеа и близким родам Ascomycotina, Hypocreaceaea) распространены во всех климатических зонах и считаются типично почвенными. Первое сообщение о наличии видов Trichoderma в почве сделали Oudemans и Koning (1902: цит. по Rifai, 1969).
В последние годы систематика этого таксона вызывает много споров, вызванных как пересмотром концепции рода, так и описанием большого числа новых видов. Параллельно с сравнительно-морфологическим и онтогенетическим подходами, в последнее время активно используются молекулярные методы хемотаксономии и геносистематики, которые позволяют выявить реальное положение этого рода и объем относящихся к нему видов, а также выявить связи анаморфных видов с их возможными телеоморфами. В настоящее время описано около 200 видов Нуросгеа, и около половины из них имеет анаморфу, относящуюся к роду Trichoderma (Samuels, 1996). Исходя из этого, можно предположить, что существует, по крайней мере, 100 естественных видов Trichoderma, но, возможно, их еще больше, поскольку клоны, потерявшие способность к половому размножению, могут эволюционировать самостоятельно (Samuels, 1996; Дьяков, 1999).
Многочисленные работы по изучению почвенной микобиоты агроценозов и лесных сообществ показывают, что грибы рода Trichoderma широко распространены и способны существовать в самых разнообразных почвах. Однако отмечаются некоторые закономерности в распространении отдельных видов по географическим зонам. К сожалению, исследования з некоторых ученых трудно интерпретировать в связи с тем, что при идентификации изолятов они не придерживались существующего в настоящее время подхода к классификации этого рода.
Наиболее распространенным видом является T.vihde Pers.: Fr., который выделен из многих типов почв Земного шара (Samuels et al., 1999). Виды T.harzianum Rifai и T.glaucum Abbot встречаются в основном в южных почвах (Danielson, Davey, 1973). Вид T.citrinoviride является типичным для умеренных зон Европы и Северной Америки, и также считается широко распространенным (Samuels et al., 1999). Вид Т. psendokoningii встречается, в основном, в почвах Австралии, Океании и Новой Зеландии, а Т. reesei (телеоморфа Н. jecorina) характерен для тропических областей и Американского континента (Samuels et al., 1994).
Представители рода Trichodemia являются непременным компонентом микобиоты почв лесных экосистем. Наибольшее количество грибов рода Trichodemia сосредоточено, главным образом, в почвенном слое, богатом органическими веществами. Грибы рода Trichoderma доминировали в микобиоте гумусового слоя почвы сосновых, еловых и березовых насаждений в Южной Финляндии (Schalin, 1967 - цит. по: Билай и др., 1984). Т. viride и Т. polyspornm типичны для почв хвойного леса в южном Квебеке (Widden, 1979). Среди наиболее распространенных видов микобиоты опавшей хвои сосны в Гималаях отмечен вид Т. viride (Sarbhoy, 1964 цит. по: Билай и др., 1984). В лесной почве Колумбии (Южная Америка) обнаружили Т. inhamaium (=Т. harzicmum) (Veerkamp, Gams, 1983). Т. harzicmum встречается в почве и на растительных остатках в мангровых лесах (Wu, 1993; Sadaba et al., 1995) и в Малазийском дождевом лесу (Bettucci, Roquebert, 1995). Грибы рода Trichoderma обнаружены в подстилке всех типов сосняков и в большинстве типов почв сосновых лесов Центрального Полесья Украины (Билай и др., 1984).
Объекты исследования
1. Штамм "10-99" T.asperellum Samuels et al. Sect. Trichoderma. Оптимальная температура развития 28-30 С. Колонии на агаризованной среде Чапека достигают краев чашки Петри за 4-о суток. Мицелий бесцветный, паутинистый. Спороношение появляется на 3-й сутки роста в виде выпуклых сливающихся подушечек разной формы от 1 до 3 мм в диаметре, концентрическое. Цвет травяно-зеленый. Обратная сторона колонии бесцветная. Экссудат отсутствует. Запах слабый, невнятный. Гифы бесцветные, гладкие 2— З мкм в диаметре. Хламидоспоры округлые, гладкостенные, светло-зеленые 9-10 мкм в диаметре. Конидиеносцы почти прямые, неокрашенные, гладкие, 2.5 - 3.0 мкм в диаметре и 80-110 мкм в длину. Ф и а л и д ы расположены на веточках мутовками; бутылевидные, 7 - 8 х 3 - 4.0 мкм. Конидии зеленые, округлые, крупные, 4 - 5 х 3 - 4.5 мкм, бородавчатые.
2. Штамм "МГ-97" T.asperellum (ВКПМ F-765). Sect. Trichoderma. Оптимальная температура развития 25-27 С. Колонии на агаризованной среде Чапека достигают краев чашки Петри за 3-е суток. Мицелий бесцветный, паутинистый. Спороношение появляется на 3-й сутки роста в виде выпуклых подушечек 2-3 мм в диаметре, расположенных концентрическими зонами. Цвет травяно-зеленый. Обратная сторона колонии бесцветная. Экссудат отсутствует. Запах слабый, невнятный. Гифы бесцветные, гладкие, 2—4 мкм в диаметре. Хламидоспоры округлые, гладкостенные, светло-зеленые, 8-9 мкм в диаметре. Конидиеносцы почти прямые, неокрашенные, гладкие, 2.5 - 5 мкм в диаметре и 80- 150 мкм в длину. Фиал иды расположены на веточках мутовками; ампул овидные, 8-9.5x3-4.0 мкм, терминальные - немного длиннее, до 12 мкм. Конидии зеленые, округлые, крупные, 4 - 4.5 х 3 - 4.0 мкм, бородавчатые; собраны в слизистые головки.
3. Штамм "0-97" T.virens (Miller et al.) Arx. Sect. Pachybasium. Оптимальная температура развития 25-27 С. Колонии на агаризованной среде Чапека достигают краев чашки Петри за пять суток. Мицелий бесцветный, ватообразный. Спороношение появляется на 3-й сутки роста в воздушном мицелии, позже в плоских подушечках с диаметром 2-3 мм. Цвет голубовато-зеленоватый. Обратная сторона колонии вначале бесцветная, затем становится светло-желтой, а позже коричневатой. Экссудат присутствует. Запах довольно резкий, плесневый. Гифы бесцветные, гладкие, 4.0-6.0 мкм в диаметре. Хламидоспоры округлые диаметром 8.0-9.0 мкм, гладкие, светло-зеленые. Конидиеносцы в воздушном мицелии короткие, неокрашенные, гладкие, прямые, 15.0 - 40.0 мкм длиной и 2.0 - 5.0 мкм в диаметре; разветвленные 1-2 раза или неветвящиеся. Фиал иды расположены на концах веточек кисточкой; по форме ампуловидные, 4.5 -\0.5 х 2.5 - 4.3 мкм. Конидии зеленые, собраны в одну слизистую головку на всей кисточке, широко эллиптические, 4.0 - 6.0 х 3.0 - 4.0 мкм, нежно шероховатые.
4. Штамм "МК" T.koningii Oudemans et Koning. Sect. Trichoderma. Оптимальная температура развития 25-27 С. Колонии на агаризованной среде Чапека достигают краев чашки Петри за 3-е суток. Мицелий бесцветный, паутинистый. Спороношение появляется на 3-й сутки роста отдельными конидиальными пучками, расположенными от центра чашки последовательными концентрическими зонами.
Влияние источников питания на интенсивность роста мицелия и спорообразования грибов рода Trichoderma
Изучение физиологических потребностей грибов для перехода к конидиегенезу позволяет проводить направленный отбор штаммов и субстратов для получения биопрепаратов с высоким титром конидий.
Нами были оценены накопление биомассы и выход конидий у исследуемых штаммов рода Trichodcrma в условиях поверхностного культивирования на жидкой среде Чапека, в которой сахарозу или азотнокислый натрий заменяли одним из испытываемых соединений. Для сравнения штаммов дополнительным критерием служила удельная скорость образования конидий.
Посев грибов проводился конидиальной суспензией из расчета 1x10 конидий на 1 мл среды. Поверхностное культивирование грибов проводили в колбах Эрленмейра объемом 150 см1 с 50 см"1 среды. Культуры инкубировали в термостате при температуре 25-27 С в течение 10 суток.
Известно, что штаммы рода Trichodcrma гетерогенны по степени усвояемости источников питания. Интенсивность роста мицелия и спорообразования у штаммов может стимулироваться или тормозиться в зависимости как от источников углерода, так и азота, входящих в состав питательной среды.
Проведенные нами исследования показали, что наибольший выход конидий у штамма «0-97» T.vircns обеспечивала среда с сахарозой в качестве единственного источника углерода, выход конидий составил 9.4x10" на 1 см" мицелиальной пленки. Для накопления биомассы наиболее благоприятно повлияло внесение сахарозы и глюкозы, кроме того, штамм «0-97» хорошо усваивал целлюлозу и лактозу, но выход конидий снизился в 1.1-1.3 раза соответственно, по сравнению с контролем. На средах с маннозой, арабинозой, крахмалом, мальтозой, фруктозой и маннитом выход конидий у штамма «0-97» снизился в 38-94 раза, по сравнению с контролем (таблица 3).
Таблица 3 - Влияние различных источников углерода на накопление биомассы и выход конидий штамма «0-97» Trichoderma virens
Источники углерода Удельная скоростьобразованияконидий,конидий/мг/сутки Вес сухой биомассы, г Выход конидий, конидий/см"
Из использованных источников азота наибольший выход конидий у штамма "0-97" был отмечен на среде с азотнокислым натрием. Помимо азотнокислого натрия, штамм "0-97" интенсивно усваивал для спорообразования среды с аргинином, гликоколом и виннокислым аммонием: выход конидий составлял 1.7x10""1, 2.5x10" и 1.4x10""1 конидий/см" соответственно. Хуже всего штамм «0-97» спороносил на среде с цистеином, выход конидий снизился в 67 раз, по сравнению с контролем (таблица 4).
