Содержание к диссертации
Введение
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Биосенсоры как направление в аналитической биотехнологии 13
2.1. Типы преобразователей, используемые в биосенсорах. Электрохимические преобразователи 14
2.2. Типы биологических материалов, применяемых в рецепторных элементах биосенсоров 15
2.2.1. Сенсоры на основе ферментов, антител и иммунных комплексов, ДНК, животных и растительных клеток, клеточных органоидов 15
2.2.2. Сенсоры на основе микробных клеток 17
2.2.2.1. Микробные сенсоры в мониторинге газовых и водных сред 19
2.2.2.1.1. Мониторинг атмосферы 19
2.2.2.1.2. Мониторинг гидросферы 20
2.2.2.2. Классы соединений, детектируемых с помощью микробных биосенсоров 21
2.2.2.2.1. Определение БПК 21
2.2.2.2.2. Детекция мутагенов и поллютантов 25
2.2.2.2.3. Сенсоры для определения анионных поверхностно-активных веществ (ПАВ) 28
2.2.2.3. Методы иммобилизации биологического материала в рецепторном элементе сенсора 29
2.3. Микроорганизмы-деструкторы и их использование в разработке биосенсоров для детекции токсичных соединений 30
2.3.1. Микроорганизмы-деструкторы токсичных соединений 30
2.3.2. Методы направленной модификации микроорганизмов для придания им деструктивных свойств 34
2.3.3. Плазмидная детерминированность генов биодеградации 35
2.4. Потребности в детекции ароматических и сульфоароматических соединений 36
2.4.1. Ароматические соединений и их влияние на экосистемы 36
2.4.2. Краткая характеристика сульфоароматических соединений 36
2.4.3. Возможный механизм биодеградации толуолсульфоната (ТС) 37
2.5. Характеристика штамма Comamonas testosteroni 38
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 41
3.1. Изучение Исследование способности микроорганизмов к деградации толуолсульфоната (ТС) 41
3.1.1. Трансформация ТС свободными клетками 41
3.1.2. Деградация ТС иммобилизованными клетками 42
3.1.3. Определение скорости ферментативной реакции клеток 42
3.1.4. Деградация ТС в непрерывных условиях 42
3.1.5. Контроль процесса деградации 43
3.1.6. Получение плазмидного и бесплазмидного варианта штамма С. testosteroni 43
3.2. Разработка микробного сенсора для определения w-толуолсульфоната 44
3.2.1. Среда культивирования 44
3.2.2. Иммобилизация микроорганизмов 44
3.2.3. Исследование деградирующей активности микроорганизмов 44
3.3. Разработка микробного сенсора для детекции фенола 45
3.3.1. Объект исследования 45
3.3.2. Штаммы-деструкторы фенола 46
3.3.3. Иммобилизация клеток 46
3.3.4. Хранение беактериальных штаммов 47
3.3.5. Скорость окисления субстрата бактериальными клетками 47
3.4. Характеристика полярографической измерительной системы 48
3.5. Деградация фенола в колоночном реакторе с иммобилизованным активным илом установки биохимочистки (БХО) 49
3.5.1. Отбор проб активного ила 49
3.5.2. Иммобилизация активного ила 49
3.5.3. Условия эксперимента 49
3.5.4. Контроль на входе и выходе колонки 49
3.5.5. Данные по работе установки биохимочистки 49
3.5.6. Определение фенола 50
3.6. Оптимизация работы установки БХО 50
3.6.1. Концентрация растворенного кислорода 50
3.6.2. Проведение замеров 50
3.7. Статистическая обработка полеченных результатов 50
3.8. Основные технические параметры анализатора 50
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 51
4.1. Биодеградация ТС с помощью Ctestosteroni BS1310(pBS1010) 52
4.1.1. Деградация ТС свободными и иммобилизованными клетками в периодических условиях 52
4.1.2. Деградация ТС в непрерывных условиях 54
4.2. Сенсор для детекции я-толуолсульфоната (ТС) 57
4.2.1. Скрининг штаммов-деструкторов арилсульфонатов 57
4.2.2. Характеристика штамма Comamonas testosteroni 57
4.2.3. Характеристика сенсоров на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного штамма С. testosteroni 58
4.2.4. Исследование работы сенсора на основе клеток Comamonas testosteroni в проточной системе 76
4.3. Разработка микробного биосенсора для детекции фенола 80
4.3.1.Скрининг штаммов-деструкторов фенола 80
4.3.2. Характеристика штамма 32-1 (Субстратная специфичность) 84
4.3.3. Характеристика сенсоров на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного вариантов штамма 32-1 85
4.4. Возможные пути решения практических задач с применением биосенсорного подхода 97
АЛЛ. Деградация целевых соединений сточных вод иммобилизованными на колонке микроорганизмами установки биохимочистки сточных вод (БХО) 100
4.4.2. Использование полученных данных для оценки эффективности процесса очистки стоков в аэротенках установки биохимической очистки 106
4.4.2.1. Исходное состояние установки биохимочистки 106
4.4.2.2. Результаты проведенных технических и технологических мероприятий на сооружениях БХО 111
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 116
6. ВЫВОДЫ 118
7. ЛИТЕРАТУРА 120
8. ПРИЛОЖЕНИЕ 144
8.1. Акт внедрения 144
- Типы преобразователей, используемые в биосенсорах. Электрохимические преобразователи
- Изучение Исследование способности микроорганизмов к деградации толуолсульфоната (ТС)
- Биодеградация ТС с помощью Ctestosteroni BS1310(pBS1010)
Введение к работе
Актуальность проблемы. В условиях современного интенсивного промышленного производства значительно возросла нагрузка на объекты окружающей среды, что выразилось ее значительным загрязнением токсичными соединениями [1-3]. Фенольные и сульфоароматические соединения, которые широко применяются в химической промышленности и в ряде случаев в значительных количествах попадают в водные экосистемы, относятся к классам поллютантов, наносящих существенный ущерб окружающей среде. Так, в мире, согласно литературным данным, ежегодно производится более 50000 тонн фенолов и пентахлорфенолов, 40000 тонн монохлорфенолов, более 2 млн. тонн сульфонатов. Соответственно, высок и уровень загрязнения окружающей среды в процессе производства. В частности, по Российской Федерации в 1999 году в поверхностные водные источники поступило 60 тонн фенолов; только по Архангельской области в 2002 году сброс фенола в поверхностные водные источники составил 5,5 тонн. Выраженная во всем мире тенденция к уменьшению антропогенного воздействия на окружающую среду приводит к ужесточению требований экологического законодательства. На многих предприятиях, в частности, на нефтеперерабатывающих заводах, принадлежащих корпорации Тюменская Нефтяная Компания & British Petroleum(THK-BP), вводятся в действие корпоративные стандарты по охране окружающей среды, соблюдение которых относится к приоритетным направлениям работы корпорации. В связи с этим задача обнаружения токсичных соединений, в частности, фенолов и сульфоароматических, в объектах окружающей среды относится к разряду актуальных. В арсенале аналитических методик обнаружения ксенобиотиков предпочтение отдается простым, надежным и оперативным методам и приборам на их основе. Одним из важных условий является снижение стоимости анализа. Применяемые в настоящее время физико-химические методы (масс-спектрометрия, хроматография, спектральный анализ) достаточно сложны и дорогостоящи [4, 5]. Исследования последних лет показали, что в качестве нового эффективного подхода к определению широкого спектра органических соединений, в том числе - токсичных, в образцах окружающей среды может быть использован метод биосенсорной детекции [6-9]. В этой связи интенсивно разрабатываются новые виды биосенсоров для решения задач экологического контроля. Важная роль в решении задач экологического мониторинга отводится микробным биосенсорам, которые перспективны как анализаторы в силу простоты и надежности конструкции, низкой стоимости биологического материала. Уникальной характеристикой микроорганизмов является их способность окислять широкий спектр органических соединений. Это дает возможность относительно простыми способами, используя принцип регистрации клеточного дыхания, формировать Биосенсоры для детекции различных органических соединений. Вместе с тем, несмотря на актуальность задачи обнаружения фенолов и сульфоароматических соединений, до настоящего времени не были описаны Биосенсоры микробного или другого типов для анализа л-толуолсульфоната, и имеется незначительное число публикаций, посвященных разработке ферментных и микробных биосенсоров для детекции фенола и его производных. Существующее положение в данной области и общая актуальность задачи определили постановку цели и задач исследования.
Цель исследования. Целью работы являлось создание биосенсоров электрохимического типа для детекции сульфоароматических и фенольных соединений на основе бактерий родов Comamonas и Pseudomonas, являющихся деструкторами я-толуолсульфоната и фенола, соответственно.
Были поставлены следующие задачи:
1. На основании имеющихся литературных данных произвести выбор штаммов, обладающих характеристиками, требуемыми для формирования биорецепторного элемента сенсоров для детекции я-толуолсульфоната и фенола и определить вид преобразования сигнала.
Оценить характеристики процесса деградации я-толуолсульфоната свободными и иммобилизованными клетками Comamonas testosteroni BS1310 (pBSlOlO) в периодических и непрерывных условиях. Разработать лабора торные макеты биосенсоров на основе бактерий Comamonas testosteroni BS1310 (pBSlOlO) и бактерий рода Pseudomonas с использованием амперо-метрической детекции (кислородного электрода типа Кларка). Оценить возможность использования колоночного и мембранного сенсоров.
3. Выполнить сравнительную оценку характеристик биосенсоров для детекции я-толуолсульфоната на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного штаммов С. testosteroni BS1310 (pBSlOlO) и для детекции фенола на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного штаммов Pseudomonas.
4. Используя активный ил водоочистных сооружений в качестве биологического материала в реакторе с непрерывной подачей субстрата, оценить параметры процесса очистки промышленных стоков от фенола. На основании полученных данных представить предложения по оптимизации процесса очистки сточных вод нефтеперерабатывающего производства.
Научная новизна работы. На основании имеющихся литературных данных произведен выбор штаммов, обладающих характеристиками, требуемыми для формирования биорецепторного элемента сенсоров для детекции я-толуолсульфоната и фенола, и экспериментально показано, что эффективным типом преобразователя является кислородный электрохимический электрод для регистрации содержания кислорода в среде. Оценены характеристики процесса деградации я-толуолсульфоната свободными и иммобилизованными клетками Comamonas testosteroni BS1310 (pBSlOlO) в периодических и непрерывных условиях. Разработаны лабораторные макеты биосенсоров на основе бактерий Comamonas testosteroni BS1310 (pBSlOlO) и бактерий рода Pseudomonas с использованием амперометрической детекции (кислородного электрода типа Кларка). Выполнена сравнительная оценка характеристик биосенсоров для детекции и-толуолсульфоната на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного штаммов С. testosteroni BS1310 (pBSlOlO) и для детекции фенола на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного штаммов Pseudomonas. Показано, что сенсоры, основанные на плазм идсодержащих бактериях, обладают высокой селективностью в отношении целевых соеди нений, которая резко снижается при использовании бесплазмидных штаммов. Полученные сравнительные оценки субстратной специфичности плаз-мидного и бесплазмдного штаммов носят характер фундаментальных результатов и могут быть эффективно использованы для развития научных основ и практического применения биосенсоров.
Практическая значимость. Метод, основанный на биосенсорной детекции w-толуолсульфоната и фенола, может быть использован в научных исследованиях для определения концентрации указанных соединений в пробах, не содержащих других компонентов; так, метод может быть полезен при решении задач, связанных с оценкой каталитической активности in vivo ферментных систем микроорганизмов-деструкторов я-толуолсульфоната и фенола в процессе их утилизации.
Разработанные модели биосенсоров могут составить основу аналитических приборов для проведения экологического мониторинга, основанных на одновременном измерении проб двумя сенсорами, включающими плазмид-ный и бесплазмидный штаммы, соответственно. Такие системы могут явиться высокоэффективными не только для определения абсолютных значений концентрации поллютантов в образцах, но, в первую очередь, для оценки эффективности процессов, связанных с относительным изменением содержания целевого соединения в образце, например, в процессе очистки сточных вод химических предприятий.
Результаты, полученные при изучении разложения я-толуолсульфоната в лабораторных условиях, могут быть использованы при проектировании промышленных реакторов для разложения ТС и фенола, содержащегося в сточных водах, а также для разработки биосенсора колоночного типа.
Качественная оценка процесса деградации фенола иммобилизованным активным илом позволила представить рекомендации по оптимизации очистки сточных вод нефтехимического предприятия, в результате которых была увеличена на 17% эффективность очистки. Предложен метод оценки окисли тельной активности микроорганизмов активного ила с помощью аналога колоночного сенсора.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
Аэробные микроорганизмы-деструкторы при разложении целевого вещества потребляют кислород. Этот процесс можно использовать при создании микробных сенсоров для детекции целевого соединения. Поэтому поиск штаммов, пригодных для использования в биорецепторах сенсоров целесообразно проводить среди штаммов-деструкторов соответствующих соединений.
Плазмидная детерминированность катаболизма целевого соединения позволяет создавать пару на основе двух вариантов одного штамма, один из которых содержит плазмиду биодеградации, а второй не содержит. В этом случае спектр деградируемых веществ у этих двух вариантов будет отличаться только целевым соединением. Сигнал на целевое соединение в этом случае можно будет отделить от сигналов на мешающие вещества.
Биосенсорный подход применим для решения практических задач с помощью аналога колоночного сенсора на основе бактерий активного ила. Этот сенсор позволяет произвести качественную оценку состояния активного ила аэрируемых биологических очистных сооружений. Кислородный электрод Кларка применим для оптимизации работы аэрируемых биохимических очистных сооружений промышленных предприятий.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, экспериментальной части и обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 144 страницах, содержит 15 таблиц и 22 рисунка. Библиографический указатель содержит 207 источников литературы.
Апробация работы и публикации. Результаты работы были доложены на международных и российских конференциях: "Биокатализ-98" (Пушино, 1998), "Проблемы, способы и средства защиты окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами (3-я Научно-техническая конферен ция, Москва, 1999), Всероссийская конференция с международным участием "Сенсор - 2000" (Санкт-Петербург, 2000), "Проблемы медицинской и экологической биотехнологии" (Оболенск, 2000), "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям" (Пущино, 2001). Всего по материалам диссертации опубликовано 13 работ - 8 публикаций материалов конференций, 3 статьи в журнале «Прикладная биохимия и микробиология», статья в «Известиях ТулГУ», статья в журнале «Экологические системы и приборы».
Типы преобразователей, используемые в биосенсорах. Электрохимические преобразователи
При разработке сенсоров используются электрохимические[8-15], пьезоэлектрические [16-18], оптические преобразователи [19-25], магнитные преобразователи [26], химические сенсоры [27-32].
В биосенсорных аналитических системах широко используются электрохимические преобразователи вследствие простоты исполнения и надежности функционирования. В качестве электрохимических преобразователей используются амперометрические и потенциометрические электроды (Н+, СО2, ЫНз+ - селективные электроды, ионселективные полевые транзисторы), кондуктометрические ячейки [8, 12]. Рабочий диапазон детекции потенцио-метрических сенсоров заключен в пределах от 10" до 10 М, амперометриче- Амперометрический принцип удобен при создании сенсоров на основе аэробных микроорганизмов.
При амперометрическом детектировании измеряемый ток непосредственно определяется скоростью биоэлектрохимической реакции, протекающей на индикаторном электроде [8, 13]. Поверхность амперометрических электродов модифицируется различными способами с целью придания им требуемых качеств и улучшения рабочих характеристик [33]. Для повышения селективности применяется создание специфичных мембран, использование высокоактивных электродных материалов, применение медиаторов [34]. Амперометрические электроды успешно применяются в биологических исследованиях, в частности, в клинической биохимии, где из-за большого числа образцов и необходимости экспресс-анализа многие сложные методы непригодны [8]. Одним из наиболее простых и надежных типов преобразователей является амперометрический метод измерения уровня кислорода в среде. Он широко применяется для создания биосенсоров на основе амперометрическо-го микробных клеток для детекции органических соединений [15].
Сенсоры на основе ферментов, иммунных комплексов, молекул ДНК, животных и растительных клеток, клеточных органоидов
Сенсорные системы на основе ферментов широко используются в медико-биологической практике. Для эколого-аналитического контроля они применяются значительно реже ввиду сложности состава природных и сточных вод и возникающих артефактных сигналов. Кроме того, недостаточно изучено воздействие токсичных соединений на механизм ферментативного катализа. Однако, поскольку ферментные сенсоры обладают высокой селективностью, данное направление является перспективным для экологического мониторинга [34].
Создан ряд ферментных сенсоров для детекции фенола и его производных; в частности, путем иммобилизации тирозиназы в осмиевом полимере на основе поливинилимидазола [35], на стеклоуглеродном электроде [36, 37], в полиэстерсульфоновой кислоте [38], углеродной пасте [39-42], на поверхности графитового электрода [43], на эпоксиграфитные электроды [44-46], в парафин-графитную среду [47], в трвердографитной пасте [41], в металлоугле-родную пасту [48], на карбамид-активированном электроде [49], на твердом графитном электроде [42], в поливиниловый спирт [50]. Сенсор на основе ти-розиназы использовали для определения фенола в проточной системе [51]. Разработан цеолитный сенсор для определения фенола с пределом детекции 0.25x10"9М [52]. Созданы Биосенсоры, в которых тирозиназа коиммобилизо-вана с другими ферментами, в частности, с хинопротеинглюкозодегидрогена-зой [51], глюкозодегидрогеназой [53-55, 39], фенолоксидазой [56], перокси-дазой хрена [57], холинэстеразой [58], полифенолоксидазой [59], глюкозодегидрогеназой [50]. Описан фенольный сенсор на основе лакказы [60]. Пределы детекции для фенола и его гомологов составляли от 20x10 9 до 10"6 М [37, 46, 49, 50, 61-63]. Время ответа для всех описанных сенсоров составляло несколько секунд. На основе тирозиназы предложен биосенсор, чувствительный к цианидам, хлорфенолам, атразину, ряду пестицидов [64]. Для детекции неорганического фосфата разработаны ферментные сенсоры с нижними пределами детекции 10"9 М [65] и 6x10"6 М [66]. Разрабатываются ферментные мультибиосенсоры для одновременного определения глюкозы, этанола, 1-лактата, 1 -малата в образцах вина [67], для определения качества рыбных изделий по детекции продуктов распада белков [68, 69].
Принцип действия иммуносенсоров основан на взаимодействии исследуемого вещества (антигена) со специфически связывающимися с ним партнером (антителом) [8]. Эффективное применение иммуносенсоров в области аналитического контроля связано с высокой специфичностью реакции антиген-антитело и практически неограниченным числом соединений, для которых можно выделить иммунные комплексы [34]. К настоящему времени разработан ряд иммуносенсоров для экологического контроля [70, 71, 8]. Предложены модели иммуносенсоров для определения ароматических соединений, Сахаров, белков [52, 8]. В частности, для детекции 2, 4 - дихлорфенокси-уксусной кислоты [72-74], тринитротолуола [75,76] и гексагидро-1, 3, 5-триазина [76], 4-нитрофенола [77], 2,4-динитрофенола в воздухе [22] и в образцах сточной воды [78] и для оценки общего содержания полициклических ароматических углеводородов в почве [79, 73], детекции микроорганизмов {Salmonella) [80]. Разрабатываются иммуносенсоры для клинической диагностики [81], определения инсулина человека [82], цитокинина [83], гербицидов и пестицидов [79, 81, 84], фенилоина и диоксина [85]. Нижние пределы детекции описанных иммуносенсоров составляют до 10 12М [85]. Описаны иммуносенсоры для детекции неорганических соединений, в частности, нитрата [86, 87] и нитрита [86-88].
Изучение Исследование способности микроорганизмов к деградации толуолсульфоната (ТС)
В работе использован бактериальный штамм Comamonas testosteroni BS1310, содержащий плазмиду катаболизма бензолсульфоната и ТС (pBSlOlO), размером 130 тпн. С. testosteroni - почвенный микроорганизм, грамотрицательная палочка. Штамм выделен из активного ила аэрируемых биологических очистных сооружений ПО "Новомосковскбытхим", г. Новомосковск Тульской области, и предоставлен для исследования лабораторией биологии плазмид ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН. Культуру выращивали на минеральной среде Е с ТС в качестве единственного источника углерода и энергии. В работе использовали я-толуолсульфонат натрия (ТС) (Aldrich, USA, 95%), бактоагар ("TypUSA", FERAK, Berlin (West)).
Полученные клетки отделяли центрифугированием, после чего промывали калий-фосфатным буфером. Осадок суспендировали в том же буфере и использовали в работе. Клетки иммобилизовали в 2%-ный агаровый гель при температуре 45С. Полученный блок геля с иммобилизованными клетками гранулировали, продавливая через сито с размером ячеек 500 мкм. Гранулы агара с иммобилизованными клетками промывали буфером декантацией 3-5 раз в цилиндре объемом 250 мл, отбирая 1-минутную фракцию. Трансформация ТС иммобилизованными и свободными клетками изучалась в периодических условиях на качалке (200 об/ мин) при температуре 26С. В колбы Эрленмейера объемом 750 мл помещали 80 мл буфера, содержащего 109 мг клеток (по сухому весу) и ТС в конечной концентрации 1.25 мМ. Субстрат вносили в виде водного раствора. Из реакционной смеси через определенные промежутки времени отбирали аликвоты водной фазы, в которых определяли содержание ТС.
Трансформация ТС свободными клетками. Процесс осуществляли свободными отмытыми клетками в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 100 мл буфера. ТС вносили в виде водного раствора в ко 42 нечной концентрации 1.25 мМ. Концентрация (по массе сухих клеток) в реакционной среде составляла 0.4 мг/мл. Для контроля динамики процесса через определенные промежутки времени из реакционной среды отбирали пробы объемом 2 мл. Концентрацию ТС измеряли после удаления клеток центрифугированием в течение 15мин при 5000 g. Концентрацию ТС определяли двумя способами: спектрофотометрически, измеряя ОГІ261, или обращенно-фазовой жидкостной хроматографией высокого давления, измеряя оптическую плотность ОГІ254- Значение скорости деградации рассчитывали по максимальному наклону касательной к квазилинейному участку рабочей кинетической кривой. Скорость деградации выражали в единицах удельной активности (нмоль мин" мг"1 клеток (сухой вес)).
Биодеградация ТС с помощью Ctestosteroni BS1310(pBS1010)
В работе использовался С. testosteroni BS1310 (pBSlOlO), использованный нами как биорецептор при формировании сенсора [147] для определения л-толуолсульфоната.
В качестве носителя использовался агар, который является широко применяемым в микробиологической практике препаратом. Водные растворы, содержащие 1.5 - 2% агара, образуют прочные гели, устойчивые в нейтральных растворах. Ранее этот носитель был использован как оптимальный [147] при формировании биосенсора для определения ТС на основе С. testosteroni BS1310 (pBS 1010).
На рис. 1 представлена динамика трансформации ТС свободными и иммобилизованными клетками. Скорость превращения ТС иммобилизованными клетками была несколько ниже, чем свободными. Это, вероятно, может быть обусловлено, диффузионными затруднениями для субстрата в гранулах агарового геля (фактор эффективности составляет 0.8). Потеря активности клеток после иммобилизации может быть обусловлена диффузионными затруднениями для субстрата и/или кислорода в агаровой матрице.
Деградация ТС свободными и иммобилизованными клетками в периодических условиях
Изучена кинетика деградации ТС иммобилизованными и свободными клетками в периодических условиях при перемешивании. Полученные данные представлены на рис. 1. Следует отметить также, что свободные клетки раньше достигают более глубокой степени деградации по сравнению с иммобилизованными.
Показано, что трансформация я-толуолсульфоната как свободными, так и иммобилизованными клетками сопряжена с потреблением кислорода. Скорость потребления кислорода составляет 2 моля на 1 моль ТС. Это согласуется со схемой трансформации ТС до пирувата (мета - путь), показанной ранее для С. testosteroni [159]. Данные представлены в таблице 1.
На кривой 1 показано изменение концентрации ТС в течение эксперимента с иммобилизованными клетками. Наиболее активно ТС разлагался в первые 8 часов эксперимента. В последующие часы концентрация ТС оставалась практически неизменной на уровне 75 мкг/ мл. Это могло произойти вследствие исчерпания ТС в среде или вследствие инактивации клеток.
На кривой 2 показана динамика уменьшения концентрации ТС в эксперименте со свободными клетками. Концентрация ТС достигла постоянного уровня в 50 мкг/ мл в течение 10 часов. Таким образом, можно видеть, что иммобилизованные клетки разлагают ТС более быстро, а свободные - более полно, хотя и за большее время по сравнению с иммобилизованными.
Для исследования ферментативных реакций в клетках в открытых системах наиболее изучен проточный реактор с идеальным вытеснением. Этот тип реактора представляет собой объем, равномерно заполненный клетками, в который с постоянной скоростью подается раствор субстрата. При этом в стационарном состоянии устанавливается постоянный градиент субстрата и продукта реакции, который определяется скоростью протока вводимого субстрата.
