Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. CLASS Обзор литератур CLASS ы 10
1.1. Современные взгляды на систематику грибов рода Fusarium 10
1.2. Биология возбудителей фузариоза 14
1.2.1. Морфологические особенности грибов рода Fusarium 14
1.2.2. Природа и биохимическое действие токсинов грибов рода Fusarium 20
1.2.3. Заболевания сеянцев, вызываемые фитопатогенными грибами рода Fusarium 24
1.2.4. Географическое распространение и вредоносность возбудителей инфекционного полегания 27
1.3. Биологический контроль возбудителей инфекционного полегания
1.3.1. Применение грибов рода Trichoderma 35
1.3.2. Применение антагонистически активных бактерий 37
Глава 2. Объекты и методы исследований 42
2.1. Характеристика района исследований. Объекты исследований 42
: 2.2. Методы исследования 47
2.2.1. Выделение и идентификация микромицетов рода Fusarium 47
2.2.2. Оценка фитотоксичности, фитопатогенности и агрессивности микромицетов рода Fusarium 49
2.2.3. Оценка чувствительности грибов рода Fusarium к антагонистически активным штаммам Trichoderma asperelhim, Trichoderma harzianum и Streptomyces lateritius 54
2.2.4. Оценка чувствительности грибов рода Fusarium к химическим фунгицидам 55
2.2.5. Оценка биологического контроля возбудителей фузариоза штаммами грибов рода Trichoderma и актиномицета Streptomyces laierilhis в условиях лесопитомника 56
Глава 3. Видовое разнообразие и географическое распространение грибов рода Fusarium в ризосфере сеянцев хвойных в лесопитомниках Средней Сибири 59
3.1. Видовой состав грибов рода Fusarium 59
3.2. Географическое распространение грибов рода Fusarium 63
Глава 4. Морфологические и культуральные свойства грибов рода Fusarium, выделенных из ризосферы сеянцев хвойных в лесопитомниках Средней Сибири ""
Глава 5. Вирулентные свойства грибов рода Fusarium, распространенных в лесных питомниках Средней Сибири 85
5.1. Фитотоксические свойства видов рода Fusarium в отношении семян хвойных 85
5.2. Влияние токсических метаболитов грибов рода Fusarium на каллусные культуры Larix sibirica L 92
5.3. Патогенность и агрессивность видов рода Fusarium в отношении сеянцев хвойных пород 94
Глава 6. Чувствительность грибов рода Fusarium к антагонистически активным микроорганизмам и химическим фунгицидам 109
6.1. Чувствительность к биоконтрольным штаммам Trichoderma asperellum, Trichoderma harzianum и Streptomyces later it ins 109
6.2. Чувствительность к химическим фунгицидам 112
Глава 7. Экологическое обоснование использования антагонистически активных микроорганизмов в биологическом контроле фузариоза сеянцев хвойных
7.1. Влияние антагонистов Trichoderma asperellum и Streptomyces lateritius на видовой состав грибов рода Fusarium в условиях светокультуры 116
7.2. Использование грибов рода Trichoderma и актиномицета Streptomyces lateritius в лесопитомнике
7.3. Влияние грибов Trichoderma asperellum, Trichoderma harziamim и Streptomyces lateritius на микобиоту ризосферы сеянцев хвойных в условиях лесопитомника 126
Заключение 139
Выводы 142
Список литературы 144
Приложение
- Природа и биохимическое действие токсинов грибов рода Fusarium
- Оценка чувствительности грибов рода Fusarium к антагонистически активным штаммам Trichoderma asperelhim, Trichoderma harzianum и Streptomyces lateritius
- Географическое распространение грибов рода Fusarium
- Фитотоксические свойства видов рода Fusarium в отношении семян хвойных
Природа и биохимическое действие токсинов грибов рода Fusarium
Токсины грибов - это продукты метаболизма разнообразной химической природы, оказывающие специфическое патологическое действие на организм человека, высших животных и растений, микроорганизмы. Фито-токсины подавляют или задерживают развитие высших растений, вызывая повреждения тканей, и являются важным фактором развития болезней (Билай, 1973; Билай, 1977; Билай, Пидопличко, 1970; Placinta et al, 1998).
Токсиногенные виды грибов известны человеку с глубокой древности, например, токсические свойства многих видов шляпочных грибов. Однако интерес к изучению фитотоксинов микромицетов возрос лишь в 60-х годах 20 века, когда выяснилось, что они являются определяющим фактором патогенности грибов, способных вызывать эпифитотии. В настоящее время изучено действие более 350 видов токсиногенных грибов, в том числе десятки видов токсинов продуцируемых грибами рода Fusarium. Именно представители этого рода образуют наиболее опасные для растений, животных и человека микотоксины (Билай, 1965; Саркисов, 1984; Никуленко, Чкаников, 1987; Placinta et al, 1998; Desjardins et al, 2000).
По химической природе токсические вещества, образуемые грибами рода Fusarium, относятся к пептидам, гликопептидам, полисахаридам, тер-пеноидам, фенольным или гетероциклическим соединения, а по характеру влияния на клетку - к ядам общеплазматического действия. В результате действия микотоксинов происходят изменения морфологических, цитологических и биохимических показателей растений. Установлено, что токсины оказывают существенное влияние на интенсивность дыхания, значительно снижают фотосинтетическую активность, нарушают азотный и углеводный обмен, повреждают клеточные мембраны, ингибируют репликанию митохондриальной ДНК, вызывают нарушение митотического цикла в меристемах, что служит причинами задержки роста и развития пораженных растений или их гибели (Билай, 1977; Берестецкий, 1978; Никуленко, Чка-ников, 1987).
Фитопатогенные грибы рода Fusarium заражают растение, в основном, в поле; накопление микотоксинов в урожае происходит во время вегетации и может продолжаться при хранении. Одновременное действие нескольких видов грибов рода Fusarium способно взаимно усилить образование метаболитов, а также вызвать сопутствующее заражение растений вирусами и бактериями (Монастырский, 1996; Visconti et al, 1992).
Микотоксины микромицетов рода Fusarium обычно не являются характерными для определенного вида. Штаммы многих видов синтезируют фузариевую кислоту (азотсодержащее гетероциклическое соединение, относящееся к группе никотиновых кислот). Фузариевая кислота обладает высокой степенью токсичности для разных видов растений, задерживает рост бактерий Bacillus subtilis, В. megaterium, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus и др. Она образуется в мицелии и, главным образом, в культуральной жидкости; проявляет токсикоорганотропное действие различной степени в зависимости от дозы и вида растения (Монастырский, 1996; Miller et al, 1993; Bacon et al, 1996).
Продуцентами фузариевой кислоты являются многие штаммы видов Fusarium oxysporum, F. moniliforme, F. heterosporum, F. subglutinans, F. sambucinum, F. napiforme, F. crookwellense nF. solani (Bacon et al, 1996).
В зависимости от условий и степени токсичности продуцента, а также концентрации в тканях растения, фузариевая кислота различным образом влияет на водный обмен растения. При высокой дозе токсина (100-200 мг/кг сырого веса в течение часа) водный обмен полностью парализуется и восстанавливается лишь наполовину через 3-5 часов. При низкой дозе (20 мг/кг) в первую фазу интоксикации подача воды в ткань увеличивается, и растения не страдают от недостатка воды. Нарушение водного обмена на 22 ступает после появления некрозов в тканях, когда процесс транспирации преобладает над поступлением воды, что приводит к уменьшению её содержания в клетках и потере тургора (Билай, 1965; Билай, 1977; Kern, 1982; Miller etal, 1993).
Фузариевая кислота, образуемая грибом при поражении растения и вовлекаемая в транспирационньте токи, может оказывать патологическое действие многими путями. При декарбоксилировании в больном растении из фузариевой кислоты образуется 3-п-бутил пиридин, токсическое действие которого в 100 раз большее исходного соединения (Шевченко, 1978; Федоров, 1987).
Микомаразмин - токсин, образующийся при культивировании штаммов F. oxysporum, а также in vivo в пораженных грибом растениях. Токсин обладает более специфическим действием, чем фузариевая кислота: воздействует только на ткань листьев между главными жилками, вызывая некрозы. Микомаразмин нарушает полупроницаемость плазматических мембран и водный баланс растения. Кроме этого, микомаразмин образует комплекс с ионами железа и становится значительно токсичнее для растений. Действию токсина подвержены ткани листьев томатов, картофеля, хлопчатника и других растений (Билай, 1965; Билай, Пидопличко, 1970; Visconti et al, 1992; Placinta et al, 1998).
Нафтазарины (производные нафтахинонов) - фузарубин, яваницин, мартицин, изомартицин, новарубин - являются характерными метаболитами F. javanicum, F. solani, F. martii var pisi. Токсины образуются при поражении растений и культивировании этих видов на синтетических средах, имеют общий нафтазариновый скелет и различные функциональные группы. Нафтазарины нарушают проницаемость плазматических мембран и разрушают хлоропласты (Берестецкий, 1978; Кепі, 1982; Visconti et al, 1992; Placinta etal, 1996).
Группу опасных токсинов составляют трихотецины, которые подразделяются на 4 типа. Наибольшую вредоносность оказывают токсины, при 23 надлежащие к типу А (Т-2 токсин, НТ-2 токсин, неозоланиол (НЕО), ди-ацетоксицирпенол), синтезируемые F. sporotrichioid.es и F. роае, а также к типу В (деоксиниваленол (ДОН) и его производные - ниваленол, фузари-нон-Х), продуцируемые F. graminearum и F. culmorum (Greenhalgh, Levandier, 1986; Park et al, 1996; Placinta et al, 1998; D Mello et al, 1999).
Оценка чувствительности грибов рода Fusarium к антагонистически активным штаммам Trichoderma asperelhim, Trichoderma harzianum и Streptomyces lateritius
Trichoderma asperellum штамм МГ-97 (ВКПМ F-765), Trichoderma harzianum штамм «Универсальный» и Streptomyees lateritius штамм 19/97-M (ВЮПМ Ас-1637) были предварительно отобраны на основе проявления ими высокой антибиотической активности для ограничения численности фитопатогенных микромицетов родов Fusaiium, Alternaria и Verticillium и любезно предоставлены сотрудниками кафедры экотоксикологии и микробиологии Красноярского Государственного Университета.
Чувствительность грибов рода Fusarium к метаболитам микроорганизмов-антагонистов изучали с использованием общепринятых микробиологических методов перпендикулярных штрихов и агаровых блочков (диаметр пробойного сверла 8 мм), измеряя зону отсутствия роста. По диаметру зон судили о чувствительности изолята: более 20 мм - высокая чувствительность; 15-19.5 мм - умеренная; 12 - 14.5 мм - слабая; до 11.5 мм - очень слабая (Егоров, 1976; Сэги, 1983).
Изучали чувствительность гриба Fusarium sporotrichioides штамм МГ-33/98 к антагонистически активным микроорганизмам Trichoderma asperellum и Streptomyees lateritius при выращивании сеянцев Larix sibirica L. в лаборатории светокультуры и светофизиологии на искусственно создаваемых фонах инфекции патогена. Для создания искусственной инфекционной нагрузки вносили водную суспензию Fusarium sporotrichioides из расчета 6.0 105 пропагул на 100 семян, содержащую микро- и макроконидии (15 % и 85 % соответственно). При данной инфекционной нагрузке этот патоген вызывает 100 % распространенность болезни при проявлении интенсивности поражения сеянцев, равной 3-4 баллам. Гриб Trichoderma asperellum вносили в дозах 18.0 105, 9.0 105, 1.8 105 пропагул на 100 семян, актиномицет Streptomyees lateritius - в дозах 100, 50, 10 мг биомассы на 100 семян. Оценку действия вносимых доз антагонистов проводили по всхожести семян, степени проявления болезни сеянцев и численности вида Fusa-Hum sporotrichioides. Динамику численности внесенных антагонистов и фитопатогена изучали методом разведений суспензии, полученной путем смыва стерильной воды с керамзита. Расчет численности колоний проводили на 1 г сухой навески. Для выделения использовали КДА, модифицированную среду Чапека (Nelson et al, 1983) и крахмало - аммиачный агар.
Проводили оценку влияния Trichoderma asperellum, Streptomyces lat-eritius и Fusarium sporotrichioides на некоторые показатели роста и развития сеянцев Larix sibirica L.: длину надземной и корневой части сеянцев, сырую биомассу. Оценку достоверности различий результатов проводили по критерию Стьюдента (Лакин, 1990) для уровня вероятности не менее 95 % с использованием пакета программ Microsoft Excel 2000.
Проводили оценку чувствительности грибов рода Fusarium к химическим фунгицидам байлетон, фундазол и ТМТД, рекомендуемые для ограничения численности микромицетов. Байлетон относится к высокоэффективным фунгицидам с системными свойствами, выпускается в Германии фирмой «Байер» в виде 25% смачивающегося порошка. Фундазол и ТМТД также относятся к группе эффективных системных фунгицидов. Эти препараты применяются в лесном хозяйстве для протравливания семян перед посевом против фузариоза из расчета 6 г на 1 кг семян (Мельников и др., 1985; Государственный каталог..., 1997).
Чувствительность грибов рода Fusarium к указанным фунгицидам изучали с использованием метода агаровых лунок (диаметр пробойного сверла 8 мм). В лунки вносили препараты в количестве 0.1 мл в 1-% концентрации. Посевы инкубировали при 26 - 28 С в течение 7-10 суток, затем измеряли зону отсутствия роста гриба. По диаметру зон судили о чув 56 ствителъности изолята: более 20 мм - более 20 мм - высокая чувствительность; 15-19.5 мм - умеренная; 12 - 14.5 мм - слабая; до 11.5 мм -очень слабая (Егоров, 1976; Сэги, 1983).
Оценивали действие антагонистов Trichoderma asperellum штамм МГ-97 (ВКПМ F-765), Trichoderma harzianum штамм «Универсальный» и Streptomyces lateritius штамм 19/97-М (ВКПМ Ас-1637) на развитие мик-ромицетов рода Fusarium при их интродукции в почву на посевах Larix sibirica LM Pinus sibirica L. и Picea abies L. Полевые испытания препарата на основе грибов рода Trichoderma и актиномицета Streptomyces lateritius проводили в Мининском лесопитомнике, расположенном на территории Мининского опытного лесного хозяйства (56 10 с.ш., 92 42 в.д.).
Мининский лесопитомник находится в зоне травяных лесов с островами лесостепи, представленной чередованием лугово-стеттных, луговых и степных формаций, в пределах северо-западных отрогов Восточного Сая-на. Рельеф местности - грядово-холмистый с небольшими перепадами высот; климат континентальный. Климатические условия этого района умеренно-прохладные и избыточно увлажненные. Среднегодовое количество осадков составляет 427 мм, из них на летний период приходится 200 - 260 мм. Средняя температура января -17.2С, июля +18.8 С. Продолжительность периода с температурой выше +10 С составляет 110-115 дней. На теплое время года (температура выше +15 С) приходится 55 дней с максимумом в июле. Количество дней с устойчивым снежным покровом - 145-185, максимальная высота снежного покрова 16-70 см. Почвы темно-серые различной степени оподзоленности. оглеения и с разной мощностью гумусового горизонта. Агрохимические особенности почв полей, на которых проводили испытания, представлены в таблице 2.3.
Географическое распространение грибов рода Fusarium
Анализ географического распространения грибов рода Fusarium в почвах лесопитомников Средней Сибири показал, что максимальное количество видов (10) выявлено в двух зонах: травяные леса с островами лесостепи и островные лесостепи и степи, что, возможно, обусловлено благоприятным сочетанием экологических факторов температуры, влажности и рН почвы в этих лесорастительных зонах (табл.2.1, 2.2; прил., табл. 1). Видовой состав и частота встречаемости оказались идентичными: вид F. sporotrichioides является доминирующим, F. oxysporum, F. sambucinum и F. semitectum - типичными редкими, все остальные виды - случайными (табл. 3.3, 3.4).
В зоне южной тайги распространены 6 видов рода Fusarium; F. sporotrichioides также является доминирующим видом, F. chlamydosporum - типичным редким, F. oxysporum, F. avenaceum, F. monilifonne и F. dimerum - случайными (табл. 3.5). В зоне влажной подтайги и горно черневой темнохвойной тайги из 6 видов, распространенных в почвах лесопитомников, ни один вид не является доминирующим: F. sporoirichioides и F. chlamydosporum - типичные частые, остальные виды - случайные (табл. 3.6).
Таким образом, только 4 вида рода Fusarium из 12 встречаются в лесопитомниках всех исследуемых лесорастительных зон Средней Сибири: F.sporotrichioides, F. oxysporum, F. chlamydosporum и F. avenaceum, однако частота их встречаемости в почвах не одинакова. Так F. sporotrichioides отмечен как доминирующий вид в зонах южной тайги, травяных лесов с островами лесостепи, островных лесостепей и степей, и как типичный частый - в зоне влажной подтайги PI горно-черневой темнохвойной тайги. F. oxysporum и F. chlamydosporum являются типичными видами только в двух лесорастительных зонах: F. oxysporum - в зонах травяных лесов с островами лесостепи и островных лесостепей и степей, F. chlamydosporum - в зонах южной тайги и влажной подтайги и горно-черневой тайги. Вид F. avenaceum отмечен во всех лесорастительных зонах как случайный (табл. 3.3-3.6). Таблица 3.4 - Встречаемость видов рода Fusarium (%) в почвах лесопитомников зоны островных лесостепей и степей
Второе место по географическому распространению занимают виды F. moniliforme и F. semitectum: они выявлены в 3-х лесорастительных зонах. Оба этих вида встречаются в зонах травяных лесов и островных лесостепей, однако, вид F. moniliforme распространен также в зоне южной тайги, F. semitectum - в зоне влажной подтайги и горно-черневой темнохвой ной тайги. При этом F. monililiforme является случайным видом во всех исследуемых почвах лесопитомников; F. semitectum отмечен как типичный редкий вид в двух зонах - травяных лесов с островами лесостепи и островных лесостепей, и как случайный вид в зоне влажной подтайги и горно-черневой тайги (табл. 3.3 - 3.6).
Многолетние исследования показали, что в почвах лесопитомников Средней Сибири широко распространены грибы рода Fusarium. Исследованиями Е.Е. Якименко (1997) было установлено, что в почвах двух лесопитомников Средней Сибири встречаются 9 видов рода Fusarium, среди которых доминирует F. avenaceum. Согласно результатам, полученным в период наших исследований, в почвах 12 лесопитомников Средней Сибири, расположенных в четырех лесорастительных зонах, было обнаружено 12 видов, из которых только F. sporotrichioicles во всех изученных зонах является доминирующим либо типичным частым. Кроме того, высокий процент встречаемости F. sporotrichioides в погибших и больных растениях определяет его значимость в патогенезе сеянцев и дает основание считать этот вид наиболее опасным для возникновения инфекционного полегания в лесопитомниках Средней Сибири в настоящее время.
Несмотря на невысокую частоту встречаемости в почве видов F. ni-vale, F. solani и F. moniliforme, при высокой плотности посадочного материала и наличии растительных остатков, они могут также представлять опасность для сеянцев хвойных в зонах локализации этих видов. Потенциально не опасными в Средней Сибири следует считать виды F. hetero-sporum, F. lateritium и F. dimerum, поскольку они редко выделяются из патологического материала, а частота встречаемости их в почве невелика (табл. 3.3-3.6).
Фитотоксические свойства видов рода Fusarium в отношении семян хвойных
Большинство видов фитопатогенных микромицетов представляют по своему составу сложный комплекс, включающий в себя несколько форм, отличающихся специализацией к растению хозяину (Стэкмен, Харрар, 1959; Мюллер, Леффлер, 1995). Патологическое действие видов рода. Fusarium на растения определяется их токсичностью, патогенностью и агрессивностью. Эти показатели сильно варьируют у различных видов и популяций внутри вида (Билай, 1977; Вандерпланк, 1981; Чекаников, Соколова, 1997: Дьяков, 1998; Marasas et al, 1986; Miller et al, 1993; Abbas et al, 1995; James et al, 1995; 1997; Hasan, 1999). Большинство исследователей склонно считать, что грибы рода Fusarium вызывают заболевания, в основном, у ослабленных растений. Обладая широким диапазоном адаптивных реакций, виды рода Fusarium способны переходить от сапротрофного питания к паразитированию на тканях и органах растений (Горленко, 1978; 1995; Дьяков,1998).
Локализация лесных питомников на площадях, используемых ранее для возделывания сельскохозяйственных культур, а также отсутствие длительного периода севооборотов создают благоприятный фон для возникновения вирулентных рас фитопатогенов сеянцев хвойных и развития инфекционного полегания (Чулкина, 1985; Халанская и др., 1992).
Исследование фитотоксических свойств 71 изолята вида Fusarium sporotrichioides, выделенных из почвы ризосферы и корневой системы больных и погибших сеянцев, показало, что все они оказывали сильное токсическое действие на прорастание семян Larix sibirica L., Pinus sylvesris L. и Picea obovata L. (на 68 - 96 %) (табл. 5.1). При этом высокой фито-токсичностью обладали изоляты, выделенные как из почвы, так и сеянцев хвойных в различных лесорастительных зонах Средней Сибири.
Не токсичных или слабо токсичных изолятов выявлено не было, что свидетельствует о доминировании одной высокотоксичной группы, обладающей высокой конкурентоспособностью и приспособляемостью по сравнению с другими видами почвенных микромицетов. Следует отметить, что среди всех выделенных представителей вида F. sporotrichioid.es максимальную степень токсичности проявляли изоляты, синтезирующие темный карминно-красный пигмент на КДА (60), тогда как изоляты, частично утратившие такую способность (11), были менее активны в отношении семян хвойных (табл. 5.1).
Fusarium oxysporum известен как сложный вид, имеющий более 80 специализированных форм, вызывающих заболевания многих сельскохозяйственных растений. По мнению одних авторов эти формы узко специализированы, по мнению других - нет четкой корреляции между специализацией к хозяину и местом локализации (Дьяков, Долгова, 1995).
Согласно результатам наших исследований, представители F. oxysporum подразделяются на две группы. В первую группу объединяются изоляты (28), проявляющие сильное токсическое действие только в отношение семян Picea obovaia L. и Pinus sylvesiris L. Изоляты этой группы были выделены из ризосферной почвы, а также сеянцев ели и сосны. Вторая группа изолятов (13) является более широко специализированной фор 87 мой, проявляющей среднее и высокое токсическое действие в отношении семян всех исследуемых хвойных пород (табл. 5.2). Таким образом, исследуемый вид F. oxyspomm гетерогенен по признаку токсичности.
Изоляты вида Fusarium chlamydosporum оказывали сильное фитоток-сическое действие на прорастание семян Picea obovata L., Firms sylvestris L. (64.3 - 94.5%) и не подавляли прорастание семян Larix sibirica L. (табл. 5.3), что свидетельствует о внутривидовой гетерогенности по проявлению фитотоксических свойств. Возможно, структура популяции формировалась при селективном влиянии хозяина на направление отбора клонов по признаку фитотоксичности. Однако наличие резистентности растения может оказать влияние на формирование новой популяции патогена, способной преодолеть действие генов устойчивости (Простакова и др., 1992).
