Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Нафтохиноновые метаболиты грибов
1.1. Распространение нафтохинонов 10
1.2.Условия биосинтеза нафтохинонов 30
1.3. Биологическая активность нафтохинонов 33
1.4. Механизм токсического действия нафтохинонов 35
Глава 2. Цианидрезистентная альтернативная оксидаза грибов и растений
2.1. Свойства альтернативной оксидазы 38
2.2. Регуляция активности альтернативной оксидазы 40
2.3. Индукция альтернативной оксидазы у грибов и растений 42
2.4. Сигналы, регулирующие экспрессию альтернативной оксидазы 46
2.5. цАМР и Са2+как вторичные мессенжеры в экспрессии альтернативной оксидазы 48
2.6. Активность альтернативного пути in vivo 51
2.7. Физиологическая роль альтернативной оксидазы 55
Глава 3. Материалы и методы исследования
3.1. Микроорганизмы и условия выращивания 61
3.2. Выделение и идентификация пигментов 61
3.3. Выделение митохондрий 62
3.4. Получение субмитохондриальных частиц (СМЧ 62
3.5. Получение микросомальной и растворимой фракции(РФ, диафораза) клеток 63
3.6. Определение активности дыхания 63
3.7. Получение субклеточных фракций из проростков гороха 63
3.8. Определение супероксидного радикала 64
3.9. Определение супероксиддисмутазной активности 65
3.10. Определение каталазной активности 65
3.11. Определение перекиси водорода 65
3.12. Определение фосфорилирующей активности и дыхательного контроля митохондрий 66
3.13. Экстракция и определение адениновых нуклеотидов 66
3.14. Определение феррианидредуктазной активности 67
3.15. Определение цАМФ 67
3.16. Определение глюкозы 67
3.17. Определение белка 68
3.18. Определение кинетических параметров 68
Глава 4. Нафтохиноновые метаболиты
4.1. Биосинтез нафтохинонов грибами 69
4.1.1. Влияние рН среды культивирования 69
4.1.2. Лимитирование роста источником азота и фосфора 73
4.1.3. Влияние ингибиторов переноса электронов и фитоалексинов на биосинтез пигментов 74
4.1.4. Пигментообразование и дыхательная активность гриба в условиях окислительного стресса 78
4.2. Биологическая активность нафтохинонов 83
4.3. Механизм антибиотического действия нафтохиноновых пигментов 85
4.3.1. Действие на бактерии 85
4.3.2. Влияние нафтохинонов на клетки дрожжей 89
4.4. Фитотоксическое действие нафтохинонов 92
4.5. Влияние нафтохинонов на метаболизм продуцента 96
4.6. Устойчивость гриба F. decemcellulare к собственным нафтохинонам 102
Глава 5. Альтернативная оксидаза .
5.1. Локализация альтернативной оксидазы в митохондриях 113
5.2. Активация альтернативной оксидазы нуклезидмонофосфатами 121
5.3. Регуляция активности альтернативной оксидазы в митохондриях.. 129
5.4. Дыхательная активность и содержание адениновых нуклеотидов в клетках Y. lipolytica в процессе развития цианидрезистентного дыхания 137
5.5. Содержание цАМФ в клетках дрожжей в процессе индукции альтернативной оксидазы 143
Глава 6. Обсуждение результатов 148
V. Выводы 162
VI. Список литературы
- Распространение нафтохинонов
- Индукция альтернативной оксидазы у грибов и растений
- Влияние рН среды культивирования
- Локализация альтернативной оксидазы в митохондриях
Введение к работе
1.1. Актуальность проблемы 2
Состояние вопроса 4
Цель и задачи исследования 6
Научная новизна 7
Практическая значимость 8
Апробация работы 8
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Распространение нафтохинонов
Изучены ответные реакции грибов на действие различных стрессовых факторов. Впервые показано, что прекращение роста грибов рода Fusarium и Verticillium при воздействии таких стрессовых факторов, как экстремальные значения рН, недостаток источников азота, фосфора, окислительный стресс, добавление ингибиторов дыхания (антимицин А, цианид) сопряжено с биосинтезом нафтохинонов. Среди выделенных и идентифицированных 13-ти метаболитов обнаружено 3 новых соединения, структура которых установлена с помощью физико-химических методов. Определены факторы, регулирующие качественный состав синтезируемых нафтохинонов. Впервые показано, что, в зависимости от условий культивирования, гриб F. decemcellulare синтезирует внеклеточные нафтохиноны нафтазариновой структуры или внутриклеточный димерный нафтохинон - аурофузарин. Установлено, что основным фактором, определяющим природу конечного продукта, является рН среды культивирования. Обнаружено, что некоторые защитные метаболиты растений - фитоалексины (госсипол, кверцетин, кумарины), подавляют биосинтез пигментов.
Изучен механизм антибиотического и фитотоксического действия нафтохинонов. Впервые показано, что в основе этого механизма лежит «хиноновый редокс-цикл», в котором нафтохиноны в качестве аутооксидабельных соединений, при участии флавин-зависимых дегидрогеназ, катализируют в клетках растений, грибов и бактерий окисление НАД(Ф)Н с образованием активных форм кислорода (супероксидрадикал, Н2О2) и радикальных форм самих пигментов, обладающих мощным цитотоксическим действием.
Впервые изучен механизм устойчивости гриба-продуцента к собственным нафтохинонам. Установлено, что основу защитного механизма составляет реакция деметилирования 7-метокси-группы хинонового кольца нафтохинонов, в результате чего нафтохиноны утрачивают способность акцептировать восстановительные эквиваленты с флавиновых НАД(Ф)Н-зависимых дегидрогеназ. Кроме того, в присутствии собственных нафтохинонов у грибов-продуцентов увеличивается активность супероксиддисмутазы и каталазы, основных ферментов против окислительного стресса.
Показано, что в условиях окислительного стресса, а также в присутствии ингибиторов дыхания (антимицина А) у гриба F. decemcellulare наблюдается появление цианидрезистентного дыхания (альтернативной оксидазы). Альтернативная оксидаза в этих условиях выполняет функцию единственной терминальной оксидазы, обеспечивающей рост гриба и биосинтез нафтохинонов. Показано, что у Yarrowia lipolytica альтернативная оксидаза присутствует в митохондриях наряду с полноценной цитохромной цепью. Впервые изучен механизм распределения электронов между двумя путями окисления. Исследованы факторы регуляции и свойства альтернативной оксидазы. Установлено, что ее основная функция состоит в поддержании окислительной активности клеток в условиях нарушения переноса электронов по основному цитохромному пути.
Полученные результаты вносят существенный вклад в представление о механизмах адаптации микроорганизмов к стрессовым условиям среды обитания и роли этих механизмов в эволюционных процессах. Представленные данные можно рассматривать не только как пример реакции биологической системы на неблагоприятные факторы внешней среды, но и как часть модельной системы взаимоотношений грибов с другими видами в природных экосистемах. Результаты исследования регуляции биосинтеза нафтохиноновых пигментов грибами могут быть использованы как основа при разработке эффективных технологий синтеза различных вторичных метаболитов (антибиотиков, пигментов и др.).
Установлено, что некоторые нафтохиноны являются микотоксинами. Совместно с НИИ птицеводства (Украина, г. Харьков) проведено исследование состава зерна, пораженного грибами рода Fusarium, которое при скармливании курам -несушкам вызывало признаки синдрома ухудшения качества яйца, проявляющегося в снижении оплодотворяемости яйца и выводимости цыплят. Установлено, что проявление указанного синдрома обусловлено наличием в зерне димерного нафтохинона аурофузарина. Разработан метод анализа содержания аурофузарина в зерне. Результаты изучения биосинтеза нафтохинонов и их токсического действия могут использоваться при решении практических задач сельского хозяйства (контроль качества зерна).
Основные материалы диссертации были представлены и обсуждались на 2-м Международном Симпозиуме «Сверхсинтез микробных продуктов» (Прага, 1988), на 2-м съезде биохимического общества (Пущино, 1997), на Международном симпозиуме «Современные проблемы микробной биохимии и биотехнологии» (Пущино, 2000), на конференции «От современной фундаментальной биологии к новым наукоёмким технологиям». (Пущино, 2001), на Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды» (Волгоград - Пермь, 2001), на 3-й Международной конференции по Yarrowia lipolytica, «Биология клетки и биотехнология нетрадиционных дрожжей" (Дрезден, Германия, 2002), на 1-м Международном конгрессе европейских микробиологических обществ Любляна 2003, на 11-м Международном конгрессе по дрожжам (Рио де Жанейро, Бразилия, 2004). Исследования по теме диссертации были поддержаны грантом «Биотехнология защиты окружающей среды» и грантами РФФИ: «Роль фитоалексинов в развитии фитоиммунитета при взаимодействии грибов и растений (96-04-50222); «Развитие и условие функционирования цианидрезистентного пути окисления у дрожжей и грибов» (98-04-48148); «Адаптация фитопатогенных грибов к окислительному стрессу» (99-04-48872); «Изучение факторов, контролирующих активность цианидрезистентного пути окисления в митохондриях дрожжей» (01-04-48680). Материалы диссертации представлены в более чем 40 публикациях, в том числе - 2 обзора и свыше 30 научных статей. Автор выражает искреннюю благодарность и признательность научному консультанту д.б.н., профессору В.К. Акименко за многолетнюю помощь и поддержку при выполнении этой работы; сотрудникам лаборатории анаэробного метаболизма микроорганизмов ИБФМ РАН, принимавших участие в проведении исследований, к.б.н. Головченко Н.П., к.б.н. Трутко СМ., к.б.н. Аринбасаровой А.Ю., лаборантам Казаковой М.Д. и Пайвиной З.В., ст. лаб. Смирновой Н.М. Особую благодарность выражаю сотрудникам ИБФМ РАН Баскунову Б.П., [Нефедовой М.Ю., к.б.н Сахаровскому В.Г. - за снятие масс-, ИК- и Н-ЯМР-спектров и их интерпретацию.
Индукция альтернативной оксидазы у грибов и растений
Впервые цианидрезистентное дыханиу было обнаружено у N. crassa в условиях нарушения переноса электронов по цитохромному пути при выращивании в присутствии антимицина A (Lambowitz and Slayman, 1971). В дальнейшем появление цианидрезистентности было показано при культивировании грибов и дрожжей в присутствии ингибиторов переноса электронов на терминальном участке дыхательной цепи (цианида, антимицина А и СО) или ингибиторов митохондриального синтеза белка (хлорамфеникола и др.) (Henry and Nyns,1975; Акименко, 1981). Показана индукция оксидазы у грибов при выращивании на средах, дефицитных по ионам меди (Stumpferl et al, 2004; Henry and Nyns,1975; Акименко, 1981) и ионов цинка (Minagawa et al, 2002). Мутации, приводящие к нарушению синтеза цитохромов также приводили к появлению у грибов резистентности к цианиду (Henry and Nyns,1975; Акименко, 1981)
Несколько в стороне находятся результаты по индукции цианидрезистентного дыхания у грибов и дрожжей в отсутствие ингибиторов: при температурном шоке (Habel et al, 1991; Michea-Hamzerhpour and Turian, 1987); при недостатке кислорода (Henry and Nyns,1975; Акименко, 1981), в условиях солевого стресса (Андреищева и соав. 1998; Zvyagilskaya et al, 2001), на средах с несбраживаемыми субстратами, этанолом, цитратом, пируватом (Акименко, 1981; Sakajo et al, 1991; Sami et al, 2003; Shi et al, 2002). Появление цианидрезистентного дыхания у дрожжей отмечено при лимитировании роста источником углерода (глюкоза) (Акименко, 1981). При этом индукция альтернативной оксидазы наблюдалась при переходе дрожжей из логарифмической фазы роста в стационарную. Напротив, при росте на этаноле, лактате, малате (Акименко, 1981), а также цитрате и пирувате (Slayman, 1977; Li et al, 1996) цианидрезистентное дыхание у грибов и дрожжей обнаружено в логарифмической фазе. Отмечено появление альтернативной оксидазы у дрожжей Н. anomala при инкубации с серусодержащими соединениями (цистеин, метионин, глутатион, сульфит и др.) (Sakajo et al, 1991; Minagawa et al, 1991).
Исследование индукции цианидрезистентного дыхания у более 20 видов растений или их хранящихся органов (клубни, плоды) показало, что они могут быть разделены на две группы. Первая группа включает растения, срезы тканей которых являются цианидчувствительными, а цианидрезистентность проявляется при старении (Laties, 1982). Типичным представителем этой группы является белый картофель Solanum tuberosum.
Ко второй группе относятся растения, свежеприготовленные срезы которых являются цианидрезистентными (причем дыхание срезов часто стимулируется цианидом), а в процессе старения происходит некоторое снижение активности альтернативного пути. Типичный представитель - сладкий картофель Ipomoea batatas (Laties, 1982).
Исследования условий появления цианидрезистентного дыхания у различных растений выявили ряд факторов, контролирующих этот процесс. Так, цианидрезистентное дыхание у срезов картофеля и этиолированных проростков пшеницы индуцируется высоким уровнем СОг (Lange, 1970; Perezrejo et al, 1981, McCaig and Hill, 1977). Обнаружено появление цианидрезистентного дыхания у плодов и хранящихся клубней растений в присутствии этилена. При этом индукция альтернативной оксидазы заметно активировалась кислородом и СОг (Laties, 1982; Day etal, 1978).
Культуры растительных клеток аналогично микроорганизмам способны синтезировать альтернативную оксидазу при действии ингибиторов цитохромного пути (Wagner and Wagner, 1997; Vanlenberghe et al, 1997; Azcon-Bieto et al, 1989) Показана индукция цианидрезистентного дыхания у растений под действием стрессовых факторов, таких как охлаждение, ранение, осмотический шок (Purvis 1997; Hiser and Mcintosh, 1990). При этом установлено увеличение уровня белка альтернативной оксидазы в митохондриях (Purvis 1997; Hiser and Mcintosh, 1990; Vanlerberghe and Mcintosh, 1992). Воздействие стрессовых факторов было связано с нарушением переноса электронов по цитохромному пути (Purvis and Shewfelt, 1993, Prasad et al, 1994). Анализ данных по индукции альтернативной оксидазы у растений и микроорганизмов позволяет заключить, что общим следствием действия факторов, приводящих к развитию альтернативной оксидазы, является нарушение переноса электронов по основной дыхательной цепи и как результат этого - снижение энергетического статуса клеток, в частности, снижение уровня АТР и мембранного потенциала.
Исследования индукции цианидрезистентного дыхания цианидом или антимицином А у N. crassa (Slayman, 1973) показали, что добавление указанных ингибиторов приводило к быстрому падению уровня АТР и общего уровня адениновых нуклеотидов. Сходная ситуация наблюдалась у N. crassa в условиях теплового шока (Habel et al, 1991). Быстрое изменение температуры инкубации грибов от 30 до 45 сопровождалось снижением дыхательной активности и полной деэнергизацией митохондрий. Установлено, что воздействие повышенной температуры приводило к уменьшению в митохондриях цитохромоксидазы (Michea-Hamzerhpour and Turian, 1987;. Tonhat et al, 1983).
Важные результаты по индукции цианидрезистентного дыхания были получены на дрожжеподобном грибе Moniliella tomentosa (Vanderleyden et al, 1978). При росте на глюкозе дыхание гриба было высокочувствительно к цианиду (95%). Добавление к глюкозной среде роста н-пропанола или н-бутанола индуцировало появление в клетках резистентной к цианиду оксидазы. При этом заметно снижались выход биомассы и скорость роста грибов. н-Пропанол разобщает окислительное фосфорилирование в митохондриях, поскольку снижает дыхательный контроль. Другими словами, н-пропанол снижал в клетках эффективность синтеза АТФ и тем самым индуцировал синтез цианидрезистентной оксидазы.
Длительное культивирование Euglena gracilis в условиях аноксии сопровождалось снижением уровня цитохромоксидазы и цитохрома с-558. При этом клетки сохраняли способность к потреблению Ог после переноса в аэробные условия. Дыхание было резистентным к цианиду и азиду, но подавлялось н-пропилгаллатом, что указывало на наличие альтернативной оксидазы (Carre et al, 1988).
Нарушением работы цитохромной цепи можно объяснить индукцию альтернативного пути у дрожжей и грибов в отсутствие ингибиторов переноса электронов. Была обнаружена зависимость между появлением цианидрезистентного дыхания и количеством клеток К anomala при инкубации в среде с фосфатом (Minagawa and Yoshimoto, 1987). Индукцию альтернативного пути при высокой концентрации клеток авторы объяснили недостатком кислорода в среде, что сопряжено с нарушением работы цитохромного пути.
Инкубация клеток Н. anomala с серусодержащими соединениями также приводила к появлению цианидрезистентного дыхания (Minagawa et al, 1991). Можно предположить, что в процессе инкубации происходит восстановление серных соединений до сульфида, который, как известно (Azcon-Bieto et al, 1989), способен полностью ингибировать цитохромоксидазу. На возможность такого объяснения указывают данные Хаддока и Гарланда (Haddock and Garland,, 1971), которые показали, что клетки дрожжей Torulopsis utilis, выращенные в условиях дефицита серы, проявляют резистентное к цианиду дыхание при добавлении сульфата. При этом цитохромоксидаза в цианидрезистентных клетках была в ингибированном состоянии.
У растений появление цианидрезистентного дыхания также сопряжено с нарушением переноса электронов по цитохромному пути и снижением энергетического статуса клеток.
Влияние рН среды культивирования
Ранее (рис. 14,17) нами было показано, что аутооксидабельные пигменты способны акцептировать восстановительные эквиваленты от цитозольных диафораз бактериальных и дрожжевых организмов и переносить их непосредственно на кислород с образование супероксидных радикалов и Н2О2. Кроме того, пигменты катализировали окисление НАДН митохондриальной и микросомальной фракциями дрожжей. На основании этих результатов было высказано предположение о том, что пигменты могут принимать участие в окислительном обмене грибов-продуцентов.
Для решения этой задачи было необходимо установить следующее. Во-первых, способны ли синтезируемые пигменты взаимодействовать с окислительно-восстановительными ферментными системами продуцента? Во-вторых, если продуцент обладает чувствительными к пигментам системами, то имеют ли пигменты возможность в период биосинтеза к взаимодействию с этими системами?
Для ответа на первый вопрос было проведено исследование влияния пигментов на потребление кислорода мицелием гриба и изолированными митохондриями. Была изучена также способность пигментов катализировать окисление восстановленных пиридиннуклеотидов ферментами цитоплазмы грибов-продуцентов. Результаты представлены на рис. 21.
На рисунке видно, что дыхание мицелия заметно подавлялось цианидом, а последующее добавление препарата пигментов (кривая \) или чистого фузарубина (кривая 2) приводило к частичному восстановлению потребления кислорода. На рис. 21 видно также (кривая 3), что пигменты способны катализировать окисление НАДН цитоплазматической фракцией (диафораза) активность которой обусловлена, вероятно, наличием НАД(Ф)Н диафоразы. Необходимо отметить, что пигменты катализировали потребление кислорода цитоплазматической фракцией в присутствии не только НАДН, но и НАДФН, активность при этом составляла не более 50%. Пигменты снимают ингибирующее действие цианида при окислении митохондриями F. decemcellulare экзогенного НАДН (кривая 4). Этот факт свидетельствует о том, что аутооксидабельные пигменты способны акцептировать восстановительные эквиваленты от экзогенной НАДН -дегидрогеназы митохондрий грибов и переносить их непосредственно на кислород в обход дыхательной цепи.
Окисление НАД+-завнсимых субстратов митохондриями, как показано на примере а-кетоглутарата (рис. 22, кривая 5), оказалось нечувствительным к пигментам. Следовательно, нафтохиноны неспособны взаимодействовать с эндогенной НАДН-дегидрогеназой митохондрий, локализованной с внутренней стороны мембраны митохондрий. Аналогичный результат был получен при окислении митохондриями а-глицерофосфата и сукцината (рис. 21, кривая 6).
В табл. 9 суммированы данные по влиянию индивидуальных пигментов на скорость потребления кислорода митохондриями и цитоплазматической фракцией грибов-продуцентов в присутствии NADH. Практически все пигменты катализировали потребление кислорода исследуемыми субклеточными фракциями, наибольшей активностью обладали фузарубин и яваницин, причем как при исследовании митохондрий, так и цитоплазматической фракции. Таким образом, представленные на рис. 21 и в табл. 9 результаты показывают, что грибы-продуценты обладают ферментными системами, чувствительными к собственным антибиотикам. Участие пигментов в окислительном метаболизме продуцента исследовалось с учетом данных о способности пигментов акцептировать восстановительные эквиваленты с цитозольных диафораз и экзогенной НАДН -дегидрогеназы митохондрий грибов и отдавать их непосредственно на кислород в обход дыхательной цепи. Другими словами, если синтезируемые пигменты взаимодействуют с редокс-ферментами продуцента, то степень ингибирования дыхания цианидом должна резко понижаться в период биосинтеза и накопления пигментов культурой. На рис. 22 представлены данные исследования дыхательной активности грибов в условиях биосинтеза пигментов и в его отсутствие. Снижение рН среды культивирования до 3,8 сопровождалось торможением накопления биомассы (кривая \) и появлением в среде пигментов (кривая 2). Дыхание культуры, измеренное в отсутствие цианида, понижалось в процессе перехода культуры в стационарную фазу роста (кривая 3) и было высокочувствительным к цианиду в процессе всего роста (кривая 4). Ожидаемого снижения чувствительности дыхания мицелия к цианиду в процессе активного биосинтеза нафтохинонов (кривая 4) обнаружено не было. Более того, ярко выраженная способность добавленных пигментов стимулировать дыхание мицелия в логарифмической фазе роста (кривая 5), исчезала в стационарной фазе в период активного биосинтеза собственных пигментов. Важно отметить, что синтезируемые пигменты не были обнаружены в мицелии после отделения культуральной жидкости центрифугированием. Все метаболиты находились в жидкой фазе, (например, в условиях их активного биосинтеза - в концентрации 35 мкМ). О возможном участии пигментов в окислительном метаболизме продуцента можно судить не только по их влиянию на потребление кислорода, но и по скорости их восстановления культурой. На рис. 23 представлены результаты, характеризующие способность грибов восстанавливать пигменты в зависимости от физиологического состояния. Видно, что мицелий гриба, собранный в логарифмической фазе роста при рН 5,5, когда биосинтез пигментов отсутствует, активно восстанавливал добавленный препарат пигментов (рис. 23, Б). Скорость восстановления составляла 11 нмоль/мин на 1 мг мицелия. Напротив, гриб в период активного биосинтеза пигментов (стационарная фаза роста, рН 3,0) очень медленно восстанавливал собственный пигмент - 0,1 нмоль/мин на 1 мг мицелия. Таким образом, данные на рис. 22 и 23 свидетельствуют о том, что синтезируемые пигменты не взаимодействуют с продуцентом в период их биосинтеза. Отсутствие активности пигментов можно объяснить, прежде всего, изменением физиологического состояния культуры, связанного с переходом в стационарную фазу роста. Но это объяснение не согласуется с данными по изучению дыхательной активности грибов стационарной фазы роста в условиях лимитирования их роста источником углерода, когда биосинтез пигментов отсутствовал (рис. 24). На рисунке видно, что торможение роста культуры (кривая 1) при исчерпании глюкозы (кривая 2) сопровождалось снижением активности дыхания (кривая 3). Дыхание при этом было высоко чувствительным к цианиду (кривая 4). Чувствительность дыхание клеток к цианиду заметно снижалась в присутствии добавленных пигментов (кривая 5). Эти данные указывают на способность пигментов стимулировать дыхание клеток гриба как в логарифмической, так и в стационарной фазах роста
Локализация альтернативной оксидазы в митохондриях
На рис. 25 приведены результаты, характеризующие рост грибов в присутствии 75 мкМ. Видно (кривая 2), что добавление этого пигмента приводило к увеличению лаг-фазы. Заметный рост начинался примерно через 20 час, тогда как в контрольном эксперименте (кривая 1) начало активного роста наблюдалось через 10 -12 час культивирования. Исчерпание глюкозы в среде (на рис. не показано) в обоих случаях вызывало переход культур в стационарную фазу роста с сохранением временного разрыва, сформированного в период лаг-фазы. Добавление в среду культивирования яваницина незначительно снижало выход биомассы грибов по сравнению с контролем (кривые 2 и 1). На всем протяжении роста, как в присутствии кривая 4 - кривая роста.яваницина, так и в его отсутствие, рН среды культивирования сохранялось в пределах 6,0 - 6,8. Суммарное количество пигмента, добавленное в среду культивирования, оставалось неизменным на всем протяжении роста (рис. 25, кривая 3). Это позволяет заключить, что пигменты, продуцируемые грибами, не используются ими в качестве источника углерода даже в условиях лимитирования их роста по углероду. Другими словами, пигменты, по-видимому, не являются запасными веществами клетки.
Присутствие яваницина в среде культивирования гриба оказывает влияние на интенсивность потребления кислорода и его чувствительности к цианиду (рис. 26, А и Б). В период активного роста скорость потребления кислорода максимальна, а при переходе культуры в стационарную фазу роста она резко падает. На всем протяжении роста дыхание оставалось практически полностью чувствительным к цианиду (рис. 26А, кривая 2). Добавление яваницина на фоне цианида активировало потребление кислорода практически до исходного уровня (рис. 26А, кривая 3).
В случае культивирования гриба в присутствии яваницина отмечалась более высокая скорость потребления кислорода, по крайней мере в первые часы культивирования (рис. 26Б, кривая 1). При этом дыхание было на 40 - 50% резистентно к цианиду, что указывало на участие пигмента в общем процессе потребления кислорода культурой гриба (рис. 26Б, кривая 2).
Примерно через 20 час культивирования потребление кислорода снижалось (рис. 26Б, кривая 1) и становилось в значительной мере чувствительным к цианиду (рис. 26Б, кривая 2). Дополнительное внесение яваницина на фоне цианида ускоряло потребление кислорода культурой грибов (рис. 26Б, кривая 3). Совокупность результатов, приведенных на рис. 25 и 26 позволила предположить, что в случае культивирования в присутствии экзогенных пигментов рост гриба начинается только после изменения их физико-химических свойств. Эти изменения могут быть результатом трансформации пигментов в их неактивные формы. Действительно, сравнительный анализ с помощью тонкослойной хроматографии метаболита культуральной жидкости после 20 час культивирования гриба показал качественные отличия от исходного яваницина, отражением чего, в частности, было изменение Rf (0,65 - для исходного пигмента и 0,35 - для его трансформированной формы). Следует отметить, что к началу роста трансформация яваницина составляла 80%. В процессе роста степень трансформации увеличивалась до 90-95% (рис. 25, кривая 4). Аналогичные результаты были получены при изучении роста гриба в присутствии других образуемых ими пигментов - фузарубина и бострикоидина. Возникал закономерный вопрос о природе трансформации пигментов. Для его решения трансформированные пигменты были очищены и исследованы с помощью УФ-, ИК.-, Н-ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии. Результаты представлены в табл. 11 и 12. Как следует из результатов, представленных в табл. 11, трансформированные пигменты отличались от исходных по температуре плавления и хроматографической подвижности. Спектры трансформированных пигментов в УФ-видимой области в растворе этанола не выявили существенных отличий от исходных пигментов. Однако в щелочном этаноле положение максимумов бьшо сдвинуто в более короткую область спектра. Эти изменения были характерны для всех трех исследуемых соединений, что может свидетельствовать об идентичности реакции трансформации. Далее из данных табл. 10 следует, что пики молекулярного иона (mlz) трансформированных пигментов были на 14 атомных единиц меньше, чем исходных соединений. Так, в масс-спектре трансформированного яваницина (табл. 11) наблюдался пик молекулярного иона с m/z = 276. Общий характер фрагментации (элиминирование ацетильной группы, окиси углерода) сохранялся и частично совпадал с масс-спектром нор-яваницина. По данным ИК-спектроскопии (табл. 11) в спектре трансформированного яваницина появляется полоса поглощения, свидетельствующая о наличии свободной гидроксильной группы в молекуле. Кроме того, в Н-ЯМР спектре (табл. 12) отсутствовал сигнал 3,94, характерный для метокси-группы в 7 положении яваницина (рис. 28). Анализ совокупности представленных данных позволил заключить, что трансформация яваницина связана с реакцией деметилирования метоксигруппы пигмента в положении 7. Аналогичные выводы справедливы и в отношении трансформированных фузарубина и бострикоидина. Важным подтверждением вывода о трансформации пигментов как о реакции деметилирования 7-метоксигруппы являются данные по их метилированию в мягких условиях. В результате метилирования трансформированных пигментов были получены соединения, которые по своим физико-химическим параметрам (масс-спектрометрия, температура плавления, хроматографическая подвижность, УФ- и ИК-спектроскопия) были полностью идентичны соответственно яваницину, фузарубину и бострикоидину.
![Состояние системы цитокинов и специфического иммунного ответа у детей и подростков с туберкулезом органов дыхания в Приморском крае [Электронный ресурс]](/i/i/4478/175304.png "Состояние системы цитокинов и специфического иммунного ответа у детей и подростков с туберкулезом органов дыхания в Приморском крае [Электронный ресурс] Середа Виктор Григорьевич")