Введение к работе
Актуальность темы. Биотехнологические процессы обеспечивают производство широкого спектра целевых продуктов медицинского, пищевого, кормового, и технического назначения. Ценным продуктом биотехнологии являются макромолекулы запасной природы - полимеры гидроксипроизводных алкановых кислот (полигид-роксиалканоаты) - термопластичные линейные полиэфиры, характеризующиеся способностью разрушаться в биологических средах до конечных продуктов, безопасных для природы. Актуальность перехода на новые, экологические чистые материалы связана с тем, что объемы выпуска синтетических пластмасс приближаются к 300 млн. тонн в год; основная их часть скапливается на свалках и аккумулируется в Мировом океане, создавая глобальную экологическую проблему. Острота проблемы связана также с экономической ситуацией, так как до 98 % полимерных материалов производится из невозобновляемого ископаемого сырья - нефти и газа, запасы которых истощаются.
В настоящее время все большее значение приобретают экологически чистые материалы, источником которых служат биомасса растений и продукты микробиологического синтеза (так называемые биополимеры). Фундаментальные исследования потенциала биологических агентов и биосистем, ориентированные на получение научной основы для развития индустрии экологически чистых полимерных материалов - актуальное и высокорейтинговое направление критических технологий мирового уровня. Освоение биополимеров реализуется в рамках междисциплинарных исследований, главными целями которых являются: поиск и изучение новых биополимеров; получение фундаментальной основы для конструирования биологических систем, эффективно синтезирующих полимеры с заданными свойствами.
Среди применяемых и активно разрабатываемых новых биоразрушающихся полимеров, наряду с полилактидами, - полигидроксиалканоаты (ПГА). Эти полимеры активно исследуются за рубежом; в сфере коммерциализации ПГА заняты многие фирмы и промышленные компании («Монсанто К», «Metabolix Inc.», «Tepha», «Procter & Gambel» и др.). В России индустрия разрушаемых полимеров не создана; исследования, направленные на разработку биотехнологических процессов синтеза собственно ПГА - в сфере внимания нескольких академических институтов (Институт физиологии и биохимии микроорганизмов РАН, Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Институт биофизики СО РАН).
Решающим фактором для широкомасштабного получения и применения ПГА является снижение их стоимости. В связи с тем, что 40-50 % затрат приходится на долю исходного углеродного сырья и до 18-20 % - на процесс экстракции и очистки полимера, магистральное направление исследований, определяющее стратегию промышленного производства ПГА, связано с возможностями расширения сырьевой базы, а также поиском высокопродуктивных штаммов-продуцентов и разработкой эффективных биотехнологий синтеза.
Одними из перспективных продуцентов ПГА являются водородокисляющие бактерии, обладающие способностью синтезировать полимеры различного состава с высокими выходами на смесях СОг и Н2 и также на органических субстратах (Завар-зин, 1979; Шабанов с соавт., 2005). Исследование закономерностей синтеза ПГА на
различных субстратах, проведение сравнительной оценка эффективности технологических режимов необходимы для разработки эффективных технологий получения этих ценных макромолекул. Это определило тематику настоящей работы, направленной на разработку технологии синтеза ПГА за счет привлечения новых штаммов и субстратов, отработки процесса экстракции полимера, проведение технико-экономических исследований в качестве научной основы для получения исходных данных, необходимых для масштабирования технологии.
Цель и задачи исследования: Разработка технико-технологических характеристик процессов биосинтеза полигидроксиалканоатов водородными бактериями на различных субстратах в качестве основы для разработки технологии их получения.
Для достижения цели сформулированы следующие задачи:
изучение кинетических и продукционных показателей бактерий Cupriavidm eutrophiis в лабораторных условиях с использованием автотрофного (смеси Н2, С02 и 02) и гетеротрофного (глюкоза) субстратов;
исследование и отработка режимов (хемостатного, периодического, проточно-периодического) выращивания бактерий на смеси Н2, С02 и 02 для повышения выходов ПГА и сокращения длительности процесса;
изучение влияния физиологической активности инокулята, исходной концентрации клеток в инокуляте на продуктивность синтеза ПГА культурой С. eutrophiis на глюкозе;
разработка и реализация режимов культивирования бактерий С. eutrophus для получения ПГА, различающихся составом мономеров;
сравнительный анализ методов экстракции ПГА с применением различных реагентов
технико-экономический анализ биотехнологических процессов синтеза ПГА на различных субстратах;
- получение исходных данных и разработка технологии производства ПГА.
Научная новизна: Исследована культура бактерии С. eutrophus в различных
режимах выращивания; получены новые данные о закономерностях синтеза полигидроксиалканоатов, составившие основу для разработки технологии их получения. Изучены кинетические и продукционные характеристики культуры в условиях автотрофного (смеси Н2, СОг и 02) и гетеротрофного (глюкоза) питания; определены затраты субстратов на образование ПГА и эффективность их использования. Установлены оптимальные для условия биосинтеза: исходная концентрация и физиологическая активность инокулята, режимы подачи лимитирующего субстрата (азота), стимулирующего внутриклеточную аккумуляцию ПГА. Это позволило разработать хемостатно-периодические режимы синтеза ПГА в автотрофном и гетеротрофном, режимах. Изменение режима углеродного питания, заключающегося в регламентированной подаче в культуру второго углеродного субстрата (валерата, гексаноата, у-бутиролактона), позволило разработать и реализовать технологию получения полимеров, различающихся физико-химическими свойствами. На основании сравнительного исследования режимов экстракции ПГА из биомассы с применением растворителей и поверхностно-активных веществ предложены методы, обеспечивающие полноту извлечения полимера свыше 96 % без существенного изменения молекулярно-массовых характеристик различной чистоты.
Практическая значимость: Выполнен сравнительный технико-экономический анализ лабораторных процессов синтеза ПГА культурой С. eutrophm при различных субстратных сценариях. На основе полученных экспериментальных результатов культивирования бактерий на глюкозе разработана технология, позволяющая повысить выход продукта более, чем в два раза. Технология опытного производства полимеров (ПГА) реализована в проекте «Лаборатория биотехнологии новых биоматериалов».
Положения, выносимые на защиту: В рамках специальности 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология) (п.З - изучение и разработка технологических режимов выращивания микроорганизмов-продуцентов направленного биосинтеза биоразрушаемых полимеров, изучение их состава, технико-экономических критериев оценки; п.4 - изучение и разработка процессов сгущения биомассы, экстракции выделения, фракционирования, очистки контроля целевых продуктов) на защиту выносится:
кинетические и продукционные характеристики хемостатной и периодической культуры Cupriavidm eutrophm, выращиваемой в автотрофных (СОг:02:Н2) и гетеротрофных (глюкоза) условиях питания, на основе которых разработаны режимы культивирования с содержанием ПГА, соответственно, (75±5) и (85±5) % при достигнутых урожаях биомассы до 50 и 110 г/л;
результаты сравнительного исследования методов экстракции ПГА из биомассы бактерий и предложенные методы, обеспечивающие более полное извлечение полимера из биомассы бактерий (96 %) для различных областей применения;
- технико-экономический анализ биотехнологических процессов синтеза ПГА на различных субстратах; технология синтеза полимеров на глюкозе.
Работа выполнена в рамках плановой тематики ИБФ СО РАН (государственная регистрация № 01.200703092) и базовой кафедры биотехнологии СФУ в рамках инновационного проекта «Организация производства разрушаемых биополимеров и изделий из них на новых субстратах, продуктах переработки низкосортных углей» (проект №31 2008 г.); Программы Министерства образования и науки РФ «Развитие потенциала высшей школы» (2008-2011 г.г. проект РНП-11); проекта ККФНПДиНД «Создание GMP пилотного производства разрушаемых биопластиков «Биопластотан» (2011 г.); мега-грантов по Постановлению Правительства РФ от 9.04.2010 г., № 219 «Развитие системы инфраструктурной поддержки исследовательской, инновационной и образовательной деятельности, а так же инновационных проектов и комплексных программ на приоритетных направлениях научно-технического развития, реализуемых по инициативе СФУ на базе технологических платформ» (договор № 13.G38.31. 0009) и № 220 «Для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в Российских образовательных учреждениях высшего профессионального образования» (договор № 11G34.31.0013).
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Международном научном семинаре с молодежной школой «Биотехнология новых материалов и окружающая среда» (Красноярск, 2012); «Лесной и химический комплексы - проблемы и решения» (Красноярск, 2012).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ, в т.ч. 1 статья в специализированном журнале перечня ВАК.
Вклад автора: Планирование и проведение экспериментов по исследованию кинетических и продукционных характеристик культуры, способам экстракции полимеров; обработка и анализ результатов, выполнение ТЭО процесса, участие в проектировании опытного производства полимеров; подготовка публикаций.
Структура работы. Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста и содержит 19 таблиц, 31 рисунок, 3 приложения; включает обзор литературы, описание объектов и методов исследования, результаты и их обсуждение (5 глав), заключение, выводы. Список цитируемой литературы включает 149 источников, в т.ч. 114 зарубежных.
