Введение к работе
Актуальность проблемы
Фузариоз зерна является одним из наиболее опасных заболеваний сельскохозяйственных культур по всему миру, в том числе в различных географических зонах России (Кононенко и др., 1999; McMullen et al., 1997; Osborn and Stein, 2007). Представители рода Fusarium поражают широкий круг сельскохозяйственных растений: ячмень, пшеницу, рожь, овёс, кукурузу, рис и др. Следствием заражения являются существенное снижение количества и качества урожая и, как следствие, большой экономический ущерб: так, в США во второй половине 90-х годов суммарные потери, причинённые фузариозом, составили порядка 1.5 млрд. долларов (Nganje et al., 2004). Кроме того, заражение зерна возбудителями фузариоза приводит к накоплению в нём вторичных токсических метаболитов грибов – опасных микотоксинов (фузариотоксинов). Актуальность изучения и выявления токсигенных грибов и продуцируемых ими токсинов признана во всём мире и связана с их чрезвычайно высокой угрозой для здоровья человека и животных (Logrieco et al., 2002; Krnjaja et al., 2011). На сегодняшний день подтверждением важности изучения и диагностики токсигенных возбудителей фузариоза являются принятые Европейским союзом правила, регулирующие методы отбора проб и анализов для обязательного контроля микотоксинов в продуктах питания и кормах (Commission regulation (EC) № 856/2005 of 6th June 2005).
Род Fusarium является сложным в таксономическом отношении. Виды, относящиеся к нему, отличаются друг от друга как по типу спороношения – для них характерны как микро-, так и макроконидии, так и по наличию или отсутствию половой стадии в цикле развития, а также разным типам спаривания (Windels, 1991; Leslie and Summerell, 2006). Существующие на сегодняшний день таксономия рода Fusarium противоречива и имеет целый ряд недостатков, затрудняющих точную видовую идентификацию исследуемых штаммов, поскольку базируется на анализе характеризующихся высокой изменчивостью морфологических структур (Nelson et al., 1983; Nelson, 1991; Leslie et al., 2001). Поэтому важную роль в изучении разнообразия грибов рода Fusarium и их видовой идентификации играют молекулярные технологии (McCartney et al., 2003; Ward et al., 2004; Borman et al., 2008). С этих позиций особенно актуальными представляются подходы, позволяющие сравнивать специфические метаболиты грибов (прежде всего токсины) (Moss and Thrane, 2004; Frsivad et al., 2008; Zain, 2010), и проводить анализ полиморфизма геномных и митохондриальных ДНК (O’Donnell, 1996; Visentin et al., 2010). Слабой стороной первого подхода является то, что отсутствие токсина не означает отсутствия их продуцента, поскольку синтез токсинов может начаться при изменении условий хранения зерна и продуктов его переработки под воздействием различных биотических и абиотических стрессов.
Наиболее простым и специфичным методом детекции возбудителей фузариоза на сегодняшний день является полимеразная цепная реакция (ПЦР), в том числе её модификация, основанная на использовании флуоресцентно-меченых зондов – ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) (Bustin et al., 2009). Этот подход позволяет проводить анализ без использования электрофореза, что сокращает время исследования, а также сводит к минимуму риск контаминации рабочего пространства продуктами амплификации, и, как следствие, вероятность получения ложноположительных результатов.
Возможности ПЦР-идентификации представителей рода Fusarium ограничены тем, что на сегодняшний день выявлено лишь небольшое число локусов, для которых разработаны специфические SCAR-маркеры (sequence characterized amplified region; Paran and Michelmore, 1993), позволяющие с высокой достоверностью определять видовую принадлежность гриба (Mule et al., 1997; Niessen and Vogel, 1998; Kristensen et al., 2005). Разработка систем идентификации и расширение возможностей диагностики возбудителей фузариоза требует выявления новых ДНК-маркеров, специфичных на меж- и внутривидовом уровне. Кроме того, изучение структуры и полиморфизма генома представителей рода Fusarium необходимо и для расширения таксономических и филогенетических данных, для анализа функциональной активности отдельных генов.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы было выявление полиморфных локусов ДНК и разработка на их основе новых маркеров для таксономической характеристики, диагностики и идентификации токсигенных грибов рода Fusarium. Объектами исследования были наиболее распространённые токсигенные виды возбудителей фузариоза зерна, такие как F. graminearum, F. culmorum, F. cerealis, F. sporotrichioides, F. langsethiae, F. poae, F. avenaceum, F. tricinctum, F. acuminatum, F. equiseti, F. solani.
В ходе исследования предстояло решить следующие задачи:
- Провести анализ последовательностей нуклеотидов ДНК грибов рода Fusarium, депонированных в GenBank NCBI.
- Разработать SCAR-маркеры для видоспецифичной идентификации видов грибов рода Fusarium, а также для идентификации групп видов в соответствии со спектрами продуцируемых ими микотоксинов.
- Провести испытания разработанных тест-систем на полевых образцах заражённого зерна.
- Провести оценку генетического разнообразия исследуемых штаммов возбудителей фузариоза методом RAPD-анализа.
- Подготовить регламент и методическую базу для внедрения стандартных диагностических наборов в производство.
Научная новизна работы
В ходе работы проведён комплексный анализ генетического разнообразия последовательностей нуклеотидов генов TEF1, PHO, -TUB и ряда генов, участвующих в синтезе микотоксинов 11 видов грибов рода Fusarium, паразитирующих на злаковых культурах. В результате выявлены новые полиморфные маркерные участки, к последовательностям которых подобраны специфичные праймеры, обеспечивающие идентификацию возбудителей фузариоза, в том числе в соответствии со спектрами продуцируемых ими микотоксинов. Проведен RAPD-анализ исследуемых штаммов, позволивший более точно определить степень филогенетического родства видов, и корректность их распределения по секциям в соответствии с существующей таксономией.
Впервые на территории России выявлен штамм вида F. torulosum, поражающего помимо злаков также плодовые культуры (Leslie and Summerell, 2006), и характеризующийся высокой изменчивостью, затрудняющей его идентификацию с помощью классических методов.
На основе сконструированных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов созданы тест-системы, адаптированные в формат ПЦР в реальном времени. Специфичность разработанных праймеров показана в тестах с ДНК 90 штаммов возбудителей фузариоза злаковых. Кроме того, продемонстрирована эффективность использования предложенных тест-систем для качественной и количественной оценки зараженности зерна возбудителями фузариоза.
Практическая значимость работы
Созданные в ходе работы тест-системы позволяют с высокой чувствительностью и специфичностью детектировать и идентифицировать грибы рода Fusarium. Использование систем, детектирующих группы видов со сходными спектрами продуцируемых микотоксинов, позволяет минимизировать количество анализов, необходимых для диагностики заражённости зерна возбудителями фузариоза. Предложенный подход позволяет специфично и за короткое время оценить видовой состав грибов, присутствующих в анализируемой партии зерна, и предсказать возможное накопление в ней микотоксинов.
Внедрение результатов работы
На основе разработанных тест-систем созданы стандартные наборы для ПЦР-диагностики возбудителей фузариоза. В настоящее время наборы внедрены в производство на базе ЗАО «НПФ ДНК-технология»; их коммерческое распространение осуществляется ООО «АгроДиагностика».
Апробация работы и публикации
По теме диссертации опубликовано 4 статьи в рецензируемых журналах и 1 методические указания.
Материалы диссертации были представлены на ХХII и XXIII Зимних научных школах ИБХ РАН «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2010, 2011); Втором междисциплинарном микологическом форуме (Москва, 2010); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика-2010» (Москва, 2010); Школе-конференции молодых учёных «Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины-2011» (Москва, 2011); Научной конференции по биоорганической химии и биотехнологии «X чтения памяти академика Ю.А. Овчинникова» (Москва, 2011); 2-й школе-конференции РАСХН и ПАН «Adaptation to Climat Change in the Baltic Sea Region: contributions from Plant and Microbial Biotechnology» (Миккели, Финляндия, 2010); международном симпозиуме «Reduction of mycotoxins in production chains of EU and Russia: modern investigations and practical features» (Москва, 2011); VII международном симпозиуме «EU-Russia: cooperation in biotechnology, agriculture, forestry, fisheries & food» (Москва, 2012).
Структура и объём работы
Диссертация изложена на 102 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», выводов, списка литературы ( наименований) и приложений. Работа изложена на 102 страницах и содержит рисунка и таблиц.
