Введение к работе
Актуальность темы исследования. Большие запасы возобновляемой растительной биомассы (около одного триллиона тонн) делают её привлекательным сырьём для получения различных полезных продуктов. Широкое разнообразие ферментов и их характеристик предоставляет большие возможности для эффективной переработки растительного сырья в сахара. Глюкоза, получаемая ферментативным путём из целлюлозы, может быть конвертирована с помощью микроорганизмов в этанол, бутанол, ацетон, органические и аминокислоты, полимеры и многие другие продукты микробного синтеза. Таким образом, растительная биомасса может служить (частичной) альтернативой нефти, которая в настоящее время является основным сырьем при производстве различных продуктов органического синтеза, а также для получения моторного топлива.
К ферментам, осуществляющим конверсию целлюлозосодержащего сырья (ЦСС), относятся различные эндоглюканазы (ЭГ) и целлобиогидролазы (ЦБГ), осуществляющие деструкцию нерастворимой целлюлозы, а также ксиланазы, гидролизующие ксилан (гемице ллю лозу). Однако в последнее время была наглядно продемонстрировано существенное влияние на общую кооперативную эффективность процессов биоконверсии ЦСС «вспомогательных» ферментов (реализация т.н. boosting эффекта), осуществляющих гидролиз растворимых олигосахаридов (например, Р-глюкозидаз и Р-ксилозидаз), а также ферментов негидролитической природы (полисахаридмонооксигеназ, ПМО).
Целлюлолитические ферменты и многие другие карбогидразы продуцируются преимущественно микроскопическими грибами. Мутантные или рекомбинантные штаммы грибов рода Trichoderma играют ведущую роль среди промышленных продуцентов целлюлолитических ферментов, что объясняется, во-первых, их высокой секреторной способностью, а, во-вторых, разнообразием состава продуцируемого ферментного комплекса. Поэтому неудивительно, что ферментные препараты целлюлаз и гемицеллюлаз на основе грибов Trichoderma выпускаются в разных странах ведущими производителями промышленных ферментов, в частности, Novozymes (Дания), DuPont&Genencor (США) и др. При этом следует подчеркнуть, что поиск новых продуцентов ферментов, предназначенных для гидролиза ЦСС, по-прежнему является актуальной задачей. Грибы рода Penicillium, Myceliophtora (ранее Chrysosporium) и др. могут стать достойной альтернативой штаммам рода Trichoderma, поскольку по наиболее важным биотехнологическим критериям не уступают, а иногда и превосходят лучшие из известных штаммов Trichoderma.
Выбор для гидролиза ЦСС высокоэффективных целлюлолитических ферментных препаратов, представляющих собой многокомпонентные ферментные
комплексы, зависит от ряда факторов и, в значительной степени, от сбалансированности состава ферментного комплекса и уровня активности его индивидуальных компонентов. Очевидно, что для осуществления максимально эффективного гидролиза ЦСС первостепенное значение приобретает решение задачи, связанной с пониманием оптимального качественного и количественного состава ферментного комплекса. Поэтому в области ферментативной конверсии ЦСС активно ведутся фундаментальные исследования и прикладные разработки не только по поиску и получению новых высокоактивных микроорганизмов-продуцентов, но также по поиску новых ферментов, как с высокой гидролитической способностью, так и обладающих «вспомогательной» функцией в процессах гидролиза. Результатом таких исследований могут быть ферментные препараты, способные осуществлять высокоэффективную конверсию различных видов ЦСС. Исследования, проведенные в нашей лаборатории ранее, показали, что ферментные комплексы, секретируемые грибом Penicillium verruculosum могут стать достойной альтернативой современным промышленным ферментным препаратам. Поэтому в диссертационной работе мы проводили исследование по поиску возможностей дальнейшего увеличения эффективности ферментного комплекса P.verruculosum в процессах биоконверсии ЦСС.
Цели и задачи исследования. Целью диссертационной работы являлось получение высокоэффективных целлюлолитических ферментных препаратов с увеличенной гидролитической активностью по отношению к различным видам ЦСС. Для этого было необходимо решить следующие задачи:
Сопоставить гидролитическую активность и компонентный состав новых промышленных ферментных препаратов, выпускаемых ведущими зарубежными компаниями, предназначенных для гидролиза ЦСС;
Определить оптимальный состав ферментного препарата для гидролиза ЦСС;
Провести сравнительный анализ лучшего промышленного ферментного препарата и лабораторного препарата на основе гриба рода P.verruculosum по таким параметрам как компонентный состав и гидролитическая активность по отношению к различным видам ЦСС;
Создать новый продуцент P.verruculosum и получить новый целлюлазный ферментный препарат с увеличенной гидролитической активностью, исследовать его состав, свойства и возможности применения в процессах биоконцерсии ЦСС.
Научная новизна и практическая значимость работы. На основании результатов анализа компонентного состава различных ферментных комплексов, продуцируемых грибами родов Trichoderma и Myceliophtora, обладющих высокой гидролитической активностью по отношению к различным видам ЦСС, выявлены общие закономерности их «конструирования»: содержание целлобиогидролаз - от 30
до 60%, эндоглюканаз - от 10 до 30%, Р-глюкозидаз - от 5 до 20%, ксиланаз - от 5 до 10% от общего содержания белка. Исследовано влияние полисахаридмонооксигеназ грибов Myceliophtora thermophila, Trichoderma reesei и Thelavia terrestris как нового компонента целлюлазного комплекса на эффективность гидролиза различных видов ЦСС под действием ферментных препаратов. Установлено, что полисахарид-монооксигеназы являются важным компонентом целлюлазного комплекса и оказывают существенное положительное влияние на увеличении эффективности ферментативной конверсии ЦСС. Впервые на основе рекомбинантного штамма гриба Р .verruculosum получен ферментный препарат, имеющий в своем составе полисахаридмонооксигеназу из М. thermophila, определен его компонентный состав, биохимические свойства и показано, что этот препарат значительно эффективнее гидролизует различные виды ЦСС (в случае микрокристаллической целлюлозы выход продуктов гидролиза увеличивается на 60%, для различных видов растительного сырья - на 40%), чем препарат, полученный на основе исходного штамма P.verruculosum. Ферментный препарат P.verruculosum, содержащий полисахаридмонооксигеназу М. thermophila по своей эффективности гидролиза ЦСС сравним с лучшими новыми коммерческими целлюлазными ферментными препаратами, предназначенными для биоконверсии ЦСС. Показано, что совместное применение целлюлазного ферментного препарата Р .verruculosum и Р-глюкозидазного ферментного препарата Р.verruculosum приводит к увеличению общей гидролитической активности ферментного комплекса до уровня современных промышленных препаратов.
Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на международных конференциях и конгрессах: «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва, 2010), «Ломоносов - 2012» (Москва, 2012), «Ломоносов - 2013» (Москва, 2013), «Достижения и перспективы развития биотехнологии» (Саранск, 2012), «Biocatalysis: fundamentals & applications» (Москва, 2013), «Физико-химия растительных полимеров» (Архангельск, 2013), «Биомасса: топливо и энергия» (Москва, 2012), «Биотехнология: состояния и перспективы развития» (Москва, 2013) и «EU-Russia: cooperation in biotechnology, agriculture, forestry, fisheries and food» (Москва, 2012).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК, а также 1 статья и 10 тезисов докладов.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (главы 1-4), отдельной главы с изложением материалов и методов исследования (глава 5), результатов и их обсуждение (главы 6-8), выводов и списка
