Содержание к диссертации
Оглавление .2
Список сокращений 7
Введение 8
Обзор литературы 11
Особенности строения и механизм катализа 11
Ацилфосфатазная активность ГАФД 22
Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа — многофункциональный белок 25
Урацил-ДНК-гликозилазная активность ГАФД 27
Связывание ГАФД с нуклеиновыми кислотами 29
Участие ГАФД в апоптозе 34
Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа и нейродегенеративные заболевания 44
Взаимодействие ГАФД с белками цитоскелета 47
Фузогенная активность ГАФД 50
Антитела: структурами истки и применение
Структура иммуноглобулинов 57
Взаимодействие с антигеном 60
Методы аффинной очистки антител 63
Аффинная очистка с использованием иммобилизованного антигена. 64
Аффинная очистка с помощью анти-антител 64
Бактериальные Fc-рецепторы 65
Protein А-подобные белки 66
Металло-аффинная хроматография 67
Тиофильные взаимодействия 68
Лектин-аффинная хроматография 68
Применение антител 69
Исследование холдинга белков с помощью антител 71
Материалы и методы
Материалы 75
Методы
Выделение ГАФД Bacillus stearothermophilus из клеток Е. coli, штамма GM-109 трансформированных плазмидой psk II B.st 76
Выделение ГАФД из скелетных мышц кролика 80
Определение концентраций реагентов 81
Определение концентрации белков в растворе 81
Определение концентрации иммобилизованных белков 82
Определение активности ГАФД 82
Получение апо-ГАФД 83
Иммобилизация белков на сефарозе 4В 83
Получение иммобилизованных за одну субъединицу димеров ГАФД из мышц кролика 85
Электрофорез в денатурирующих условиях 85
Дифференциальная сканирующая калориметрия 86
Регистрация спектров кругового дихроизма 86
Получение, очистка и исследование свойств поликлональных антител иммунизация кроликов 87
Определение титра антител по методу Ухтерлони 87
Определение титра антител на ГАФД B.st. и GroEL в сыворотке с помощью твердофазного иммуноферментного анализа ELISA 88
Очистка сыворотки методом высаливания 89
Очистка антител на различные формы ГАФД B.st 89
Определение уровня перекрестной реакции между антителами с помощью метода иммунопреципитации Protein G 90
Инкубация ГАФД B.st с антителами при рН 10 90
Изучение связывания ГАФД кролика с нуклеиновыми кислотами
Выделение тотальной ДНК из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae 91
Выделение суммарной транспортной РНК 92
Введение a[32P]dATP в ДНК с помощью фрагмента Кленова ДНК полимеразы 1 92
Включение [у32Р] в составе АТФ в РНК 93
Связывание ГАФДк с меченой ДНК и РНК 93
Изучение субклеточной локализации ГАФД в клетках НеІ а в процессе апоптоза
Выращивание культуры клеток 95
Выявление субклеточной локализации ГАФД и актина в клетке 95
Результаты и их обсуждение
Получение, очистка и исследование свойств поликлональных антител к ГАФД B.st
Иммунизация кроликов 97
Определение титра антител по Ухтерлони 99
Определение титра антител с помощью метода ELISА 101
Очистка антител на разные формы ГАФД методом аффинной хроматографии 101
Определение уровня перекрестной реакции между антителами на тетрамеры и антителами на денатурированную форму 105
Влияние антител на процесс реактивации ГАФД B.st. 105
Влияние антител на тетрамеры и антител на денатурированную форму ГАФД B.st. на активность фермента
Влияние антител на активность холо-ГЛФД 110
Влияние антител на активность апо —ГАФД. 112
Выделение комплекса ГАФД В. st. /антитело и его анализ методом дифференциальной сканирующей калориметрии 115
Изучение скорости связывания антител на тетрамеры с ГАФД B.st..Л 18
Влияние фракции антител на денатурированную форму на активность ГАФДЛ. при65°С 120
Влияние антител на стабильность ГАФД B.st. при рН 10 123
Влияние антител на тетрамеры и на денатурированную форму на стабильность холоГЛФДB.st. прирН 10 123
Влияние антител на тетрамеры и на денатурированную форму на стабильность апоГЛФДB.st. прирН 10 , 125
Изучение влияния антител на тетрамеры на стабильность апоГАФД B.st. при рН 10 методом ДСК 126
Взаимодействие ГАФДк с нуклеиновыми кислотами
Влияние окисления ГАФД на взаимодействие фермента с нуклеиновыми кислотами 130
Влияние связывания ГАФДк с нуклеиновыми кислотами на олигомерность фермента 137
Изучение субклеточной локализации негативных форм ГАФД в клетках HeLa в норме и в процессе апоптоза
Субклеточная локализация ненативной ГАФД и ее взаимодействие с
актином в клетках HeLa 141
Изучение локализации ненативной формы ГАФД в клетках HeLa в процессе апоптоза 144 Выводы 157
Список литературы 158
Введение к работе
Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (NAD - зависимая фосфорилирующая D-глицеральдегид - 3 - фосфатдегидрогеназа, КФ 1.2.1 Л 2) катализирует один из ключевых этапов гликолиза: реакцию окислительного фосфорилирования глицеральдегид — 3 — фосфата в 1,3 - дифосфоглицерат с образованием NADH и является одним из самых изучаемых ферментов гликолиза. Это связано не только с важностью обеспечиваемой им гликолитической функции, но еще и с обнаруженными многочисленными негликолитическими функциями фермента в клетке. Действительно, тот факт, что количество ГАФД составляет около 15% растворимых клеточных белков, позволяет допустить, что этот фермент может играть очень важную роль в жизни клетки.
Так, недавно было обнаружено, что ГАФД играет существенную роль в слиянии клеточных мембран и клеточной адгезии, экспорте тРНК, репликации и репарации ДНК. Имеются многочисленные данные о том, что ГАФД вовлечена в развитие нейродегенеративных заболеваний и вирусных инфекций, а также показано, что она играет важную роль в развитии апоптоза. Причем существуют предположения, что эти важные биологические функции могут быть связаны с изменением внутриклеточной локализации фермента и с его особым олигомерным состоянием, тогда как свою функцию в гликолизе фермент выполняет в виде гомотетрамера (субъединица 36 к Да). Так, при апоптозе показана транслокация ГАФД в ядро, однако ни механизм транслокации, ни в какой олигомерной форме находится при этом ГАФД, ни цель такого перемещения пока неизвестны, хотя все эти вопросы представляются очень важными в вопросе понимания процесса апоптоза и участия ГАФД в нем. Многие исследователи полагают, что в ядре фермент связывается с нуклеиновыми кислотами, каким то образом регулируя транскрипцию или трансляцию, причем делаются предположения, что за такое связывание и вообще за некаталитические функции ГАФД в клетке ответственна особая, возможно модифицированная форма фермента или его нететрамерная форма - димеры или мономеры. Кроме того, показано, что ГАФД является мишенью для воздействия клеточных окислителей - N0 и перекиси водорода. При этом происходит модификация фермента в первом случае и его окисление до различных производных во втором (Sirover М.А., 1999). Таким образом, на современном этапе исследований ГАФД вопрос изучения внутриклеточной локализации различных форм фермента становится особенно актуальным. Хорошо известно, что антитела являются удобным инструментом для изучения локализации антигена в клетке, его функционирования и структуры. В нашей лаборатории уже были получены моноклональные антитела, специфичные к димерам, мономерам или к денатурированной форме ГАФД, но не к нативному тетрамерному белку. Однако эти антитела применяли лишь для разработки методов удаления денатурированного белка из ферментных препаратов. Кроме того, получение моноклональных антител -процедура длительная и дорогостоящая. В то же время, все более совершенные методы очистки поликлональных антител позволяют получать поликлональные антитела из сыворотки с нужной аффинностью и специфичностью.
В соответствии с вышеизложенным в нашей работе преследовались три цели:
? Выделить и изучить поликлональные антитела, специфичные к различным ненативным формам ГАФД,
? Изучить влияние окисления ГАФД на ее взаимодействие с нуклеиновыми кислотами. Выявить распределение ненативных форм ГАФД внутри клетки при
различных состояниях последней. В связи с поставленными целями, были сформулированы следующие задачи:
1. Получить поликлональную сыворотку, содержащую антитела к ГАФД из Bacillus stearothermophilus, и методом аффинной хроматографии выделить из нее антитела, специфичные к ненативным формам фермента.
2. Изучить взаимодействие выделенных антител с ГАФД B.st и комплексы ГАФД-антитело с помощью метода дифференциальной сканирующей микрокалориметрии.
3. Изучить влияние окисления ГАФД из мышц кролика перекисью водорода на эффективность взаимодействия белка с ДНК и с РНК.
4. Исследовать внутриклеточную локализацию ненативной формы ГАФД в клетках HeLa в норме и при апоптозе, с помощью моноклональных антител, специфичных к ненативным формам ГАФД.
