Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение процесса репарации ДНК эукариот является важной фундаментальной задачей современной молекулярной биологии. В процессе жизнедеятельности организма ДНК постоянно подвергается воздействию генотоксических факторов, как экзогенного, так и эндогенного происхождения. Эксцизионная репарация оснований (ЭРО) является одной из основных систем репарации ДНК эукариот, действие которой направлено на восстановление исходной структуры ДНК при повреждении оснований. На данный момент достигнут значительный прогресс в изучении структуры ферментов системы ЭРО, охарактеризованы отдельные стадии и реконструированы основные пути этого процесса. Обнаружено, что помимо ферментов, катализирующих основные этапы ЭРО, в этом процессе участвуют белковые факторы, которые могут координировать репарацию ДНК, взаимодействуя с ферментами и ДНК-интермедиатами этого процесса. Одним из таких белков является поли(АОР-рибозо)полимераза 1 (PARP1), которая активируется при ее взаимодействии с разрывами ДНК, образующимися при воздействии генотоксических соединений или ферментов в процессе репарации повреждений ДНК. Функционирование ферментов системы ЭРО происходит в тесном взаимодействии с PARP1, поскольку данный белок взаимодействует не только с интермедиатами репарации ДНК, но и образует непосредственные, либо опосредованные через ДНК, белок-белковые контакты с ферментами и факторами ЭРО. Несмотря на большой интерес к исследованию PARP1, многие детали, касающиеся функции этого белка в репарации ДНК остаются невыясненными. До сих пор остается открытым вопрос о роли PARP1 в координации функциональной активности ферментов, катализирующих основные этапы ЭРО. Поэтому изучение взаимодействия PARP1 с ДНК-интермедиатами и ферментами, участвующими в репарации ДНК, необходимо для понимания механизма регуляции ЭРО на молекулярном уровне. Метод фотоаффинной модификации является одним из наиболее информативных подходов для исследования белок-нуклеиновых или опосредованных через ДНК белок-белковых взаимодействий, как в реконструированных системах из отдельных компонентов, так и в многокомпонентных системах на уровне ядерных или клеточных экстрактов. Применение этого метода в сочетании с изучением влияния PARP1 на активность ферментов системы ЭРО представляется весьма актуальным для выяснения роли этого белка в координации функционирования репаративного ансамбля.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось установление роли поли(АВР-рибозо)полимеразы 1 в координации процесса эксцизионной репарации оснований.
В ходе работы планировалось решить следующие задачи: 1) исследовать взаимодействие PARP1 с ДНК-дуплексами, моделирующими интермедиаты короткозаплаточного и длиннозаплаточного пути ЭРО методом фотоаффинной модификации; 2) исследовать функциональное взаимодействие PARP1 и апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 (АРЕ1) в процессе синтеза ДНК, катализируемого ДНК-полимеразой (3 (Pol Р); 3) исследовать функциональное взаимодействие PARP1, ее апоптотического 24 кДа-фрагмента (р24) и белков ядерного экстракта из семенников крупного рогатого скота в процессе репарации ДНК по длиннозаплаточному и короткозаплаточному пути ЭРО.
Научная новизна и практическая ценность. Впервые изучено функциональное взаимодействие PARP1 и ферментов системы ЭРО. Показано ингибирующее влияние PARP1 на Pol р-зависимый синтез ДНК в длиннозаплаточном пути репарации, в том числе при участии АРЕ1, которая стимулирует активность Pol Р и за счет 3'—>5' экзонуклеазной активности может осуществлять удаление ошибочно встроенных нуклеотидов в процессе синтеза ДНК, катализируемого Pol р. Установлено, что PARP1 и ее апоптотический 24 кДа-фрагмент практически не влияют на восстановление структуры ДНК по короткозаплаточному пути ЭРО. В то же время эти белки ингибируют репарацию ДНК по длиннозаплаточному пути. Показано, что PARP1 и р24 подавляют синтез ДНК с вытеснением запирающей цепи и активность флэп-эндонуклеазы 1 (FEN1), которая осуществляет процессинг "свисающего" 5'-конца ДНК в этом пути репарации. Впервые продемонстрировано, что в длиннозаплаточном пути синтез ДНК, катализируемый белками экстракта из семенников крупного рогатого скота, преимущественно выполняется по механизму "трансляции однонуклеотидной бреши", когда после заполнения однонуклеотидной бреши FEN1 выщепляет нуклеотидный остаток с 5'-конца одно це почечного разрыва и образующаяся при этом однонуклеотидная брешь cle novo застраивается под действием Pol р. Установлено, что поли(АГ)Р-рибозил)ирование PARP1, приводящее к подавлению ДНК-связывающей активности этого фермента, является необходимым условием для эффективного протекания синтеза ДНК по механизму "трансляции однонуклеотидной бреши" в длиннозаплаточном пути ЭРО. Полученные данные указывают на определяющую роль PARP1 в регуляции функциональной активности Pol Р в длиннозаплаточном пути репарации.
Публикации и апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в семи печатных работах. Результаты работы были представлены на международных конференциях: "The Third International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure", 2002, Новосибирск, Россия; "Conference on Chemical and Biological Problems of
Proteomics", 2004, Новосибирск, Россия; "International Conference on Chemical Biology", 2005, Новосибирск, Россия; FEBS School "Chemistry meets Biology", 2005, Спетес, Греция; FEBS School "Biology and Pathophysiology of Poly(ADP-ribosyl)ation", 2006, Гранада, Испания; "Физико-химическая биология", 2006, Новосибирск, Россия.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка цитируемой литературы (177 наименований). Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста и содержит 40 рисунков, 6 таблиц.
