Введение к работе
Актуальность проблемы. Ежедневно около 100000 звеньев молекул ДНК каждой клетки человеческого организма повреждаются в результате разнообразных эндогенных и экзогенных генотоксических воздействий. Повреждение ДНК может приводить к появлению мутаций, провоцировать гибель клетки или ее злокачественное перерождение. Для предотвращения таких последствий в клетке существует несколько взаимодополняющих систем ферментативных процессов, носящих общее название «репарация ДНК». На текущий момент известно 6 главных систем репарации, отличающихся друг от друга используемыми субстратами, ферментами и механизмами устранения повреждения. При реактивации поврежденные основания ДНК непосредственно превращаются в нормальные без расщепления ДНК и последующего ее синтеза. Все остальные системы репарации действуют с деградацией поврежденной части ДНК и синтезом нового участка, замещающего деградированный. В ходе рекомбинационной репарации поврежденная ДНК исправляется за счет рекомбинации с полноценной копией генетического материала. Двуцепочечные разрывы также могут лигироваться в процессе воссоединения не гомологичных концов. Неканонические пары оснований и короткие гетеродуплексы узнаются системой репарации гетеродуплексов, которая удаляет включающий их фрагмент длиной до нескольких сотен дезоксирибонуклеотидов (dN) и застраивает образовавшуюся брешь. Для эксцизионной репарации нуклеотидов, субстратами которой являются объемные аддукты в ДНК, также характерно вырезание участка ДНК с последующим синтезом, но, в отличие от предыдущего случая, участок синтеза ограничен несколькими десятками dN. Нарушение механизмов репарации ДНК приводит к различным патологическим процессам, в число которых входят канцерогенез, дефекты развития и старение.
Наиболее распространенные типы повреждений ДНК — одноцепочечные разрывы (ОЦР), апурин-апиримидиновые сайты и поврежденные основания — репарируются с помощью эксцизионной репарации оснований. При повреждении оснований ДНК этот процесс инициируется ферментами ДНК-гликозилазами, которые гидролизуют jV-гликозидную связь между поврежденным основанием и дезоксирибозным фрагментом. У всех живых организмов имеется несколько ДНК-гликозилаз с разной субстратной специфичностью; так, в клетках человека на сегодня известно 11 ДНК-гликозилаз, а у Escherichia coli — 8 таких ферментов. Некоторые из них обладают весьма узкой субстратной специфичностью, удаляя из ДНК поврежденные основания только одного вида (например, урацил), другие же могут выщеплять разнообразные поврежденные основания, относящиеся в целом к одному классу (например, окисленные пиримидины). Исходя из их последовательностей и пространственных структур, ДНК-гликозилазы можно разделить на несколько семейств, не родственных друг другу. Тем не менее, некоторые ДНК-гликозилазы, относящиеся к разным семействам, могут использовать в качестве субстрата одни и те же поврежденные ДНК.
До сих пор не решен вопрос, каким образом ДНК-гликозилазы дискриминируют субстратные и несубстратные азотистые основания. Многие поврежденные азотистые основания отличаются от канонических всего одним или несколькими атомами, поэтому фермент должен с исключительной точностью выбирать выщепляемое основание из огромного избытка неповрежденных звеньев ДНК. С другой стороны, многие поврежденные азотистые основания могут быть очень похожими на
основания, выщепляемые какой-либо ДНК-гликозилазой, но не использоваться ею в качестве субстрата. Известны также многие случаи, когда ДНК-гликозилазы могут выщеплять какие-либо основания из олигодезоксирибонуклеотидов (ОДН), но не из высокомолекулярной ДНК; такие субстраты считаются «неспецифичными» для данной гликозилазы. Ясно, что связывание субстратного основания в активном центре фермента должно предваряться его селекцией среди других оснований, которые в принципе могут, но не должны служить субстратами. Изучение механизмов селекции субстратов чрезвычайно актуально как для углубления знаний о репарации ДНК, так и для понимания механизма действия ферментов и создания ферментов с заданными свойствами.
Для исследования ДНК-гликозилаз применяются самые передовые подходы физико-химической биологии. Структура ряда ДНК-гликозилаз установлена методами рентгеноструктурного анализа (РСА) и ядерного магнитного резонанса. Создан большой набор модифицированных звеньев ДНК, позволяющий анализировать закономерности узнавания поврежденных оснований. Современные молекулярно-биологические методы позволяют получать формы белков с измененной структурой и анализировать их свойства. Однако несмотря на это, остается большой редкостью комбинированный подход к изучению ДНК-гликозилаз, который сочетал бы различные взаимодополняющие структурные и биохимические методы в систематическом исследовании механизмов узнавания этими ферментами поврежденных оснований.
Основной целью данной работы являлось установление закономерностей и механизмов узнавания и расщепления поврежденной ДНК гликозилазами в процессе эксцизионной репарации ДНК.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
Определить структуры ДНК-гликозилаз, ранее не охарактеризованные в
литературе, в комплексе с ДНК и в свободном состоянии;
Дополнить структурные данные компьютерными моделями динамического
поведения фермент-субстратных комплексов и проанализировать
консервативность физико-химических свойств аминокислотных остатков в
ключевых участках пространственной структуры ДНК-гликозилаз;
Исследовать активность ДНК-гликозилаз по отношению к разным видам
поврежденной ДНК, термодинамические и кинетические параметры
взаимодействия этих ферментов с ДНК;
Проследить изменение конформации ДНК-гликозилаз в ходе катализа и
установить природу конформационных переходов;
Исследовать влияние замен различных аминокислотных остатков на активность и
субстратную специфичность ДНК-гликозилаз;
Изучить динамику перераспределения ДНК-гликозилаз в эукариотической клетке
в ответ на генотоксический стресс.
Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе для исследования функционирования ДНК-гликозилаз использован комплекс взаимодополняющих физико-химических, расчетных и биохимических методов, в результате чего были установлены многие факторы, определяющие механизм
действия и субстратную специфичность нескольких ДНК-гликозилаз бактерий и млекопитающих.
В работе впервые определены структуры эндонуклеазы VIII из Е. coli (Nei) в свободном состоянии и в комплексе с ДНК, структура формамидопиримидин-ДНК-гликозилазы из Е. coli (Fpg) в комплексе с ДНК и структура эндонуклеазы V бактериофага Т4 (DenV) в ковалентном комплексе с ДНК. Промоделированы взаимодействия поврежденного основания в активных центрах Nei и Fpg. Установлены функции ряда аминокислотных остатков в процессе расщепления поврежденной ДНК, катализируемой этими ферментами. Впервые исследована активность 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы млекопитающих (OGG1) по отношению к ряду модифицированных оснований ДНК и влияние на нее ионов металлов. Установлены многостадийные кинетические схемы узнавания повреждений Fpg и Nei. На основании этих данных предложена модель узнавания поврежденных оснований ДНК-гликозилазами как многоступенчатого процесса.
В ходе работы открыта новая группа эукариотических ДНК-гликозилаз, гомологичных Nei и Fpg. Установлено, что одна из этих ДНК-гликозилаз, NEIL1, обладает уникальной субстратной специфичностью по отношению к некоторым окисленным пиримидиновым основаниям, а также поврежденным основаниям, расположенным вблизи ОЦР, и что ее инактивация повышает чувствительность клеток к ионизирующему излучению. На основании сравнительного анализа функций и последовательностей Fpg, Nei и их гомологов обосновано предложение об их выделении в отдельное суперсемейство ДНК-гликозилаз.
Установлено, что цитоплазматическая фракция некоторых ферментов репарации (OGG1, NEIL2, ДНК-полимераза Р) связьшается с микротрубочками, что может способствовать их быстрой релокализации в ответ на генотоксический стресс.
Все представленные данные оригинальны и вносят существенный вклад в решение проблемы узнавания поврежденной ДНК ферментами репарации.
В процессе работы созданы штаммы Е. coli для экспрессии нескольких ДНК-гликозилаз и методики выделения этих белков, потенциально применимых как в области прикладной генетической токсикологии (например, для кометографии), так и для усиления защитно-репарационных систем человека при окислительном стрессе разной природы. Получены антитела к 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазе млекопитающих, которые могут использоваться для анализа уровня этого белка в клетках человека при оценке их репарационного статуса. Структуры ДНК-гликозилаз бактериальной природы, определенные в работе, могут использоваться как основа для разработки ингибиторов этих ферментов, важных для выживания патогенных бактерий в организме.
Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе кафедры молекулярной биологии Новосибирского государственного университета при чтении курсов «Молекулярная биология», «Мутагенез и репарация ДНК» и «Горячие точки молекулярной биологии», а также при выполнении дипломных и кандидатских диссертационных работ в ИХБФМ СО РАН.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на VII международном симпозиуме по радиационным повреждениям ДНК (Орлеан, Франция, 2001), XXXII съезде Европейского общества мутагенов в окружающей среде «DNA damage and repair: Fundamental aspects and contribution to human disorders» (Варшава, Польша, 2002), ХСШ съезде Американского общества онкологических
исследований (Сан-Франциско, США, 2002), III международной конференции «Биоинформатика регуляции и структуры генома» (Новосибирск, 2002), конференциях «Albany Conversation» (Олбани, США, 2003, 2005, 2007), II конгрессе организации «Протеом человека» и XIX съезде Международного союза биохимии и молекулярной биологии (Монреаль, Канада, 2003), международной конференции «Targeting RNA: Artificial ribonucleases, conformational traps and RNA interference» (Новосибирск, 2003), VI международной конференции по процессам узнавания нуклеиновых кислот (NACON VI, Шеффилд, Великобритания, 2004), международной конференции «Chemical and biological problems of proteomics» (Новосибирск, 2004), XXX конгрессе Федерации европейских биохимических обществ и IX конференции Международного союза биохимии и молекулярной биологии (Будапешт, Венгрия, 2005), международной конференции «Химическая биология» (Новосибирск, 2005), IX международном симпозиуме по радиационным повреждениям ДНК (Анталья, Турция, 2006), международной конференции «Физико-химическая биология», посвященной 80-летию со дня рождения акад. Д.Г. Кнорре (Новосибирск, 2006) и III международной конференции «Фундаментальные науки — медицине» (Новосибирск, 2007)
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 28 научных статей в 2000-2007 гг. Список публикаций приведен в конце автореферата.
Структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, сводки материалов и методов, описания результатов исследований и их обсуждения (всего 5 подразделов), заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 386 страницах машинописного текста и содержит 90 рисунков и 17 таблиц. Список цитируемой литературы содержит 790 источников.
