Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 8
2.1. Общие представления о репликации ДНК 8
2.2. Предшественники биосинтеза нуклеиновых кислот 13
2.2.1.. Биосинтез пуриновых и пиримидиновых компонентов нуклеиновых кислот 13
2.2.1.1. Путь синтеза нуклеозидтрифосфатов de novo 14
2.2.1.2. Путь синтеза нуклеозидтрифосфатов salvage 19
2.2.1.3. Взаимосвязь de novo и salvage путей биосинтеза предшественников нуклеиновых кислот 24
2.3. Ферменты фосфорилирования нуклеозидов 26
2.3.1. Нуклеозидкиназы 26
2.3.2. Нуклеотидкиназы 45
2.4. Ферменты фосфорилирования предшественников нуклеиновых кислот в клетках морских бактерий 58:
3: Материалы и методы 62
4. Результаты исследования и их обсуждение 70
4.1. Определение скорости роста клеток морских микроорганизмов в присутствии меченых нуклеозидов 70
4.2. Определение активности нуклеозидкиназ в экстрактах морских микроорганизмов 81
4.3. Анализ спектра нуклеозидкиназ морских бактерий с помощью ионообменной хроматографии 87
4.4. Свойства нуклеозидкиназ: 99
4.5. Выделение нуклеозидкиназ клеток морских микроорганизмов 103
4.5.1: Выделение тимидинкиназы из штамма Pseudomonas sp. КММ
4.5.2. Свойства тимидинкиназы штамма Pseudomonas sp. КММ 3694 105
4.5.3. Выделение уридинкиназы из штамма Pseudoalteromonas aurantia NCIMB2033 108
4.5.4. Свойства уридинкиназы штамма Pseudoalteromonas aurantia NGTMB2033 110
4.6. Нуклеозидкиназы из клеток бактерии Yersinia pseudotuberculosis 113
4.6.1. Выделение и изучение свойств тимидин- и уридинкиназ из экстракта бактерии Yersinia pseudotuberculosis 114
5. Выводы. 121
6. Список использованной литературы 123
- Путь синтеза нуклеозидтрифосфатов de novo
- Ферменты фосфорилирования предшественников нуклеиновых кислот в клетках морских бактерий
- Определение скорости роста клеток морских микроорганизмов в присутствии меченых нуклеозидов
- Свойства тимидинкиназы штамма Pseudomonas sp. КММ 3694
Введение к работе
В последнее время морские микроорганизмы, в частности бактерии,, привлекают внимание исследователей, работающих в таких областях, как микробиология, биохимия и биотехнология. Это связано с особенностями метаболизма бактерий, обусловленными средой их обитания. Условия существования, абиотические и биотические, оказывают значительное влияние на жизнедеятельность морских микроорганизмов. Колебания температур вод Мирового Океана в весьма широком интервале в зависимости и от географической широты, и от глубин, определяют распространение мезофильных, психрофильных и психроактивньтх прокариот в море. В горячих глубоководных источниках океана, где жизнь других организмов сообщества зависит от прокариот-хемосинтетиков, а не от энергии Солнца (фотосинтеза), существуют, и экстремально термофильные микроорганизмы. Большое влияние на жизнедеятельность микробов моря оказывает также гидростатическое давление, состав и содержание в воде различных растворенных солей.
Такие разнообразные, часто экстремальные условия обитания морских микроорганизмов дают основания предполагать наличие уникальных метаболических путей, обеспечивающих рост и размножение морских бактерий, а также возможность обнаружения в их клетках ферментов, отличающихся по своим свойствам от аналогичных ферментов наземных организмов.
Морская вода представляет собой естественную среду, в которой имеются все компоненты, необходимые для жизнедеятельности бактериальных клеток. Здесь находятся растворенные пептиды, аминокислоты, углеводы, различные компоненты нуклеиновых кислот и другие органические и неорганические соединения. Морские бактерии участвуют в кругообороте органических веществ Океана, и их клетки способны использовать имеющиеся в среде обитания предшественники в собственных метаболических процессах, а не создавать эти соединения из низкомолекулярных органических и неорганических веществ.
Основным показателем продуктивности бактериальных (и не только) клеток является биосинтез нуклеиновых кислот. Увеличение количества ДНК в экстрактах клеток свидетельствует об. их делении, РНК - определяет метаболическую активность клетки.
ДНК и РНК синтезируются из пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, которые могут образовываться как из низкомолекулярных компонентов de novo, так и из готовых фрагментов (основания, нуклеозиды, остатки рибозы или дезоксирибозы) - salvage путь биосинтеза. Находящиеся в морской воде нуклеиновые кислоты и их компоненты, являются для бактерий не только источником азота, углерода и фосфора, но и могут использоваться.в качестве предшественников синтеза нуклеиновых кислот.
Молекулярный механизм утилизации морскими бактериями экзогенных предшественников практически не изучен. Широко применяемый метод определения биосинтеза ДНК с помощью радиоактивно меченного тимидина, а также РНК - с помощью меченного уридина, свидетельствует только о включении этих соединений ъ макромолекулы клетки, но не дает возможности определить, в какие именно биополимеры включается тот или иной предшественник. Чтобы включиться в состав; нуклеиновых кислот, экзогенные нуклеозиды должны проникнуть внутрь клетки и фосфорилироваться клеточными ферментами до нуклеозидтрифосфатов, являющихся непосредственными субстратами для ДНК- и РНК-полимераз. Ключевую роль в процессе фосфорилирования предшественников синтеза нуклеиновых кислот играют нуклеозидкиназы. Хотя включение меченых нуклеозидов часто используется в качестве показателя продуктивности микробных сообществ, о наличии нуклеозидкиназ в клетках морских бактерий практически нет данных. Нет сведений ни о составе ферментов фосфорилирования нуклеозидов, ни об их свойствах и специфичности.
Целью работы является изучение процесса утилизации экзогенных предшественников синтеза нуклеиновых кислот клетками морских бактерий.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Исследовать способность морских бактерий включать экзогенные тимидин и уридин в состав нуклеиновых кислот.
Протестировать активности ферментов фосфорилирования нуклеозидов в экстрактах клеток морских бактерий.
Определить спектр нуклеозидкиназ, катализирующих фосфорилирование тимидина и уридина в клетках некоторых штаммов.
Разработать схемы выделения тимидин- и уридинкиназы и изучить свойства очищенных нуклеозидкиназ из трех бактериальных штаммов.
В результате проведенных исследований было показано, что клетки исследованных морских бактерий способны включать экзогенные тимидин и уридин в молекулы нуклеиновых. кислот, при этом метка каждого из этих предшественников может обнаруживаться как в ДНК, так и в РНК.
Впервые установлено присутствие в клетках нуклеозидкиназ, обеспечивающих фосфорилирование экзогенных предшественников. Показана гетерогенность нуклеозидкиназ в разных штаммах морских бактерий.
Впервые обнаружена множественность форм тимидин- и тимидилаткиназ среди представителей рода Pseudoalteromonas и уридинкиназы рода Bacillus sp. КММ 3573 и Pseudoalteromonas haloplanktis КММ 223. Показана способность некоторых тимидинкиназ катализировать дальнейшее фосфорилирование образующегося тимидинмонофосфата.
Из клеток Pseudomonas sp. КММ 3694, Pseudoalteromonas aurantia NCIMB 2033 и Yersinia pseudotuberculosis выделены и охарактеризованы тимидин- и уридинкиназы; исследованы их физико-химические свойства и субстратная специфичность.
Показано, что морские бактерии могут быть новым перспективным источником ферментов, в частности, нуклеозид- и нуклеотидкиназ. Очищенные ферменты могут быть с успехом использованы, в биотехнологии и молекулярной биологии, а также при производстве меченых нуклеозидмоно-, -ди- и -трифосфатов.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Путь синтеза нуклеозидтрифосфатов de novo
Репликация - сложный и многоступенчатый процесс удвоения родительской ДНК, необходимый при делении клеток, протекающий на одном или одновременно на многих участках хромосомы (Komberg, 1980). Автономно реплицирующийся участок хромосомы с одной точкой инициации репликации называется репликоном (Komberg, 1980; Laskey, Mechali, 1982; Komberg, 1988).
Размеры репликонов у различных организмов сильно варьируют (от 5 до 150 мкм), их можно наблюдать непосредственно с помощью электронной, микроскопии и радиоавтографии (Gyurasits, Wake, 1973; Wolfson, Dressier, 1972). Наиболее изученным является процесс репликации ДНК у Escherichia colt В Е. со/г ДНК реплицируется по однорепликонному механизму, скорость движения репликативной вилки 20 мкм/мин или примерно 1500 пар нуклеотидов в секунду и полный геном длиной 4x106 пар нуклеотидов реплицируется за 40 минут (Komberg, 1980; Komberg, 1988). Частота инициации новых циклов репликации зависит от скорости роста бактериальных клеток, и в клетках быстро растущих бактерий могут содержаться хромосомы с несколькими работающими репликативными вилками, хотя для репликации одной бактериальной хромосомы их требуется только две (Komberg, 1988; Botchan, 1996). Репликация - полуконсервативный процесс, когда на каждой из родительских цепей ДНК синтезируется одна дочерняя (Корнберг, 1977). Репликация ДНК начинается в уникальном сайте, так называемом участке начала репликации (origin, ori). Хромосома Е. coli содержит единственную f область начала репликации, названную огіС, на которой происходит инициация репликации (Komberg, 1988). Природная ДНК является су перекрученной и для протекания репликации необходимо удаление супервитков. Процесс инициации включает участие топоизомеразы, ответственной за релаксацию суперспиральной ДНК, которая надрезает одну из двух цепей, вызывая локальное раскручивание спирали ДНК (Wang, 1996). Сразу же после инициации возникает репликативная вилка - Y-подобная структура (Gefter, 1975; Fujimura, Das, 1980), которая движется от огі в одном направлении (однонаправленная репликация) или чаще, в двух направлениях. При двунаправленной репликации образуются две репликативные вилки, движущиеся в противоположных направлениях от точки ori (Kornberg, 1988; Romberg, 1982). Репликация одной цепи ДНК в репликативной вилке проходит непрерывно (опережающая цепь), другой - прерывисто (запаздывающая цепь). Синтез опережающей цепи продолжается от точки инициации до границы репликона, происходит считывание родительской цепи в направлении 3 — 5 и образуется дочерняя цепь в направлении 5 — 3 . Синтез опережающей цепи Е. coli (рис. 1) начинается на участке oriC праймазой, которая инициирует синтез РНК-праймера на,родительской цепи ДНК. Длина рибонуклеотидной затравки у Е. со//составляет 7- 10 нуклеотидов (Kornberg, 1988; Van der Ende et al., 1985; Корнберг, 1977). Ферменты инициации репликации вместе со вспомогательными белками входят в состав сложных комплексов — праймосом,, которые, в свою очередь, являются компонентами реплисомы, полного комплекса белков и ферментов, осуществляющих процесс репликации. Праймосома Е, coli содержит около 20 полипептидов с общей массой 10 Дa(Korabeгg, 1982; Komberg, 1983; Kornberg, 1988). В состав праймосомы входят: праймаза; белки, продукты генов dnaB (хеликазы) и dnaC; белки п, п , п", і и SSB-белки (Kornberg, 1988). Праймосома движется вдоль цепи ДНК за счет использования энергии АТР, гидролизуемого до ADP и неорганического фосфата белком п . Расплетание двойной спирали ДНК в репликативной вилке происходит за счет активности хеликазы. В Я. coli обнаружены два вида хеликаз, одна из них, продукт гена dnaB, связывается с цепью ДНК, которая затем будет реплицировала как запаздывающая, и двигается впереди репликативной вилки по этой цепи в направлении 5 - 3 . Вторая хеликаза, так, называемая гер-белок, связывается с опережающей цепью и движется также впереди репликативной вилки, но в направлении 3 — 5 родительской цепи (Kornberg, 1982; Корнберг, 1977). SSB- белки (single stranded binding protein) связываются с одноцепочечной ДНК и стабилизируют ее, препятствуя образованию дуплекса. Комплекс белков п", і, а также белков-продуктов генов dnaB и dnaC, используя энергию АТР, поддерживает вторичную структуру ДНК в состоянии, необходимом для синтеза "затравки" праймазой (Kornberg, 1988).
В состав наиболее хорошо изученного репликативного комплекса (реплисомы) Е. coli входит 35-40 молекул белков общей массой более 2x10 Да (Kornberg, 1980; Kornberg, 1982; Kornberg, 1983). Кроме праймосомы, в реплисому-Е. coli входят ДНК-полимеразы 1 и III, гираза и лигаза (Kornberg, 1988). Сразу же после синтеза праймера праймосомой в участке начала репликации на опережающей цепи репликативныи комплекс начинает удлинять затравку.
Процесс элонгации дочерней цепи ДНК катализирует ДНК-полимераза. В результате реакции полимеризации, происходит образование фосфодиэфирной связи между концевым дезоксирибонуклеозидмонофосфатом, имеющим свободную З -ОН группу, и а-фосфатной группой следующего дезоксинуклеозид-5-трифосфата, комплементарного матричной, цепи ДНК. После каждого акта действия ДНК-полимеразы, цепь ДНК удлиняется на один дезоксинуклеозидмонофосфатный остаток.
Основной реплицирующей ДНК-полимеразой Е. coli является холофермент ДНК-полимеразы III, который представляет собой сложный комплекс из 7 белковых субъединиц. Поскольку синтез ДНК катализируется исключительно в 5 — 3 направлении, только одна из цепей (опережающая) может синтезироваться непрерывно. Синтез же запаздывающей цепи происходит прерывисто, в виде фрагментов Оказаки. Размер фрагментов Оказаки прокариот составляет 1000 — 2000 нуклеотидов. Каждый, фрагмент инициируется рибо-праймером с помощью праймосомы, входящей в состав реплисомы, и элонгируется ДНК-полимеразой III (Wolfson, Dressier 1979; Scheckman et al., 1974;Kornberg, 1988).
Ферменты фосфорилирования предшественников нуклеиновых кислот в клетках морских бактерий
В литературе практически отсутствуют данные о выделении и очистке нуклеозид- и нуклеотидкиназ из клеток морских бактерий. О присутствии этих ферментов судят, в основном, по способности бактериальных клеток включать экзогенные предшественники во вновь синтезированные нуклеиновые кислоты. Так, включение тритиевого тимидина в ДНК может свидетельствовать о наличии в клетках тимидинкиназы.
Исследовав 4 штамма Alcaligenes spp., 5 штаммов Alteromonas spp. и 6 штаммов Pseudomonas spp. Pollard и Moriarty (1984), обнаружили,: что большинство из этих микроорганизмов с различной скоростью включают тимидин в ДНК. У двух видов бактерий {Pseudomonas bathycetes, PI marina) метка из тимидина не включалась, что обусловлено, по мнению авторов, отсутствием у них системы транспорта тимидина (Pollard, Moriarty, 1984). Предполагается, что транспорт и фосфорилирование тимидина тимидинкиназой в клетках морских бактерий это два разных процесса (Jeffrey, Paul, 1990), в то время как у Е. со/гтимидинкиназа отвечает и за перенос экзогенного тимидина в клетку и за его фосфорилирование (Pandey, 1984).
Изучая 41 штамм гетеротрофных морских бактерий из заливов Тампа (штат Флорида, США) и Чесапик (штат Мериленд, США), Jeffrey и Paul показали, что большая часть исследованных ими бактерий включает тимидин в ДНК, при этом они предположили, что кроме тимидинкиназы в процесс усвоения клетками тимидина могут быть вовлечены и другие охарактеризованные пока ферменты. Отсутствие включения тимидина у небольшой части бактерий может быть обусловлено как отсутствием ферментов фосфорилирования данного нуклеозида, так и неспособностью транспортировать экзогенный предшественник в клетку (Jeffrey, Paul, 1990). В экстрактах 10 из исследованных бактерий те же авторы тестировали активность тимидинкиназы и показали, что у микроорганизмов, включающих тимидин в клетку, наблюдается значительный уровень активности тимидинкиназы. У микроорганизмов, неспособных включать экзогенный тимидин в клетку, активность тимидинкиназы в клеточных экстрактах отсутствовала. Было показано, что штамм Vibrio sp. D19 не способен включать тимидин в кислотонерастворимую фракцию, что обусловлено отсутствием как тимидинкиназы, так и системы транспорта тимидина (Jeffrey, Paul, 1990), Следует отметить, что тестирование активности тимидинкиназы авторы проводили на клеточных экстрактах, не определяя физико-химические свойства и субстратную специфичность фермента, поэтому возможно, что фосфорилирование тимидина в клетках морских микроорганизмов осуществляется неспецифической нуклеозидкиназой, способной использовать тимидин в качестве субстрата.
В этой же работе Jeffrey и Paul (Jeffrey, Paul, 1990) провели исследование гибридизации генов тимидинкиназ морских бактерий Pseudomonas aeruginosa и P. stutzeri, способных включать тимидин в нуклеиновые кислоты, с генами тимидинкиназы Е. coli и тимидинкиназы вируса, простого герпеса. Тимидинкиназа Е. coli обладает строгой субстратной специфичностью, фосфорилирует дезокситимидин и дезоксиуридин. (Okazaki, Kornberg, 1964). Тимидинкиназа вируса простого герпеса обладает широкой субстратной специфичностью и фосфорилирует тимидин, дезоксицитидин, дезоксиуридин, дезоксиаденозин и дезоксигуанозин, а также их аналоги (Littler, Arrand, 1988). Авторами было показано, что гены тимидинкиназ морских бактерий не гибридизовались ни с геном тимидинкиназы вируса простого герпеса, ни с геном тимидинкиназы Е. coli, что, по их мнению (Jeffrey, Paul, 1990), может означать ограниченную консервативность нуклеотидных последовательностей среди генов тимидинкиназ морских бактерий, наличие неспецифических ферментов фосфорилирования предшественников нуклеиновых кислот, либо уникальные пути фосфорилирования нуклеозидов в морских микроорганизмах.
В настоящее время в литературе есть данные только об одном ферменте фосфорилирования тимидина морских бактерий — тимидинкиназе термофильной бактерии Rhodothermus marinus, выделенной из горячих щелочных подводных источников (Blondal et al., 1999). Blondal с соавторами описал клонирование, секвенирование и экспрессию в Е. coli гена тимидинкиназы R. marinus. Полученный рекомбинантный фермент был очищен (с выходом 95%) и охарактеризован (Blondal et al., 1999).
Молекулярная масса рекомбинантной тимидинкиназы R. marinus после электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия составляет 24 кДа, что находится в близком соответствии с молекулярной массой, определенной по аминокислотной последовательности фермента; (23,6 кДа): Молекулярная масса тимидинкиназы, определенная с помощью гель-фильтрации, составляет 85 кДа. Авторы предположили, что фермент состоит из четырех субъединиц.
Максимальная активность фермента фосфорилирования тимидина R,.. marinus проявляется при 65С, при 25С активность тимидинкиназы составляет 24% от наибольшей активности, при 75С - 40%, а при 85G - лишь 5% от максимальной активности тимидинкиназы. Изучая термостабильность тимидинкиназы R. marinus, Blondal с соавторами показал, что фермент сохраняет 50% активности при 90С в течение 15 минут. Инактивацию фермента при 85С авторы объясняют неустойчивостью тетрамерной структуры при высокой температуре (Blondal et al., 1999). Оптимум рН фермента составляет рН 9,0, но тимидинкиназа R. marinus с низкой скоростью способна осуществлять реакцию фосфорилирования тимидина и при рН 8,0, а также при рН 10,0 (Blondal etal;, 1999).
Тимидинкиназа R. marinus в качестве донора фосфатных групп использует АТР. Конечный продукт цепи фосфорилирования тимидина dTTP в концентрации 0,1 мМ ингибирует активность фермента на 95%, в то время как другие дезоксинуклеозидтрифосфаты (dCTP, dATP И dGTP) снижают его активность на 40-60%. Нуклеозиддифосфатьт (dGDP, dADP, dCDP и dTDP) не влияют на активность тимидинкиназы R. marinus (Blondal et al., 1999). В настоящее время имеется только одна монография, посвященная ферментам морских микроорганизмов (Михайлов и др., 2004), в ней авторы приводят сведения об основных физико-химических свойствах и субстратной специфичности ферментов, принадлежащих к различным классам. В большей, части этой монографии авторы описывают ферменты, принадлежащие к классу гидролаз, катализирующих гидролиз различных связей в макромолекулах. Однако сведений, касающихся ферментов, принадлежащих другим классам, очень мало. Кроме того, в монографии практически нет данных о нуклеозид- и нуклеотидкиназах, играющих важную роль в биосинтезе предшественников синтеза нуклеиновых кислот.
В предоставленной работе исследуется процесс утилизации экзогенных тимидина и уридина клетками морских бактерий, а также изучаются свойства нуклеозидкиназ, выделенных из морских бактерий, катализирующих первую стадию фосфорилирования тимидина и уридина до ТМР и UMP и относящихся к классу трансфераз, в частности фосфотрансфераз.
Определение скорости роста клеток морских микроорганизмов в присутствии меченых нуклеозидов
Для изучения динамики роста микроорганизмов в присутствии меченых, нуклеозидов и включения предшественников были проведены исследования двух штаммов КММ 3689 и КММ 636, принадлежащих родам Arthrobacter и Pseudoalteromonas (рис. 8 и 9). Оба штамма способны включать меченые тимидин и уридин в нуклеиновые кислоты бактерий (табл. 1). Штамм КММ 3689 более эффективно включал метку из экзогенного уридина, а КММ 636 - из тимидина, причем уровень включения тимидина в нуклеиновые кислоты обоих штаммов был примерно одинаков. После 24 часов инкубации с мечеными предшественниками уровень их включения в состав нуклеиновых кислот снижался.
Эффективность включения тритиевого тимидина или уридина в нуклеиновые кислоты является широко признанным показателем бактериальной активности и используется для определения скорости роста и продуктивности бактерий в водной среде (Karl, 1982; Fuhram, Azam, 1982; Robarts etal:, 1986; Jeffrey, Paul, 1986).
Включение тимидина связано как с клеточным ростом, т.е. увеличением объема клеток, так и с клеточным делением (увеличением числа клеток) (Kirchman et al., 1982). Однако использовать показатели включения тимидина или уридина в кислотонерастворимый материал в качестве меры синтеза ДНК или РНК, соответственно, нельзя без учета специфики и степени мечения макромолекул (Karl, 1981). Используя различную чувствительность нуклеиновых кислот к щелочному гидролизу, мы определили степень включения меченых тимидина, и уридина в ДНК и РНК бактерий. В клетках штамма Arthrobacter sp. KMM 3689 практически весь экзогенный тимидин включался только в ДНК, тогда как у штамма Pseudoalteromonas maricaloris KMM 636 часть метки из-тимидина обнаруживалась в РНК. После 30 часов инкубации доля тритиевой метки из тимидина в составе ДНК снижалась по сравнению с 24-часовой инкубацией; Практически весь уридин включался в РНК. Небольшая часть метки из уридина обнаруживалась в составе ДНК клеток Arthrobacter sp. KMM 3689: Бактерии KMM 636 включали уридин только в РНК.
Параллельное измерением включения экзогенных предшественников в нуклеиновые кислоты определяли скорость, роста клеток обоих штаммов; Увеличение количества клеток исследованных штаммов наблюдалось до 30 часов в присутствии в среде либо тимидина, либо уридина. Скорость роста микроорганизмов зависела и от штамма, и от присутствующего в: среде нуклеозида. После 30 часов инкубации количество клеток не увеличивалось.
Скорость роста Pseudoalteromonas maricaloris в присутствии уридина была в 2 раза выше скорости роста штамма Arthrobacter, но, несмотря на это, отмечался более низкий уровень включения данного нуклеозида для КММ 636, по сравнению с клетками КММ 3689. В присутствии меченого тимидина рост клеток обоих штаммов находился примерно на одном уровне. Сравнение уровня включения метки из тимидина в нуклеиновые кислоты со скоростью роста в присутствии этого же нуклеозида у клеток КММ 3689 и КММ 636 показало, что и включение тимидина, и скорость роста в его присутствии было примерно одинаковым.
Следующим этапом работы было изучение включения экзогенных предшественников при инкубации клеток с радиоактивной меткой в течение одного часа (на ранней стадии экспоненциальной фазы роста бактерий) in.vivo. Для этого из коллекции морских микроорганизмов (КММ) ТИБОХ ДВО РАН было взято 57 штаммов бактерий.
Эффективность включения экзогенных нуклеозидов в РНК и ДНК клеток морских микроорганизмов определяли после их выращивания в среде, содержащей меченые тритием тимидин или уридин (табл. 1). Как видно из таблицы, все исследованные штаммы микроорганизмов способны включать радиоактивно меченые экзогенные предшественники в состав нуклеиновых кислот клеток. Экзогенный тимидин с высокой скоростью включался в состав биополимеров клеток штаммов Arthrobacter sp. КММ 3687, Arthrobacter sp. 3724, Corynebacterium spp. КММ 3691, 3699-3701, 3722, Pseudoalteromonas uHrawrtaNCIMB2033:
Меченый тритием уридин эффективно включался в клетки штаммов Arthrobacter spp. КММ 3684-3687, 3723, Corynebacterium spp. КММ 3691, 3699-3701, Pseudomonas sp. КММ 3695 и Pseudoalteromonas aurantia NCIMB 2033. Клетки штаммов, у которых наблюдалось эффективное включение тимидина в состав биополимеров, хорошо включали и уридин.
В литературе имеются данные о том, что большинство исследованных морских микроорганизмов способно включать экзогенный тимидин в состав ДНК клеток (Jeffrey, Paul, 1990; Pollard, Moriarty, 1984). Исключением являются некоторые представители родов Pseudomonas (Saito et al., 1985; Pollard, Moriarty, 1984; Jeffrey, Paul,.1990), Vibrio (Saito et al., 1985; Jeffrey, Paul, 1990), a также морские цианобактерии Synechococcus sp. (Pollard, Moriarty, 1984). Однако отсутствие включения может быть обусловлено не только тем, что у перечисленных бактерий нет необходимых для этого ферментов, ответственных за внутриклеточный метаболизм предшественников, но и неспособностью некоторых микроорганизмов транспортировать экзогенные нуклеозиды внутрь клетки.
Свойства тимидинкиназы штамма Pseudomonas sp. КММ 3694
Молекулярная масса тимидинкиназы, определенная методом гель-фильтрации на TSK-GELoyopearl HW-60, составила -130 кДа (рис. 20). Денатурирующий,электрофорез в полиакриламидном геле показал одну полосу с молекулярной массой —75 кДа. Вероятно, тимидинкиназа Pseudomonas sp. КММ 3694 состоит, из двух одинаковых субъединиц.
Фермент из Rhodothermus marinus состоит из четырех субъединиц размером 24 кДа (Blondal et al.,.1999). Молекулярная масса одной субъединицы тимидинкиназы из Trichomonas vaginalis, по данным электрофореза в полиакриламидном геле, составляет 31;5 кДа, предполагается, что мономер, может ассоциироваться в тетрамер (StrosselH et al., 1998): Тимидинкиназа Е. coli состоит из двух субъединиц с молекулярным весом 46500 (Rohde, Lezius, 1971). Молекулярный вес одной субъединицы тимидинкиназы из печени человека, определенный с помощью гель-фильтрации, составляет 49000, при этом фермент ассоциируется в комплексы с молекулярным весом 98000 и 340000 (Ellims, Van der Weyden, 1980).
Оптимум рН тимидинкиназы из штамма Pseudomonas sp. КММ- 3694 составил рН 8,5 в трис-HCl буфере. (рис. 21), что близко к оптимуму рН тимидинкиназы другой морской бактерии — Rhodothermus marinus (Blondal et al., 1999). В глицин-NaOH буфере уровень активности фермента Pseudomonas sp. КММ 3694 ниже по сравнению с активностью тимидинкиназы в трис-HGl буфере, с максимумом при рН 9,0. Оптимальный рН для тимидинкиназ, выделенных из разных источников, имеет широкий разброс значений от 6,8 до 9,0. Оптимум рН фермента, катализирующего фосфорилирование тимидина у бактериофага Т4 Е. coli, составляет рН 6,8 (Iwatsuki, 1977). Тимидинкиназа Е. coli проявляет максимальную активность при рН 7,5 в трис-HCl буфере. (Okazaki, Komberg, 1964), а оптимум рН тимидинкиназы из печени человека находится в области рН 9,0 (Ellims, Van der Weyden, 1980): Для реакции фосфорилирования тимидина ферменту Pseudomonas sp. КММ 3694 требуется присутствие в инкубационной смеси АТР и ионов двухвалентных металлов. Максимальная скорость реакции фосфорилирования, катализируемой тимидинкиназой КММ 3694, наблюдается при 1 мМ АТР, 15 мМ Mg2+. Реакция фосфорилирования может протекать и в присутствии Мп2+ с, максимумом при 5 мМ, однако скорость реакции в последнем случае намного ниже (рис. 22, 23). Тимидинкиназа Trichomonas vaginalis проявляет максимальную активность при Mg2+ 4,0-6,0 мМ (Strosselli et al:, 1998). Оптимальная концентрация Mg для тимидинкиназы Е. coli составляет 2,9 мМ (Okazaki, Kornberg, 1964), а для фермента из Phisarum potycephalum - 7,5-10,0 мМ (Chraibi, Wright, 1983), Соли одновалентных металлов (NaCl, КС 1) в концентрации до 100 мМ не ингибируют активность тимидинкиназы Pseudomonas sp, КММ 3694. Тимидинкиназа Е. coli в присутствии ионов одновалентных металлов (Na+, К+) в концентрации 100 мМ теряет 50 % активности (Rohde, Lezius, 1971). Результаты, полученные в ходе исследования физико-химических свойств тимидинкиназы штамма рода Pseudomonas sp. КММ 3694 показали, что фермент проявляет свою активность в условиях отличных от ранее известных тимидинкиназ (Strosselli et al., 1998; Rohde, Lezius, 1971; Okazaki, Kornberg, 1964), что обусловлено, видимо, источником его получения. Тимидинкиназа штамма Pseudomonas sp. КММ: 3694 переносит фосфатную группу от АТР на тимидин и не способна катализировать дальнейшее фосфорилирование образующегося ТМР, а также уридина. Аденозин, гуанозин и цитидин при добавлении их в инкубационную смесь могут незначительно ингибировать активность тимидинкиназы. Для тимидинкиназы из Е. coli акцепторами фосфата являются дезокситимидин и дезоксиуридин (Okazaki, Kornberg, 1964). Тимидинкиназа из печени человека, кроме тимидина, фосфорилирует дезоксицитидин (ElHms, Van der Weyden, 1981). Добавление в реакционную среду ТМР, продукта тимидинкиназной реакции, а также UMP не влияло на активность фермента Pseudomonas sp. KMM 3694. Тимидинкиназа из регенерирующей печени. крысы ингибируется ТМР (Tsukamoto et al., 1991), как и фермент из Phisarum polycephalum (Chraibi, Wright, 1983). Пиримидиновые нуклеозидтрифосфаты - ТТР, а также UTP и СТР не оказывали ингибирующего действия на активность тимидинкиназы Pseudomonas sp. KMM 3694. Ферменты фосфорилирования тимидина из Rhodothermus marinus (Blondal et al., 1999), Phisarum polycephalum (Grobner, 1979; Chraibi, Wright, 1983), тимуса теленка (Her, Momparler, 1971) и вируса коровьей оспы (Hruby, 1985) ингибируются по принципу обратной связи ТТР, конечным продуктом цепи фосфорилирования тимидина. Активность тимидинкиназы Rhodothermus marinus (Blondal et al., 1999) ингибируется также и другими нуклеозидтрифосфатами (dCTP, dGTP и dATP), в то время как: на активность тимидинкиназы вируса коровьей оспы они не влияют (Hruby, 1985).
Отсутствие ингибирования активности тимидинкиназы Pseudomonas sp. KMM 3694 нуклеозидтрифосфатами предполагает, что регуляция активности фермента может осуществляться не конечным продуктом цепи фосфорилирования тимидина до ТТР. Не исключено, что увеличение концентрации ТТР в клетке не ограничивает фосфорилирование экзогенного тимидина, а наоборот, ускоряет цикл генерации бактериальной клетки, создавая избыток субстрата, необходимого для синтеза ДНК.
Выделение уридинкиназы из Pseudoalteromonas aurantia NCIMB 2033 Штамм P. aurantia эффективно включал экзогенные нуклеозиды в состав нуклеиновых кислот, причем уровень включения уридина более чем в 2,5 раза превышал включение тимидина. Для этого штамма выявлено предпочтительное включение метки из уридина в РНК.
Схема выделения уридинкиназы из штамма Pseudoalteromonas aurantia NCIMB 2033 включала фракционирование сульфатом аммония, ионообменную хроматографию и гель-фильтрацию на TSK-GELoyopearl HW-60 (табл. 6). В процессе очистки уридинкиназы, как и в случае тимидинкиназы Pseudomonas sp. КММ 3694, наиболее эффективной была стадия DEAE-хроматографии.
