Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы. Актиномицеты - продуценты биологически активных соединений и биопрепаратов 10
1.1 Актиномицеты - продуценты биологически активных веществ 12
1.2 Актиномицеты в медицине, фармацевтике и ветеринарии 19
1.3 Использование актиномицетов как продуцентов биопрепаратов для биологического контроля фитопатогенов 22
1.4 Разработка условий и подбор питательных сред для культивирования актиномицетов
2 Объекты и методы исследования 40
2.1 Характеристика объекта исследования 40
2.2 Изучение морфологии штамма 19/97М 42
2.3 Изучение продуктивности штамма при глубинном и поверхностном культивировании
2.3.1 Оценка продуктивности штамма при росте на различных 43
источниках углерода и азота 43
2.3.2 Определение остаточной концентрации источников углерода в питательной среде после культивирования продуцента 44
2.4 Подбор буферных систем для нейтрализации миколовых кислот... 46
2.5 Оптимизация состава среды и температуры культивирования 47
2.6.Твердофазное культивирование штамма 81гер1:отусе8 ЫегШш 19/97
М на растительных субстратах 48
2.7 Расчет основных кинетических характеристик процесса культивирования 50
2.8 Определение химического состава метаболитов штамма 19/97М 81:гер1:отусе8 Ы:егШш
2.8.1 Идентификация антибиотиков в культуральной жидкости и мицелии штамма Streptomyces lateritius 19/97 М 51
2.8.2 Спектральный анализ метаболитов 54
2.9 Оценка антагонистической активности метаболитов штамма в отношении грибов рода Fusarium 54
2.10 Определение биологической активности метаболитов штамма 19/97 М Streptomyces lateritius 55
2.11 Оценка эффективности метаболитов штамма 19/97 М Streptomyces lateritius на рост сеянцев Pinus sibirica, Pinus obovata L. и злаковых культур в полевых испытаниях 56
2.12 Определение жизнеспособности штамма 19/97 М Streptomyces lateritius при хранении в лабораторных условиях 58
2.13 Статистическая обработка полученных результатов 59
3 Продуктивность штамма 19/97М Streptomyces lateritius в различных биотехнологических системах 61
3.1 Жидкофазное культивирование 61
3.1.1 Динамика роста штамма при глубинном и поверхностном способах культивирования
3.1.2 Продуктивность биомассы штамма 19/97М Streptomyces lateritius на различных источниках углерода и азота 64
3.1.3 Рост штамма 19/97М Streptomyces lateritius при различных значениях pH 72
3.1.4 Оптимизация состава компонентов питательной среды для культивирования штамма 19/97М Streptomyces lateritius 76
3.2 Твердофазная ферментация 78
4 Биологические свойства штамма Streptomyces lateritius 19/97М 83
4.1 Изучение морфолого-культуральных признаков штамма 83
4.2 Идентификация антибиотиков в культуральной жидкости и мицелии штамма 19/97 Streptomyces lateritius 86
4.3 Масс-спектроскопический анализ метаболитов продуцента 91
4.4 Антагонистическая активность при различных условиях культивирования 93
4.5 Оценка жизнеспособности и активности биомассы продуцента при
хранении 97
5 Оценка эффективности использования штамма актиномицета Streptomyces lateritius 19/97М в биологическом контроле сеянцев и злаков 102
5.1 Влияние метаболитов в культуральной жидкости штамма Streptomyces lateritius 19/97М на прорастание семян хвойных в лабораторных условиях 103
5.2 Влияние метаболитов культуральной жидкости штамма актиномицета Streptomyces lateritius 19/97М на развитие семян хвойных в условиях лесного питомника 108
5.3 Влияние метаболитов культуральной жидкости штамма актиномицета Streptomyces lateritius 19/97М на рост и развитие злаков в лабораторных условиях 115
5.4 Влияние протравливания семян метаболитами штамма 19/97М Streptomyces lateritius на рост и показатели продуктивности злаков в полевых испытаниях 120
6 Технологическая часть 127
6.1 Технология и экономическое обоснование получения препарата глубинным культивированием 127
6.2 Технология и экономическое обоснование получения препарата твердофазной ферментацией 129
Выводы 134
Список использованной литературы 136
Приложение 158
- Актиномицеты - продуценты биологически активных веществ
- Характеристика объекта исследования
- Жидкофазное культивирование
Введение к работе
Актуальность работы. В настоящее время биологический метод защиты растений является наиболее важным звеном в выращивании экологически безопасной сельскохозяйственной продукции, оздоровлению лесопосадочного материала. Биометод защиты растений признан наиболее ресурсосберегающим приемом, позволяющим защищать растения от болезней, вредителей и повышать их продуктивность без затрат невосполнимых природных ресурсов и без вредных выбросов в окружающую среду. Этот метод защиты растений имеет важные отличительные свойства: полное отсутствие резистентности патогенных организмов, короткий срок ожидания отклика, способность живых организмов размножаться в природе, безопасность в применении () В настоящее время уже успешно используются такие препараты как планриз, агат-25, псевдобактерин - это биофунгициды на основе бактерий рода Pseudomonas, бактофит, фитоспорин, интеграл, бисолбисан - на основе B.subtilis, триходермин - на основе микромицетов рода Trichoderma.
Все чаще в научной литературе, исследователи рекомендуют к использованию в биологическом контроле и стимулированию роста растений штаммы группы актиномицетов (Зенова 1989, Ikotun 1990, Громовых и др. 2005, Доолоткельдиева и др.,2007). Предложено достаточно большое количество штаммов актиномицетов, защищенных патентами и предлагаемых для производства биопрепаратов защиты растений, однако технология их массового производства отсутствует. Из почвы лесного питомника Красноярского края в 1997 году был выделен штамм 19/97М Streptomyces lateritius (ВКПМ Ас 1637). Данный штамм был предложен как потенциальный продуцент биопрепарата для стимулирования роста и защиты сеянцев хвойных от возбудителей болезней, вызываемых грибами родов Fusarium и Alternaria (Громовых и др., 2005). Однако до настоящего времени не изучены условия получения биомассы и метаболитов этого продуцента. Не подобраны оптимальные питательные среды для культивирования штамма 19/97 М S. lateritius. Кроме того, не проведена апробация полученного на основе штамма препарата в полевых условиях. Все это сдерживает возможность скорейшего внедрения препаратов на основе этих микроорганизмов в качестве инструмента биоконтроля.
Цели и задачи исследования.
Целью настоящей работы было изучение биологической активности и продуктивности штамма 19/97 М Streptomyces lateritius, разработка биотехнологии биопрепарата для биологического контроля фитопатогенов злаков и сеянцев хвойных.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
изучить биологические особенности роста и продуктивности штамма 19/97 М Streptomyces lateritius при жидкофазном и твердофазном культивировании;
с целью повышения продуктивности оптимизировать состав питательной среды и условия для культивирования штамма;
подобрать субстраты для твердофазного культивирования штамма на основе отходов сельского хозяйства и лесоперерабатывающей промышленности;
изучить состав вторичных метаболитов, продуцируемых активность штамма в отношении фитопатогенов рода Fusarium;
изучить ростстимулирующие свойства штамма 19/97 М Streptomyces lateritius в отношении хвойных и злаковых растений;
- оценить биологическую активность и жизнеспособность штамма при хранении в лабораторных условиях;
- наработать опытные партии биопрепарата и оценить его эффективность в защите растений при внесении в почву лесного питомника и агроценоза злаков.
Научная новизна. Выявлен ростостимулирующий эффект метаболитов штамма 19/97М Streptomyces lateritius в отношении хвойных и злаковых растений и установлена антагонистическая активность штамма в отношении фитопатогенных грибов хвойных и злаков из рода Fusarium. Показано, что штамм 19/97М Streptomyces lateritius сохраняет жизнеспособность и антибиотическую активность при длительном хранении в лабораторных условиях. Изучены физиолого-морфологические свойства, потребности в источниках углерода и азота и динамика накопления биомассы штамма 19/97М Streptomyces lateritius при жидкофазном поверхностном культивировании на различных питательных средах; подобраны оптимальные условия для накопления биомассы. Дано биологическое обоснование применения штамма 19/97М Streptomyces lateritius для получения биопрепарата.
Проведена оценка химического состава продуцируемых актиномицетом метаболитов. С использованием методов ТСХ, ВЖХ, бумажной хроматографии и электрофореза доказано, что штамм не синтезирует антибиотических соединений группы пенициллина, стрептомицина, тетрациклина и левомицитина. Показано, что активными соединениями являются окрашенные пигменты розово-красного цвета, относящиеся к группам хинонов и антрациклинов.
Впервые методом твердофазной ферментации на древесной зелени и коре пихты сибирской получен новый биопрепарат на основе продуцента 19/97 М Streptomyces lateritius. Установленные в результате исследований представления о возможности получения биопрепарата на основе нового штамма 19/97 М актиномицета Streptomyces lateritius вносят существенный вклад в научные основы использования его в биологической защите злаковых и хвойных культур.
Практическая значимость работы. Подобраны состав жидкой синтетической среды и условия для получения биомассы штамма 19/97М S. lateritius. С целью получения биопрепарата разработаны условия для твердофазного культивирования штамма на древесной зелени пихты сибирской.
Показано, что штамм 19/97 М S. lateritius может быть использован для защиты растений в сельском и лесном хозяйстве. Наработана опытная партия биопрепарата, содержащего биомассу и культуральную жидкость штамма, и проведены опытно-производственные испытания биопрепаратов на сеянцах хвойных в лесном питомнике и культурах злаковых растений. Показано положительное влияние биопрепаратов на увеличение урожайности злаков и выход здоровых сеянцев в питомнике.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждались на конференциях: международных - II «Актуальные проблемы технологии живых систем» (Владивосток, 2007); VII « Живые системы и биологическая безопасность населения» (Москва, 2008); всероссийских «Рациональное природопользование» (Ярославль, 2005); «Лесной и химический комплекс. Проблемы и решения (Красноярск, 2006, 2008, 2009); IV съезде биотехнологов России (Пущино, 2006); городской научно-практической конференции «Развитие инновационной деятельности в промышленном комплексе города Красноярска», (Красноярск, 2007) семинаре проблемной лаборатории Сибирского государственного технологического университета (Красноярск, 2009), на научном
симпозиуме «Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее» (Москва, 2011).
Работа выполнена при финансовой поддержке грантами: Российский фонд фундаментальных исследований 06-04-08040 - офи, «Создание высокопродуктивных устойчивых к патогенам форм хвойных растений в культуре in vitro, на основе современных достижений в области половой репродукции голосеменных»; 07-04-90843 (МОБСТ) грант на прохождение научной стажировки в Московском государственном университете прикладной биотехнологии. Грант РНП.2.2.3.1.2466 Министерства образования и науки РФ "Развитие гербарной коллекции и музея культур грибов Средней Сибири как базы для научно-образовательного процесса"; Красноярский краевой фонд науки "Индивидуальные гранты для молодых ученых" 18G178.
Объем и структура работы. Диссертация стоит из введения, 6 глав, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Список литературы включает в себя 200 работ, в т.ч 70 на иностранных языках. Общий объем диссертации 174 страниц из них основного текста 156 страниц. Диссертация включает 40 рисунков, 12 таблиц, 11 приложений.
Актиномицеты - продуценты биологически активных веществ
Природными субстратами, из которых актиномицеты выделяются в наибольшем количестве и своем разнообразии, являются почвы. Отличительной особенностью актиномицетов является способность к синтезу физиологически активных веществ, антибиотиков, пигментов, пахучих соединений. Именно-ими формируется специфический запах, почвы и иногда воды (вещества геосмин, аргосмин, муцидон, 2-метил-изоборнеол). Например, чешские ученые, взяв только-девять штаммов актиномицета (БКерЮтусез ашео/асгет, Б. ауегт иШз, & с тпатопетгз, 8. соеНсоЬг, Б. griseus, Б Гшйат, Б. птоят, 5 эреЫаЫШ, Б. у шг ае) выделили более двадцати пахучих веществ с высокой степенью летучести [12].
Изучение антибиотических свойств актиномицетов, их распространения в природе продолжается и до настоящего времени, обогащая науку и практику новыми антибиотиками, находящими применение не только для борьбы со многими инфекционными заболеваниями в медицине [13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22]. В настоящее время использование их в немедицинских целях также велико, как и в здравоохранении. Антибиотики применяются в разных отраслях народного хозяйства: в ветеринарии для лечения и профилактики инфекционных заболеваний животных; в животноводстве в качестве стимуляторов роста сельскохозяйственных животных [13, 23, 24, 25, 26, 27]; в растениеводстве в качестве активных средств борьбы и профилактики бактериальных и грибковых заболеваний растений [4, 5, 6, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38]; в пищевой промышленности: при консервировании различных пищевых продуктов с максимальным сохранением питательных веществ [39];. Используются« в ряде отраслей бродильной; промышленности как средства борьбы с чужеродными микроорганизмами; в научных исследованиях для ингибирования определенных этапов биохимических превращений; при выделении чистых культур отдельных патогенных микроорганизмов, культивировании вирусов; генетических исследованиях;[40; 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47]. :
Один из первых антибиотиков- актиномицетного происхождения - мицетин - открыт советскими учеными H.A. . Красильниковым и А. И. Кореняко еще в 1939 году, а к 1940 году были описаны и сравнительно подробно? изучены, два антибиотических вещества;, образуемых актиномицетами: актиномицетин и мицетин: [48]. В 1941 г. в лаборатории З; Ваксмаиа был выделен. антибиотик актиномицищ образуемый Streptomyces antibioticus: Спустя», год, под» руководством. 3. Ваксмана был. выделен стрептотрицин, образуемый S.Javendulae. Однако эти антибиотические вещества не привлекли к себе широкого внимания, практиков; так как обладали сильными токсическими свойствами; Выделение: и изучение этих антибиотиков явились преддверьем к открытию 3. Ваксманом и его сотрудниками в 1943 г. замечательного антибиотического, препарата стрептомицина; Антибиотик получил название стрептомицин (от родового, названия актиномицетов Streptomyces), а организм, образующий; этот антибиотик,- был определен: как Sgriseas. Открытие стрептомицина и . выяснение его ценных лечебных качеств послужили мощным толчком к исследованию актиномицетов и поисков среди них продуцентов новых антибиотиков Широкие поиски увенчались открытием таких ценных антибиотиков, как хлоромицетин, неомицин, хлортетрациклин, тетрациклин и т.д. [48];
В 1957 г. японскими исследователями А. Иммамура, М. Хори, С. Татсуока было установлено, что актиномицет S.humidus является- продуцентом антибиотика, идентичного дигидрострептомицину. В 1967 г. К.
Хиггенс и Р. Кастнер выделили комплекс антибиотиков из продуцента S.tenebraris, среди которого был компонент тромбомицин. Он биологически активен к грамположительным и грамотрицательным бактериям. Еще один антибиотик, выделенный из продуцента вида S. rimousus, был назван террамицин, или окситетрациклин [48].
Антибиотические соединения находят применение в различных областях медицины, сельского хозяйства и промышленности. Ниже представлен далеко не полный список используемых промышленных штаммов: S.fradiae используется для получения ветеринарного антибиотика тилозина, cremeus subsp. tobpamycini и S. cremeus 1979 являются продуцентами апрамицина, S. rimosus продуцирует окситетрациклин, патент принадлежит ассоциации содействия развитию новейших направлений биотехнологии продуцентов антибиотиков «БИОАН» [49], штамм S. nodosus, запатентованный , ТОО «ЭЛЕСТ», является продуцентом амфотерицина - противогрибкового антибиотика, применяемого" в медицине для практики лечения глубоких и системных микозов [50].
Актиномицеты, принадлежащие к виду S. noursei, продуцируют антибиотики, которые подавляют рост грамположительных и грамотрицательных бактерий, микобактерий, некоторых видов дрожжей и грибов [51]. Антибиотики продуцента Actinomyces levoris не угнетают рост бактерий, но подавляют развитие дрожжей, некоторых дрожжеподобных организмов, мицелиальных грибов [48].
Характеристика объекта исследования
Объектом исследования служил штамм 19/97 М Streptornyces lateritius, (Sveshnikova 1957; Pridman et al., 1958 ), выделенный из почвы лесного питомника Красноярского края в 1997 г. (56 0 04 с.ш, 92 0 42 в.д). Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под коллекционным номером ВКПМ Ас-1637. Штамм был запатентован (Пат. № 2261902) как штамм актиномицета Streptornyces lateritius 19/97-М, перспективный для стимулирования роста и защиты сеянцев хвойных от возбудителей болезней, вызываемых грибами родов Fusarium и Alternara.
Авторами штамма (Громовых Т.И., Садыкова В.С., Литовка Ю.А.) было показано, что при росте на плотных питательных средах штамм образует относительно медленно растущие колонии, которые достигают 2-4 мм в диаметре на 5-7 сут при (27±2) С. На питательных средах: минеральный агар, глицерин-нитратный агар и овсяный агар - штамм образует воздушный мицелий от бледно-розового цвета (на 7 сутки) до кирпично-красного (на 21 сутки). Субстратный мицелий и растворимый пигмент бледно-сиреневые на 7 сутки и фиолетовые на 14 и 21 сутки.
На органическом агаре воздушный мицелий кирпично-красный, субстратный мицелий и растворимый пигмент темно-коричневого цвета. Растворимый пигмент имеет щелочную реакцию, при добавлении КОН синеет. На пептонно-дрожжевом агаре штамм образует меланоидные пигменты коричневого цвета. На твердой питательной среде крахмало- аммиачный агар (КАА) колонии розового цвета образует обильно разветвленный мицелий, частично распадающийся на фрагменты. Воздушный
мицелий в зрелом состоянии несет цепочки из трех-четырех неподвижных спор (рисунок 1).
Рисунок 1 - Морфология клеток (а) и колоний (б) Streptomyces lateritius штамм 19/97- М на глицерин-нитратном агаре (цитировано по авторам Громовых и др., 2005)
Штамм обладает антибиотической активностью в отношении грибов из родов Fusarium и Alternara - возбудителей сосудистого полегания. Кроме того, штамм выделяет метаболиты, стимулирующие ростовые процессы у сеянцев Larix sibirica L., Pinus sy Ivs tris L., Picea obovata L.
По заключению специалистов Красноярской краевой ветеринарной лаборатории данный штамм авирулентен, нетоксичен, нетоксигенен в отношении теплокровных организмов и не вызывает инфекционных заболеваний. На основе этого данный штамм предполагается использовать в качестве биопродуцента экологически безопасных биопрепаратов [4].
Изучение морфологии штамма 19/97М Streptomyces lateritius
Для установления цикла развития штамма на твердых питательных средах проводили изучение микроморфологии. Микроморфологические особенности штамма исследовали в живом состоянии путем выращивания культуры в камерах Ван-Тигема. Для этого на стерильное предметное стекло фиксировали камеру Ван-Тигема, в центр которой наносили каплю расплавленного питательного крахмало-аммиачного агара. После застывания среды в центр капли иглой вносили посевной материал. Камеры с посевами помещали в стерильные чашки Петри и инкубировали при температуре 25±1 С. Каждые вторые сутки культивирования проводили наблюдение за морфологией при помощи световой микроскопии (микроскоп LW Scientific, США) и сканирующей электронной микроскопии (микроскоп Hitachi S- 405А). Сканирующая электронная микроскопия: агаровые блоки с наросшим 7, 14 и 21-суточным мицелием фиксировали в парах осмия. После высушивания образцы закрепляли, напыляли смесь платины и палладия (IB-3 Ion Coater) и получали снимки с помощью сканирующего электронного микроскопа «Hitachi» S-405A в Лаборатории электронной микроскопии МГУ им. М.В. Ломоносова.
Жидкофазное культивирование
Эффективность накопления биомассы штамма актиномицета 19/97М Б ер тусез ШегШш оценивали по скорости роста продуцента и количеству биомассы в стационарной фазе роста в условиях глубинного и поверхностного культивирования на стандартной крахмало-аммиачной питательной среде. Исследования показали, что при глубинном культивировании адаптация штамма к источникам углеродного и минерального питания происходит значительно быстрее, чем при поверхностном, что подтверждается более коротким латентным периодом: лаг фаза сокращается с 24-36 до 18-20 ч. (рисунок 2).
Время культивирования, «Биомасса, глубинное культивирование биомасса, поверхностное культивирование
- С крахмала, глубинное культивирование -С крахмала, поверхностное культивирование
Рисунок 2 - Динамика роста штамма 19/97М Б.ШегШт и изменения концентрации субстрата при глубинном и поверхностном способах культивирования
При глубинном культивировании латентный период (лаг фаза) сокращается на 24 часа, за счет чего уменьшается период достижения стационарной фазы роста культуры. Удельная скорость в период экспоненциального роста культуры при глубинном и поверхностном культивировании составляет (0,068+0,014) ч"1 и (0,057+0,017) ч"1 соответственно.
Однако количество биомассы в стационарной фазе не зависит от способа культивирования (рисунок 2). К моменту выхода в стационарную фазу роста экономический коэффициент максимален, при глубинном культивирования составляет (25,77±3,74) % на 4-е сутки, а при поверхностном культивировании максимален на 6-е сутки и составляет (22,53±1,32) % (рисунок 3).
Рисунок 3 - Экономические коэффициенты роста штамма ШегШш 19/97М при поверхностном и глубинном культивировании
Характер роста штамма 19/97М при глубинном и поверхностном культивировании имеет свои особенности. Если при поверхностном культивировании культура образует несмачиваемую пленку на поверхности среды, то при глубинном культивировании образование колоний носит гетерогенный характер. При культивировании в глубинных условиях образуются переносимые током среды сферические колонии - пелеты; кроме того, актиномицет формирует колонии, прикрепленные к стенкам и дну колбы. Наиболее активно обрастание стенок сосуда - на границе раздела жидкой и газовой фаз, где среда «омывает» стенки колбы при движении качалки.
Продуктивность биомассы штамма 19/97М Streptomyces lateritius на различных источниках углерода и азота
Увеличение выхода биомассы и эффективность использования питательного субстрата может быть достигнуто подбором наилучшего источника углерода. Исследования проводили на крахмале, сахарозе, глюкозе, манните, сорбите, глицерине, нейтрализате, зерновом экстракте в качестве единственных источников углерода. В результате жидкофазного поверхностного и глубинного культивирования было установлено, что штамм 19/97М Streptomyces lateritius способен использовать различные субстраты в качестве источника углерода. Кроме полисахарида крахмала, штамм успешно растет на средах, содержащих MOHO-, дисахариды и сахароспирты, и обладает способностью утилизировать глицерин, этиловый спирт. Однако в условиях поверхностного культивирования на среде с этанолом рост культуры был медленным, и стационарная фаза роста наступила только через 7 недель: количество биомассы на это время составило (0,25±0,07) г/л.
Штамм не обладает пептолитической активностью: роста культуры на средах с пептоном не выявлено.
Исследования показали, что максимальное количество биомассы, накапливаемое штаммом 19/97М S. lateritius на средах с глюкозой, наблюдается на четвертые сутки; маннит и сорбит — на пятые сутки культивирования (рисунок 4).
