Введение к работе
Актуальность темы. Известно, что липопротеины и их белковые компоненты участвуют в регуляции многих метаболических процессов. Среди которых можно выделить следующие. Аполипопротеины апоА-1 и апоЕ осуществляют регуляцию обмена холестерина не только в плазме крови, но и посредством рецепторов внутри клетки за счет активного его выведения с помощью встроенных в мембрану специфических транспортных белков: АТР-связывающего кассетного транспортера (АВСА1) и мембранного рецептора для ЛПВП - скевенджер-рецептора класса Bl (Borst P., Elfehnk R.O., 2002; Wei С. е.а.,2005). Аполипопротеины оказывают влияние на функцию эндокринной системы, в частности, на стероидогенез; апоЕ является одним из регуляторов клеточного иммунитета; аполипопротеины способны связывать и транспортировать в клетку различные по структуре соединения (Поляков Л.М., Панин Л.Е., 2000).
Имеются сообщения о регуляции аполипопротеинами генетического аппарата клетки. Это подтверждается в серии работ Института биохимии СО РАМН под руководством академика РАМН Л.Е. Панина. Действительно, в ядрах гепатоцитов крыс были обнаружены аполипопротеины A-I и Е. Оба белка присутствовали во фракции кислых негистоновых белков, принимающих участие в регуляции экспрессии генов. Оказалось, что аполипопротеин A-I способствует повышению транскрипционной активности хроматина. Были вскрыты и молекулярные механизмы этого процесса. Показано, что аполипопротеин A-I в комплексе с восстановленными формами стероидных гормонов взаимодействует с GC-богатыми участками ДНК. При этом восстановленная А4-3-кето группа А-кольца стероидных гормонов инициирует разрыв в GC-napax водородных связей. В дальнейшем разрыв увеличивается за счет гидрофобного взаимодействия между
азотистыми основаниями и гидрофобными участками аполипопротеина A-I. С образовавшимися одноцепочечными участками ДНК взаимодействует РНК-полимераза, которая и запускает экспрессию генов с последующей активацией биосинтеза белка (Panin L.E. е.а., 1998; 2000). Другим регуляторным белком является аполипопротеин Е. Он известен, как ингибитор пролиферации некоторых типов клеток, включая опухолевые (Vogel Т. е.а., 1994). Показано, что аполипопротеин Е повышает экспрессию мРНК перлекана, основного протеогликана в семействе гепарансульфатов, который и опосредует антипролиферативный эффект аполипопротеина Е в культуре крысиных и человеческих гладкомышечных клеток аорты (Рака L. е.а., 1999). По данным Хоу и соавторов (2001), аполипопротеин Е ингибировал стимулированную сывороткой пролиферацию эмбриональных фибробластов крыс, при этом в бессывороточной среде аполипопротеин Е увеличивал рост клеток, продлевая Gi-фазу клеточного цикла. Аполипопротеин Е усиливал рост первичных нейронов через сигнальную функцию ЛПНП-подобного рецептора (LRP, lipoprotein receptor-related protein) (Qui Z. е.а., 2004). Отмечена способность аполипопротеина Е ингибировать сосудистую гиперплазию при воспалении, вызванном денудацией эпителия сонных артерий у мышей (Moore, Z.W., Hui D.Y., 2005). Результаты исследования эффекта аполипопротеина Е на клетки человеческой аденокарциномы НТ29 и распределение Р-катенина позволяют предположить, что данный белок участвует в сохранении межклеточных взаимодействий, ингибируя рост опухолевых клеток (Niemi М. е.а. 2002). В дополнение к этому, показано, что аполипопротеин Е снижает экспрессию генов канонического, или зависимого от Р-катенина Wnt-сигнального пути (Caruso А. е.а. 2006), конститутивная активация которого играет важную роль в канцерогенезе (Taipale J. е.а., 2001).
Перечисленные работы о регуляторных эффектах аполипопротеинов А и Е позволили высказать предположение о существовании у этих белков конкурентных взаимоотношений в регуляции процессов внутриклеточной регенерации и пролиферации. В связи с этим, целью настоящего исследования являлось изучение роли аполипопротеинов A-I и Е в регуляции биосинтеза белка и нуклеиновых кислот в культуре нормальных и опухолевых гепатоцитов.
Задачи исследования:
Изучить процессы комплексообразования липопротеинов со стероидными гормонами и их метаболитами.
Изучить влияние комплексов стероидных гормонов и их метаболитов с аполипопротеином A-I на биосинтез белка в культуре гепатоцитов крыс.
Изучить роль аполипопротеина Е в регуляции биосинтеза белка и нуклеиновых кислот в культуре нормальных гепатоцитов и в клетках асцитной гепатомы Эрлиха.
Научная новизна. Методами ультрацентрифугирования, гель-фильтрации и тушения флуоресценции показано, что при образовании комплексов липопротеинов со стероидными гормонами и их метаболитами принимает участие белковый компонент. Основным аполипопротеином, участвующим в процессе комплексообразования является аполипопротеин A-I. Полученные константы ассоциации комплексов белок-лиганд свидетельствуют о достаточно высоком сродстве.
На культуре гепатоцитов крыс показано, что комплексы аполипопротеина A-I с тетрагидрокортизолом и прегненолоном обладают высокой биологической активностью, усиливая скорость
биосинтеза белка. Принципиально важную роль в этом процессе играет восстановленная Д4-3-кетогруппа кольца А стероидных гормонов.
На культуре гепатоцитов крыс показано, что аполипопротеин Е проявляет конкурентный эффект по отношению к комплексу аполипопротеин А-1-тетрагидрокортизол и снижает увеличение скорости биосинтеза ДНК, РНК и белка, определяемую по включению радиоактивной метки.
Впервые на модели асцитной гепатомы Эрлиха показано, что опухолевые макрофаги играют ключевую роль в образовании биологическиактивных комплексов аполипопротеина A-I со стероидными гормонами, которые в свою очередь увеличивают скорость биосинтеза белка в клетках асцитной гепатомы. Аполипопротеин Е подавлял биологическую активность комплекса, что отражалось в снижении скорости биосинтеза белка. Теоретическая и практическая значимость.
Решение поставленных в диссертации задач является важным этапом в исследовании молекулярных механизмов межклеточных взаимодействий связанных с регуляцией экспрессии генов. Установление характера и степени связывания (аффинитета) липопротеинов со стероидными гормонами и их метаболитами важны для оценки роли изучаемых комплексов в регуляции важнейших внутриклеточных процессов. В результате проведенных исследований, описан неизвестный ранее механизм регуляции биосинтеза ДНК, РНК и белка — процесс, основанный на конкурентных взаимоотношениях между аполипопротеином Е и комплексом аполипопротеином А-1-стероид.
Результаты работы свидетельствуют о том, что макрофаги занимают ключевые позиции в регуляции процессов регенерации и клеточной пролиферации. Эти межклеточные взаимодействия
проявляют себя не только в нормальных тканях, но и в системе -макрофаг-опухолевая клетка. Показано, что в основе этих взаимоотношений также лежит способность макрофагов образовывать биологически активные комплексы восстановленных форм стероидных гомонов с аполипопротеином A-I. Однако способность к синтезу и секреции аполипопротеина Е у них снижена, что имеет принципиальное значение в противоопухолевой защите организма. Понимание тонких механизмов взаимоотношений макрофаг-опухолевая клетка может служить основой для повышения эффективности методов коррекции у онкологических больных.
Положения, выносимые на защиту;
Фракции липопротеинов плазмы крови образуют комплексы со стероидными гормонами и их метаболитами за счет белкового компонента. Одним из главных таких белков является аполипопротеин A-I.
Скорость биосинтеза белка в гепатоцитах крыс повышается под влиянием комплексов аполипопротеина A-I с тетрагидрокортизолом и с прегненолоном.
Аполипопротеин Е подавляет эффекты комплексов аполипопротеина A-I с тетрагидрокортизолом и с прегненолоном в нормальных гепатоцитах и опухолевых клетках асцитной гепатомы Эрлиха.
Апробация материалов диссертации. Материалы
диссертационного исследования доложены на I Съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 работы, из них 2 статьи.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 4-х глав, включающих обзор литературы, материалов и методов, результатов исследований, обсуждения, выводов и списка литературы, включающих 30 отечественных и 172 зарубежных источников. Материалы диссертации изложены на 132 страницах машинописного текста. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 16 рисунками. Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Института биохимии СО РАМН.
