Введение к работе
Актуальность работы
Загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами является одной из наиболее актуальных экологических проблем, поскольку затрагивает не только техногенные, но и природные ландшафты. По данным ВОЗ, никель и близкий по свойствам кобальт признаны веществами 2 класса опасности и канцерогенами. Территории, где осуществляется добыча или обработка металлов являются зонами чрезвычайной экологической ситуации, для которых характерно образование «биогеохимических провинций» с высоким содержанием никеля в воздухе, воде, почве и местных продуктах питания. По данным агрохимической службы Российской Федерации уровень загрязнения сельскохозяйственных почв никелем является умеренным, однако почвы, загрязненные никелем, по занимаемой площади превосходят почвы, загрязненные свинцом, кадмием, цинком и другими высокотоксичными металлами (Аристархов, Харитонова, 2002). Основными источниками загрязнения сельскохозяйственных почв никелем является неконтролируемое применение минеральных удобрений, а также осадков промышленных сточных вод, используемых в качестве мелиорантов (Аристархов, Харитонова, 2002).
В последнее десятилетие у производителей сельскохозяйственной продукции возрос интерес к применению биопрепаратов, разрабатываемых на основе ризосферных бактерий группы PGPR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria) для стимуляции роста растений и защиты от фитопатогенов. Имеющиеся экспериментальные данные свидетельствуют о том, что инокуляция растений ризосферными бактериями увеличивает риск аккумуляции металлов в растениях, выращиваемых на загрязненных почвах (Kamnev and van der Lelie, 2000; Zaidi et al., 2006; Белимов, 2008; Khan et al., 2009; Белимов, Тихонович, 2011). Устойчивые к тяжелым металлам ризосферные бактерии являются основой для разработки нового поколения биопрепаратов, предназначенных для стимуляции роста и защиты растений, а также для биоремедиации загрязненных почв. В связи с этим представляется целесообразным исследовать ризосферные бактерии, обладающие разнообразными механизмами устойчивости к тяжелым металлам, поскольку бактерии способны оказывать различное влияние на аккумуляцию металлов в растениях. Одним из эффективных механизмов, обеспечивающих высокий уровень устойчивости к никелю/кобальту у бактерий, является активный экспорт токсичных катионов из клетки в окружающую среду. Роль данного механизма устойчивости исследовалась только в штаммах эндофитных бактерий в фиторемедиационных экспериментах с субстратами, загрязненными никелем (Lodewyckx et al., 2001) или в комплексе с хлорированными ксенобиотиками (Weyens et al., 2010; 2011). Однако исследованные эндофитные штаммы не обладали свойствами, характерными для бактерий группы PGPR. К настоящему времени ремедиационный потенциал аналогичных генетических систем устойчивости в ризосферных бактериях не изучен. В связи с этим актуальным является поиск природных или создание рекомбинантных штаммов ризосферных бактерий, обладающих системами экспорта никеля и других металлов. При этом следует учитывать способность бактерий к биосорбции и иммобилизации металлов, что является важным фактором, регулирующим поступление тяжелых металлов в растения. Исследование ризосферных бактерий, обладающих различными механизмами устойчивости к тяжелым металлам, позволит понять принципы их взаимодействия с растениями и более эффективно реализовать генетический потенциал бактерий при разработке новых биотехнологий защиты растений и фиторемедиации почв, загрязненных как тяжелыми металлами, так и в комплексе с органическими токсикантами.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы являлось получение устойчивых к никелю/кобальту штаммов PGPR Pseudomonas и исследование их взаимодействия с растениями в условиях загрязнения тяжелыми металлами.
В соответствии с данной целью решались следующие задачи:
-
Из различных экологических ниш выделить и идентифицировать бактерии, содержащие плазмиды устойчивости к никелю (кобальту, цинку, кадмию), и определить соответствующие детерминанты устойчивости.
-
Получить на основе различных видов PGPR Pseudomonas и выделенных плазмид новые штаммы, устойчивые к кобальту/никелю. Исследовать физиолого-биохимические особенности трансконьюгантов.
-
Исследовать у полученных ризосферных штаммов особенности аккумуляции металлов из среды культивирования.
-
Исследовать влияние устойчивых к кобальту/никелю ризосферных штаммов на аккумуляцию никеля в растениях и на параметры роста растений в вегетационных экспериментах, моделирующих загрязнение никелем.
-
Сконструировать штаммы ризосферных бактерий, содержащие совместимые плазмиды – устойчивости к кобальту/никелю и биодеградации полиароматических углеводородов (ПАУ). Исследовать у полученных штаммов эффективность биодеградации нафталина в присутствии никеля в среде культивирования и способность стимулировать рост растений в условиях, моделирующих смешанное загрязнение ПАУ (включая нафталин и фенантрен) и никелем.
Научная новизна работы
Впервые у бактерий рода Comamonas обнаружена плазмида устойчивости к тяжелым металлам. Установлено, что плазмида pBS501 содержит детерминанту устойчивости к кобальту/никелю, гомологичную cnr оперону плазмиды pMOL28 из Cupriavidus metallidurans CH34 . Впервые показано, что экспрессия системы устойчивости cnr-типа из Comamonas testosteroni в штаммах PGPR Pseudomonas обеспечивает их выживаемость при высоких концентрациях никеля при сохранении комплекса свойств, обеспечивающих стимуляцию роста растений. Сконструированы штаммы PGPR Pseudomonas, содержащие природные плазмиды биодеградации полиароматических углеводородов (ПАУ) и устойчивости к кобальту/никелю. Показана способность штаммов к полной утилизации модельного ПАУ в присутствии 100 мкМ никеля при периодическом культивировании.
Научно-практическая значимость работы
Получен устойчивый к кобальту/никелю штамм Pseudomonas aureofaciens BS1393(pBS501), аккумулирующий из среды до 17% кобальта, который может быть использован в биотехнологиях очистки промышленных сточных вод от солей кобальта/никеля. Штамм Pseudomonas aureofaciens BS1393(pBS501), стимулирующий рост ячменя и препятствующий аккумуляции никеля в растительной биомассе, можно использовать при разработке биопрепарата для защиты растений, выращиваемых на почвах с загрязнением никелем до 5 ПДК. Полученные устойчивые к никелю/кобальту ризосферные штаммы-деструкторы ПАУ могут использоваться при разработке технологий очистки промышленных сточных вод, а также в качестве нового поколения биопрепаратов для защиты/стимуляции роста растений или биоремедиации почв со смешанным загрязнением нефтепродуктами, ПАУ и солями никеля/кобальта. Штамм P. aureofaciens BS1393(pBS216,pBS501) депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов и подтвержден патентом РФ на изобретение №2396339.
Апробация материалов работы
Основные результаты диссертации были представлены на 9 конференциях: «Экобиотехнология: Борьба с нефтяным загрязнением окружающей среды», 2001, Пущино; «Сельскохозяйственная микробиология в ХIХХХI веках», Всероссийская конференция, 1419 июня 2001, Санкт-Петербург; Всероссийская научно-практическая конференция «Биотехнология 2003», 2226 сентября 2003 г., Сочи; 1-я Международная геоэкологическая конференция. Геоэкологические проблемы загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами, 3031 октября 2003 г., Тула; «Биотехнология-2005», 8-й международный семинар-презентация инновационных научно-технических проектов, научно-практическая конференция, 1819 ноября 2005, Наукоград Пущино; 4th International Phytoremediation Conference, September, 2007, Denver, Colorado; 11 International symposium on Microbial Ecology – ISME-11, Vienna, Austria, August 2025, 2006; 2nd International Conference «Rhizosphere», August 2531, 2007, Montpellier, France; 4th International Phytoremediation Conference, September, 2007, Denver, Colorado; International Symposium on Applied Molecular Microbiology in Oil Systems (ISMOS), September 1618, 2007, Colchester, England.
Публикации по теме диссертации
По материалам диссертации опубликовано 18 работ, в том числе 6 статей, 2 главы в книгах, 9 тезисов, 1 патент РФ.
Структура и объем диссертации
