Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы
1. Биосинтез ксиланаз микроорганизмами и их свойства 9
1.1. Характеристика грибных ксиланаз 9
1.1.1 Ксиланазы грибов 9
1.1.2 Ксиланазы грибов Trichoderma 11
1.2. Характеристика бактериальных ксиланаз 20
1.2.1 Ксиланазы бактерий 20
1.2.2 Ксиланаз бактерий Bacillus 21
1.3. Методы анализа пентозанов и ксиланазной активности 24
2. Применение ферментных препаратов ксиланаз 31
2.1. Применение ксиланаз в кормах сельскохозяйственных животных 31
2.2. Анализ ксиланазной активности в кормах 42
2.3. Применение ксиланаз в перерабатывающей промышленности 43
Заключение 47
CLASS Экспериментальная CLASS часть
Материалы и методы исследований 48
Результаты исследований
1. Скрининг микроорганизмов на способность гидролиза пентозанов 65
1.1. Скрининг ксиланазной активности грибов Trichoderma 65
1.1.1. Культивирование продуцентов на жидких средах 65
1.1.2. Исследование изменения вязкости растворов, содержащих пентозаны под действием ферментов 67
1.2. Скрининг ксиланазной активности бактерий Bacillus 68
1.2.1. Культивирование продуцентов на жидких средах 69
1.2.2. Исследование изменения вязкости растворов, содержащих
пентозаны под действием ферментов 70
2. Оптимизация состава питательных сред для индукции биосинтеза ксиланаз продуцентами 71
2.1. Оптимизация содержания ксиланов и белка в питательной среде 71
2.2. Использование целлюлозы для синтеза ксиланаз микроорганизмами 79
2.3. Роль углеводных мономеров в качестве регуляторов биосинтеза ксиланаз 84
2.4. Определение оптимального источника азота 88
2.5.Определение оптимального состава синтетических сред для максимальной продукции ксиланаз 94
2.5.1 Состав сред для грибов Trichoderma 94
2.5.2 Состав сред для бактерий Bacillus 98
3. Характеристика ксиланаз, полученных на природных средах, содержавших пентозаны 102
3.1. Получение сред, содержащих пентозаны 102
3.2. Биосинтез ксиланаз грибами Trichoderma 103
3.3. Биосинтез ксиланаз бактериями Bacillus 105
3.4. Ксиланазы изолятов Trichoderma 106
3.4.1. рН оптимум ксиланаз 106
3.4.2. Влияние температуры на активность ксиланаз 107
3.5. Ксиланазы бактерий Bacillus 111
3.5.1. рН оптимум ксиланаз 111
3.5.2 Влияние температуры на активность ксиланаз 112
4. Применение ксиланаз в кормовых рационах 116
4.1. Увеличение гидролизуемости при добавках ксиланаз в зерновые рационы 116
4.2. Применение ксиланаз при гидротермической обработке зерновых рационов 121
Обсуждение результатов 129
Выводы 143
Литература 144
- Методы анализа пентозанов и ксиланазной активности
- Оптимизация содержания ксиланов и белка в питательной среде
- Влияние температуры на активность ксиланаз
- Увеличение гидролизуемости при добавках ксиланаз в зерновые рационы
Введение к работе
Актуальность проблемы Установление закономерностей биосинтеза ксиланаз грибами и бактериями в настоящее время является широко исследуемой и актуальной проблемой. Все большее применение в процессах переработки сельскохозяйственного сырья находит ферментативный гидролиз. Ксиланы являются компонентами зерновых, гидролиз которых осуществляют ксиланазы, синтезируемые грибами и бактериями.
При исследовании биосинтеза ксиланаз нами использованы культуры известного продуцента целлюлаз и геммицеллюлаз гриба Trichoderma и бактерий p. Bacillus, у которых обнаружена способность к синтезу ксиланаз (Hidenori Т. et al., 2000, Dhillon A, Khanna S. et al. 2000, Sa-Pereira. et al. 2002). При исследовании синтезированных ксиланаз, нам представлялось важным провести изучение влияния рН и температуры на их каталитические свойства.
Цель и задачи исследования Целью работы было установление закономерностей биосинтеза ксиланаз грибами Trichoderma и бактериями p.Bacillus, а также определение их способности увеличивать гидролизуемость питательных веществ при добавке в кормовые рационы.
В работе решались следующие задачи:
Скрининг представителей рода Trichoderma на наличие способности к биосинтезу секретируемых ксиланаз.
Скрининг представителей рода Bacillus на наличие способности к биосинтезу секретируемых ксиланаз.
Изучение закономерностей биосинтеза ксиланаз Trichoderma и p. Bacillus.
Изучение каталитических свойств ксиланаз Trichoderma и p.Bacillus.
Изучение увеличения гидролизуемости питательных веществ кормовых рационов при добавлении ксиланаз Trichoderma np.Bacillus.
Научная новизна работы Установлено принципиальное различие закономерностей биосинтеза ксиланаз у представителей родов Trichoderma и Bacillus. При этом впервые показано, что гриб Trichoderma reesei F-2433 обеспечивает максимальный синтез ксиланаз на среде, содержащей только белок. При наличии в среде культивирования ксилана, наряду с белком происходит снижение синтеза ксиланаз, таким образом, показан конститутивный механизм синтеза фермента. Культура Bacillus circulans на средах, содержащих белок и ксилан, показала индуктивный механизм синтеза ксиланаз. При исследовании В. circulans впервые установлено, что при замене белка в культуральной среде его полным гидролизатом, содержащим соответствующие аминокислоты, происходит резкое снижение синтеза протеолитических ферментов. Результаты проведенных исследований впервые показали, что ксилан является более эффективным индуктором синтеза целлюлаз, чем целлюлоза, при культивировании В.circulans на белоксодержащих средах. Впервые проведено исследование влияние рН и температуры, соответствующее параметрам среды желудка моногастричных, и гидротермической обработки на изменение активности ксиланаз, синтезированных представителями рода Trichoderma и Bacillus.
Практическая ценность работы Получены данные о закономерностях биосинтеза ксиланаз Trichoderma и Bacillus, позволяющие получать ксиланазы с заданным спектром сопутствующих активностей. Проведено исследование влияние рН и температуры, соответствующее параметрам среды желудка моногастричных и гидротермической обработки на изменение активности ксиланаз, синтезированных представителями рода Trichoderma и Bacillus. Разработаны методики снижения антипитательного действия пентозанов при помощи ксиланаз, что позволит специалистам сельского хозяйства правильно подбирать дозировки препаратов ксиланаз в зерновые рационы, содержащих пентозаны.
Апробация работы Материалы диссертации доложены на 4-х международных конференциях в Москве в 2001, 2003 и 2-х в 2004 г.; на 3-х конференциях в Казани в 2002, 2004, 2005 г.; на итоговых научных конференциях в ТатНИИСХ РАСХН 2003 и 2004 г.
Публикации По материалам диссертации опубликовано 15 работ.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Методы анализа пентозанов и ксиланазной активности
С точки зрения биохимии пентозаны принадлежат к классу углеводов и им характерны все их химические свойства. Для обнаружения углеводов используют ряд характерных для них реакций. Количественное определение большинства углеводов основано на их свойстве гидролизоваться разбавленными кислотами до конечного продукта- простых Сахаров и на учете последних. Углеводы обладают оптической активностью, и это свойство также используется для количественного их определения.
Методы ступенчатого растворения и гидролиза углеводов. Отдельные группы углеводов растворяются в различных растворителях и при разных условиях. Поэтому существуют много схем последовательного определения полисахаридов, но ни одну из них нельзя рассматривать как идеальную, так как все они имеют переменную, иногда большую погрешность, в зависимости от исследуемого образца. Общая структура последовательного извлечения углеводов включает извлечение из образца спиртом моносахаридов, кипячение нерастворенного остатка с водой для извлечения пектиновых веществ, затем, применяя растворы щелочи разных концентраций, извлекают геммицеллюлозы, в том числе пентозаны, затем гидролизом серной кислотой определяют целлюлозу. Погрешности этих классических схем особенно велики при определении пентозанов так как большая часть пентозанов растворяется в воде.
Метод гидролиза пентозанов и определения фурфурола. Пентозаны ржаного зерна являются полисахаридами, которые при кипячении с кислотами, т.е. при гидролизе дают главным образом пентозы, а именно арабинозу и ксилозу. В состав слизей входят также глюкоза до 20%, немного фруктозы и галактозы (Казаков Е.Д и др. 1980). Действие кислот на гексозы и пентозы очень характерно и может быть применено для их распознавания, а именно: при нагревании пентоз с кислотами легко отделяется вода и образуется летучий гетероциклический альдегид- фурфурол. Образующийся фурфурол легко обнаружить, например, при помощи реакции конденсации с анилином, дающей соединение красного цвета. Действие же кислот на гексозы хотя сначала и ведет к образованию оксиметилфурфурола, но так как последний не прочен, то при кипячении с разбавленными кислотами он разлагается на левулиновую и муравьиную кислоты (Чичибабин А.Е.,1954; Шарков В.И. и др. 1973; Казаков Е.Д. и др. 1980).
Метод газовой хроматографии При использовании газовой хроматографии процедура подготовки требует много времени, однако есть возможность точного определения содержания арабинозы и ксилозы, выяснения состава и строения пентозанов. Строение пентозанов возможно изучить при помощи неполного ферментного гидролиза и изучения его продуктов (Nishimura Т. et al. 1998). Описанные исследования проводились с использованием газовой хроматографии, что требовало применения специальной методики подготовки образцов к анализу. Упаривание растворов олигосахаридов проводилось при пониженном давлении и температуре 40С с использованием аппарата для удаления растворителей очищенным воздухом (York W.S. et al. 1985). Алдитол ацетаты приготавливались и анализировались, как описано (Albersheim P. et al. 1967), за исключением, что гидролиз в 2М CF3CO2H проводили в течение 2 часов, и ацетилирование альдитолов проводили 20 минут. Газо-жидкостное хроматографирование (GLC) было выполнено в изотермических условиях при 230С на Shimadzu GC14A снабженным колонкой 30м 0.25мм (Nishimura Т. et al. 1998). О-метилирование было проведено по модифицированному Санфордом (Sandford Р.А. et al. 1966) методу Хакомори (Hakomori S. et al. 1964), а очистка О-метилированных олигосахаридов гликозил-альдитолов как описано (Waeghe Т.J. et al. 1983).
Метод ВЭЖХ. Наиболее простой и быстрый метод высокоэффективная анионообменная хроматография, позволяющая определять после гидролиза содержание моносахаридов при помощи флуорисцентного детектора.
Метод анионообменной хроматографии принадлежит к разновидностям высокоэфективной жидкостной хроматографии. Для проведения анализа NSP с использованием этого метода необходимо также как и в случае с газовой хроматографией провести исчерпывающий гидролиз полимеров NSP до моносахаридов, а затем уже проводить их количественный анализ и делать соответствующие выводы о составе исследуемых полисахаридов.
Метод ИК-спектроскопии Флэмм (Flamme W. et al. 2002) примененил для анализа содержания растворимых пентозанов метод ИК-спектроскопии. Анализ содержания пентозанов проводился с использованием вышеуказанных методов, а затем после снятия ИК-спектра путем сопоставления результатов методик и ИК-спектра образцов строилась калибровочная прямая для определения пентозанов методом ИК-спектроскопии.
Штаммы родов Trichoderma, Aspergillus и Bacillus наиболее часто используются в качестве источников ксиланаз. Они всегда синтезируют смеси экзоферментов. Компоненты этих смесей имеют различные биохимические свойства, исходя из их природы и происхождения. Это необходимо учитывать, исследуя их гидролитическую активность.
Качественный контроль коммерческих гидролазных препаратов включает измерение их энзиматической активности. Это может быть достигнуто использованием модельных субстратов, например пшеничного арабиноксилана для оценки ксиланазной активности, р-глюкана ячменя для оценки (З-глюканазной активности и карбоксиметилцеллюлозы для целлюлитической активности. Перечень индивидуальных гидролазных активностей определяет энзиматическую активность исследуемого образца. В течение времени гидролитические ферменты деградируют полисахаридные цепи и увеличивают количество мелких фрагментов, что меняет физические и химические параметры системы. Изменение свойств системы за счет действия фермента и является точкой приложения различных методов. Некоторые методы, применяемые при оценке гидролазной активности, используют явление уменьшения вязкости гидролизуемого раствора. Другими методами исследуют увеличение восстановительных эквивалентов в исследуемом растворе, используя окислители. Каждая разорванная гликозидная связь создает альдегидную группу, которая легко окисляется. Еще одна группа методов использует для анализа окрашенные субстраты. Гидролазы прогрессивно производят водорастворимые окрашенные фрагменты, что приводит к увеличению абсорбции супернатанта.
Для коммерческих энзимных препаратов превалируют методы, основанные на измерении редуцирующих эквивалентов. Для кормовых образцов более предпочтительны вискозиметрические и колориметрические методы. Метод, использующий 3,5-динитросалициловую кислоту (DNSA) для определения восстанавливающих эквивалентов (Somogyi М.,1952, Miller G.L.,1959), быстрый, но необходимо обращать внимание на присутствие в растворе некоторых ионов, которые негативно влияют на точности результатов (Robyt J.F. et al. 1972, Forouni E. et al. 1983).
Оптимизация содержания ксиланов и белка в питательной среде
В главе 2.5 описаны, проведенные нами исследования биосинтеза ксиланаз на химически чистых средах, содержавшие сравнительный анализ различных химически чистых субстратов в качестве компонентов сред. Проведен статистический анализ влияния состава синтетических сред на выход ксиланаз при культивировании грибов с помощью программном пакета Microsoft Excel. Результаты позволили сделать вывод, что оптимальным субстратом для синтеза ксиланаз грибами Trichoderma являются белоксодержащие среды с незначительным содержанием ксиланов, а для культивирования бактерий Bacillus содержащие 5 г/л белка и 5 г/л ксиланов в качестве индуктора.
Для получения питательной среды максимально близкой по составу к оптимальной были использованы экстракты ржаных зерен и отрубей. Рожь является отличным источником пентозанов и растворимых белков и может быть при соответствующей обработке использована для подготовки культуральных сред необходимого состава.
Особенностью сред для синтеза ксиланаз грибами Trichoderma является низкое содержание пентозанов и высокое содержание белка. Так как рожь содержит достаточно крупную фракцию водорастворимых белков, около 5% АСВ и всего лишь 2% АСВ водорастворимых пентозанов было принято решение об использовании для получения сред для грибов из зерна ржи. В процессе получения среды для культивирования грибов была проведена экстракция предварительно размолотой ржи раствором аммиака рН=10 с гидромодулем 1:10, при комнатной температуре и постоянном перемешивании в течение 1 часа. Экстракт отделяли от нерастворимого остатка центрифугированием. Доводили рН до 6.0 серной кислотой и использовали в качестве основы среды для культивирования грибов Trichoderma. В полученном экстракте содержится 0.2% пентозанов, а также растворимая фракция белков 0.5% и (NH4)2S04 0.5%, а также незначительное количество других веществ. Основным источником углерода в среде являлись пентозаны ржи, белок являлся источником азота.
Оптимальные среды для культивирования бактерий содержат значительно больше пентозанов. Для получения таких концентраций пентозанов в экстракте решено было использовать ржаные отруби. Как описано в главе 1.3 отруби содержат 26%АСВ пентозанов. Для извлечения пентозанов из сырья решено было использовать щелочную экстракцию. Подготовка культуральной среды для бактерий включала экстракцию ржаных отрубей щелочным раствором аммиака, при рН=10, отделение экстракта, подкисление серной кислотой до рН Среду готовили следующим образом. Ржаные отруби экстрагировали гидромодулем 1:5 при постоянном перемешивании в течение 1 часа при комнатной температуре. Экстракт отделяли от нерастворимого остатка центрифугированием. Затем экстракт разбавлялся в два раза до необходимой концентрации компонентов.
Экстракт, после корректировки серной кислотой до рН 7.5 использовали в качестве среды для культивирования бактерий p. Bacillus, содержащей растворенные пентозаны 0.5%, белок 0.2% и (NH4)2S04 0.3% для продукции ксиланаз.
В результате проведения скрининга грибов Trichoderma, описанного в главе 1.1 выявлены наиболее активные штаммы продуценты, выделенные из почв РТ, Т.2,14,18 и установлена высокая ксиланазная активность штамма промышленного продуцента Treesei. Эти штаммы были использованы при биосинтезе препаратов грибных ксиланаз. Состав экспериментальной среды, щелочного экстракта ржи: пентозаны -0.2%, белок -0.5%, (NH4)2S04 -0.5%, рН -6.0. Характеристики ферментных препаратов, полученных при культивировании грибов Trichoderma, приведены в таблице 20. Из характеристик видно, что ксиланазная активность полученных на экстрактах ржи препаратов значительно ниже активности ксиланаз, полученных при культивировании T.reesei на средах, составленных из химически чистых веществ, 3.60 и 6.06 IU/ml соответственно. Аборигенный изолят Т.302 показал наибольшую активность синтеза ксиланаз, из почвенных изолятов 8.82 IU/ml. Штамм Т. 18, разрешенный к применению в кормах, синтезировал при культивировании 2.30 IU/ml активности ксиланаз. Целлюлазная активность разных штаммов заметно колеблется. Наибольшую активность синтезированных целлюлаз проявил штамм T.reesei 1.58 IU/ml, известный продуцент целлюлаз. Аборигенный изолят Т. 302 показал также наибольшую активность синтеза протеаз 0.08 U/ml. Протеолитическая активность всех остальных полученных препаратов оказалась низкой и равной 0.01-0.03 U/ml.
Влияние температуры на активность ксиланаз
Зерна ржи труднопереваримы по причине высокого содержания пентозанов. Также в связи с высоким содержанием пентозанов, вызывающих повышение вязкости содержимого пищеварительного тракта животных рожь не может применяться в качестве основы кормовых рационов, она применяется только в качестве их компонентов. Нормирование добавок ржи в корма производится в соответствии с ГОСТ 9268-90,51550-2000, 18221-99.
Для адекватной оценки кормовых достоинств зерновых злаков нами были проведены биохимические исследования состава всех параметров, входящих в полный зоотехнический анализ (ПЗА). Для получения более полного представления о составе зерна, кроме показателей ПЗА нами был более глубоко изучен состав углеводной фракции: было проанализировано содержание в исследуемых образцах крахмала и пентозанов.
Основными зерновыми злаковыми культурами, выращиваемыми сельским хозяйством РТ являются пшеница, рожь и ячмень. Для оценки кормовых характеристик было проведено исследование наиболее распространенных в сельском хозяйстве РТ сортов злаков. Исследованы 4 сорта озимой ржи, выведенных в ГНУ ТатНИИСХ РАСХН: «Эстафета Татарстана», «Радонь», «Татарская» и «Огонек». Исследованные сорта ржи включены в гос.реестр и допущены к использованию в Северном, Средневолжском, Волго-Вятском, Центральном и Уральском регионах РФ. Зерно, исследованных сортов ржи, используется в продовольственном и зернофуражном назначении. Также проведен анализ фуражных образцов пшеницы, ржи и ячменя. Результаты ПЗА приведены в таблице 22.
Исследования углеводного состава зерна проведены методом высокоэфективной жидкостной хроматографии, после проведения мягкого кислотного гидролиза (Bartolome В.,2002). В результате проведения хроматографического исследования гидролизата получены концентрации моносахаридов ксилозы, арабинозы, глюкозы и мальтозы, входивших в исходном материале в состав крахмала и пентозанов. Исходя из этих концентраций и молекулярных масс сахаридов, вычислено содержание этих полисахаридов в исследованных образцах зерна (Maes С.,2002). Результаты анализа приведены в таблице 23. Из результатов проведенных анализов видно, что в составе зерна всех злаков содержится довольно значительное количество пентозанов. Наибольшее их количество до 11.4% содержат фуражные сорта ржи, именно это обстоятельство не позволяет использовать ее в качестве основы кормовых рационов сельскохозяйственных животных. Несколько меньше пентозанов содержит пшеница до 6.8% и ячмень, до 7.2%. Таким образом, из состава зерна основных районированных в РТ злаковых культур можно сделать заключение о целесообразности исследования применения ксиланаз в составе кормовых рационов на основе злаков.
Нами проведены исследования влияния содержания ржи в кормовых рационах моногастричных, на их переваримость в модельных экспериментах in vitro (Dung N.N.X.,2002). Результаты приведены в таблице 24. Как показали проведенные исследования, переваримость рационов резко снижается при содержании ржи более 20%. При увеличении доли ржи до 70% «переваримость рационов уменьшается на 30%. Для изучения возможности уменьшения антипитательного эффекта пентозанов в зерновых рационах, содержащих рожь, нами проведены эксперименты по изучению влияния добавок синтезированных грибных и бактериальных ксиланаз на переваримость кормов в модельных экспериментах in vitro. Для проведения анализа на переваримость in vitro рационов с добавками ксиланаз, зерно дробилось, и к нему добавляли необходимое количество культуральной жидкости Trichoderma и Bacillus, исходя из ее активности. Образец, полученного таким образом корма, тщательно перемешивался и использовался для моделирования переваримости in vitro в рационах моногастричных животных. Как показали проведенные исследования, при применении ксиланаз, синтезированных бактериями Bacillus, в виде добавок к кормам, достоверного увеличения переваримости рационов, не отмечено. Ксиланазы грибов Trichoderma, при добавке в корма моногастричных животных, содержащие рожь, уменьшают антипитательный эффект пентозанов и увеличивают их переваримость (табл.25).
Увеличение гидролизуемости при добавках ксиланаз в зерновые рационы
Для получения ферментов микроорганизмов препаратов нами было проведено культивирование грибов Trichoderma и бактерий p.Bacillus на средах, содержащих пентозаны ржи. Культуральные среды получали щелочной экстракцией дробленого зерна ржи, с последующим отделением, нейтрализацией и корректировкой рН раствора до оптимальных для продуцентов значений. В ходе культивирования продуцентов проводился анализ уменьшения содержания в среде пентозанов, позволявший судить о скорости и глубине гидролиза этих полисахаридов и их ассимиляции в метаболизм продуцентов в качестве источника углерода.
Результаты показали, что в среднем, деструкция и ассимиляция пентозанов заканчивается в течение 3-х суток. Штаммы T.reesei ассимилирует 53% изначально, содержавшихся в среде пентозанов за 2-е суток культивирования и накапливает 0.38 г мицелия. При культивировании Т. 18 происходит потребление 46.0% пентозанов за 2-е суток, при этом накапливается 0.36 г биомассы, однако медленная ассимиляция пентоз из культуральной жидкости продолжалась вплоть до 4 суток культивирования, включительно. Полученные в ходе ферментации культуральные среды, очищенные от биомассы продуцента исследовали на способность уменьшать вязкость ржаных экстрактов.
Было проведено изучение кинетики снижения вязкости растворов пентозанов ржи препаратами, полученными при культивировании штаммов Т. 2,3,10,14,16,18,23, выделенных из местных почв, а также промышленного продуцента T.reesei. Результаты показали, что лучше других снижает вязкость ржаного экстракта препарат, полученный с использованием промышленного штамма Т. reesei.Препарат уменьшал вязкость за 2.5 часа на 36%. Близкие результаты показали препараты грибов, выделенных из почв Т. 2,18 25-30% исходной вязкости.
Среди исследованных штаммов p.Bacillus было установлено, что максимальную глубину и скорость ассимиляции пентозанов из раствора проявляют штаммы В. cereus, B.circulans, , В. intermedins 3 —19 потребляющие около 90%, содержащихся в растворе пентозанов. Эти же штаммы проявили наибольшую способность к деструкции пентозанов, проявлявшуюся в снижении вязкости их растворов. Самую лучшую способность продемонстрировал препарат B.circulans, при применении которого вязкость ржаного экстракта снижалась за 2 часа на 87%. Препараты В. cereus и В. intermedins 3-19 также проявили высокую активность, снизив вязкость в тех же условиях на величину около 82%).
В целом проведенный скрининг показал существенно более высокие способности бактериальных препаратов к гидролизу экстракта ржи, что объясняется более широким спектром синтезируемых бактериями гидролитических ферментов в сравнении с грибами.
По результатам проведенного обширного скрининга бактериальных и грибных продуцентов ксиланаз нами для дальнейших исследований по оптимизации культуральных сред были отобраны, проявившие лучшие показатели гидролиза и ассимиляции пентозанов штаммы T.reesei, Т. 2,14,16 и В. cereus, B.circulans,, В. intermedins 3 —19.
В настоящее время в литературе имеется достаточно много данных о влиянии состава среды на биосинтез гидролитических ферментов штаммами Trichoderma и Bacillus (Turker М. et al. 1987, Haapala R. et al. 1996, Bailey M.J. et al. 1993, Cobos A. et al. 2003). Однако все проведенные исследования, как правило, содержат исследования влияние отдельных компонентов сред, что делает невозможным понять целостную картину индукции синтеза экзоферментов грибами Trichoderma, остается практически неизученным вопрос влияния источника азота на активность синтеза экзофермермент ов. Нет исследований, посвященных влиянию белка и аминокислот в среде, а также исследований культивирования грибов Trichoderma на средах, содержащих белок в качестве единственного источника углерода и азота. Для того, чтобы представить целостную картину влияния состава среды нами проведены исследования биосинтеза продуцентами ферментных препаратов на культуральных средах, содержащих химически чистые вещества. В качестве компонентов культуральных сред, необходимых для роста продуцентов мы использовали наиболее распространенные в природе источники углерода, использующиеся в метаболизме микроорганизмов- это структурные полимеры растений ксилан, целлюлоза, а также их мономеры ксилоза и глюкоза. В качестве источника азота исследовали белок, гидролизат белка и сульфат аммония, в качестве неорганического источника. Также проведен эксперимент, в котором белок являлся единственным источником углерода и азота в среде.
Исследовано влияние содержания белка и ксилана в культуральной среде на ксиланазную активность синтезированных препаратов T.reesei. Исследования показали, что максимальная активность ксиланаз 6.06 IU/ml достигается при культивировании Т. reesei на среде содержавшей только белок в количестве 5 г/л. Отмечена отрицательная корреляция ксиланазной активности и содержания ксилана в исходной среде. Такую же тенденцию сохраняет и специфическая ксиланазная активность. Максимальные уровни специфической ксиланазной активности отмечены при отсутствии ксиланов в растворе. Это вызвано резким снижением роста культуры гриба и интенсификации синтеза ксиланаз и целлюлаз. при отсутствии в среде углеводов.
При исследовании протеолитической активности препаратов T.reesei четко проявился эффект ингибирования синтеза протеаз, содержащимся в среде углеводом. При содержании в среде более 5 г/л ксилана биосинтез протеаз культурой практически прекращается. Активность не превышала 0.05 U/ml. При снижении содержания углевода в среде ниже 5 г/л активность протеаз резко возрастала, достигнув 0.32 U/ml при отсутствии углевода в исходной среде.
T.reesei является известным продуцентом целлюлаз, широко применяемом в промышленном синтезе коммерческих препаратов. Большинство технологий биосинтеза целлюлаз проводятся на природных средах, содержащих целлюлозу, геммицеллюлозу, белок растительного происхождения. Нами были проведены сравнительные исследования целлюлозы и ксилана, в качестве источников углерода, при синтезе целлюлаз T.reesei на средах, содержавших белок, в качестве источника азота. Как показали результаты, проведенных нами исследований синтез как ксиланаз, так и целлюлаз Т. reesei активнее происходит на среде, содержащей белок и ксилан, чем белок и целлюлозу. Целлюлоза вызывает заметную активизацию роста биомассы гриба T.reesei. При культивировании T.reesei на среде, содержавшей 5 г/л белка и 5 г/л ксилана, за 4 суток, накапливалось биомассы 1.88 мг/мл, а при использовании целлюлозы вместо ксилана, в тех же условиях накапливалось 4.56 мг/мл. Также при использовании целлюлозы проявляется пониженный уровень синтеза ксиланаз 5.75 IU/ml на ксилане и 3.90 IU/ml на целлюлозе, что вызывает 4-х кратное снижение специфической активности ксиланаз. Целлюлоза является полимером глюкозы, которая при ферментации, вероятно, выделяется в культуральную среду, ингибирует синтез экзоферментов и ускоряет рост биомассы. Ксилан, являясь полимером ксилозы, не ингибирует синтез экзоферментов и поэтому является более эффективным источником углерода при синтезе целлюлаз и ксиланаз.
При исследовании культуры B.circulans показали нарастание ксиланазной активности препаратов при увеличении содержания ксиланов в интервале 0-5 г/л. Дальнейший медленный рост прослеживается вплоть до 10 г/л. Оптимальное содержание белка 5 г/л.
