Введение к работе
Актуальность темы. Последнее десятилетие ознаменовалось формированием новых представлений об организации жизни бактерий, особенностей их существования во внешней среде и организме человека. Основные открытия в этой области связаны с изучением бактериальных биопленок (Тец В.В. 1998; Amano A., et al., 1999; Сosterton J. W., et al., 1999; Watnic P., Kotler R., 2002). Накопившиеся данные свидетельствуют об особенностях свойств бактерий, находящихся в составе сообществ, наиболее актуальным из которых для практической медицины следует считать повышенную выживаемость микроорганизмов в биопленках (Anderl J.N., et al. 2000; Lewis K. 2001). Бактерии в составе сообществ выживают в присутствии антибиотиков, взятых в количествах, значительно превосходящих минимальную подавляющую концентрацию. Возможно, антибиотики, вообще, не могут полностью уничтожить бактерии биопленок, поскольку в последних обнаружены клетки, находящиеся в силу дифференцировки в состоянии полной устойчивости практически ко всем известным препаратам (Keren I., et al., 2004; Harrison J.J., et al., 2005; Lewis K. 2005). Несмотря на свою актуальность, биопленки остаются во многом слабо изученными. Очень мало известно о структуре, составе и функциях компонентов внеклеточного матрикса бактериальных сообществ. Среди различных молекул, обнаруженных в составе матрикса, особое внимание привлекают липиды и внеклеточная ДНК. Липиды входят в состав поверхностной оболочки, отграничивающей сообщество от внешней среды, формируя мембраноподобную структуру (Tetz V.V., et al., 1993; Zhou L., et al.,1998). Такая оболочка, предположительно, может служить преградой на пути антибиотиков в биопленку (Тец В.В. 1997). Большое внимание исследователей в последние годы привлекает ДНК, которую можно обнаружить за пределами клеток эукариот (Anker P., Stoun M., 2000; Bergsmedh A., et al., 2002 Anker P., et al., 2004). Внеклеточная ДНК бактерий остается мало изученной. Почти ничего не известно о её путях распространения и функциях. На сегодня, практически нет данных о путях экспорта ДНК в межклеточный матрикс микробных биопленок. Вместе с тем, внеклеточная ДНК в биопленках представляет особый интерес для понимания механизмов и путей горизонтального переноса генов между различными микроорганизмами. Можно предполагать, что исследование внеклеточной ДНК биопленок поможет в понимании особенностей их развития и изменчивости признаков, а также эффективности перераспределения генов, в особенности, контролирующих антибиотикоустойчивость и патогенность. Возможно, внеклеточная ДНК станет новой мишенью для воздействия на микроорганизмы.
Цель исследования - изучить состав фосфолипидов и содержание внеклеточной ДНК бактериальных биопленок, оценить возможность повышения эффективности антибиотикотерапии за счет воздействия на компоненты матрикса микробных сообществ.
Задачи исследования
-
Изучить состав фосфолипидов матрикса и поверхностной оболочки биопленок неродственных представителей грамположительных и грамотрицательных бактерий.
-
Произвести поиск и охарактеризовать внеклеточную ДНК в матриксе биопленок неродственных бактерий на различных стадиях развития сообщества.
-
Оценить связь матриксной ДНК и изучить возможность воздействовать на неё с целью изменения свойств биопленки.
-
Изучить влияние ДНКазы на активность передачи генов, интенсивность формирования и сохранение признака антибиотикоустойчивости в биопленках.
-
Проверить эффективность воздействия на бактерии биопленок антибиотиков, способных преодолевать мембрану клеток эукариот.
-
Оценить эффективность совместного действия ДНКазы и антибиотиков на биопленки разного возраста неродственных грамположительных и грамотрицательных бактерий.
Научная новизна.
Впервые проведено комплексное изучение состава внеклеточных фосфолипидов матрикса и поверхностной оболочки различных неродственных моно- и смешанных микробных сообществ. Выполнен поиск и идентификация внеклеточной ДНК микробных биопленок. Установлено, что в составе поверхностной оболочки биопленок и внеклеточном матриксе фосфолипиды по качественному составу аналогичны мембранным, но количественно в них преобладают стабильные фракции. Показано, что в матриксе различных, неродственных микроорганизмов присутствует внеклеточная ДНК, которая содержит гены бактериальной хромосомы и плазмид. Доказано, что антибиотики, способные проникать через мембрану клеток, действуют на бактерии, находящиеся в биопленках. Впервые установлено, что разрушение внеклеточной ДНК приводит к невосстановимым изменениям различных свойств биопленок неродственных бактерий, сопровождающимся снижением числа антибиотикоустойчивых клеток. Впервые доказана возможность усиления действия на биопленки неродственных микробов различных антибиотиков за счет воздействия на компонент матрикса - внеклеточную ДНК. Предложены новые способы борьбы с инфекционными заболеваниями (патенты РФ № 2267329, № 2269358, № 2269359).
Практическая ценность работы
На основании полученных данных стало возможным использовать новые критерии выбора антибиотиков для действия на бактерии, основанные на способности препарата проникать через липидную оболочку биопленок, что позволяет повысить эффективность антибиотикотерапии и уменьшить число осложнений.
Использование ДНКазы для воздействия на бактериальные биопленки позволяет уменьшить их биомассу, а также интенсивность образования и сохранения антибиотикоустойчивых клонов.
Выявлена новая мишень – внеклеточная ДНК матрикса биопленок для воздействия на бактерии с целью повышения эффективности антибиотикотерапии. Использование ДНК матрикса, как дополнительной мишени при терапии, позволяет повысить эффективность действия различных антибиотиков на неродственные микробы, находящиеся в биопленках, снизить вероятность возникновения, распространения и сохранения устойчивости к лечебному агенту, сократить общую продолжительность терапии, уменьшить сроки пребывания больных в стационаре и снизить частоту рецидивов заболевания.
Разработаны и внедрены в клиническую практику новые эффективные схемы антимикробной терапии, включающие воздействие на внеклеточную ДНК фермента ДНКазы у больных с абсцессами и флегмонами челюстно-лицевой локализации.
Внедрение в практику
Разработаны и внедрены в клиническую практику кафедры хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии Санкт-Петербургского государственного университеа им. академика И.П. Павлова новые эффективные схемы антимикробной терапии, включающие воздействие на внеклеточную ДНК матрикса ДНКазой у больных с абсцессами и флегмонами челюстно-лицевой локализации.
Получены патенты РФ: Тец В.В., Тец Г.В., Генкин Д.Д. Способ лечения заболеваний, сопровождающихся изменениями качественного и/или количественного состава внеклеточной ДНК крови // Патент РФ № 2267329 от 10 января 2006; Тец В.В., Тец Г.В., Генкин Д.Д. Способ лечения генерализованных инфекций, вызываемых бактериями, или заболеваний, вызываемых грибами и простейшими, или атеросклероза, или сахарного диабета, или заболеваний, связанных с реакцией гиперчувствительности замедленного типа, или заболеваний, обусловленных мутациями генов соматических клеток // Патент РФ № 2269358 от 10 февраля 2006; Тец В.В., Тец Г.В., Генкин Д.Д. Способ профилактики развития онкологических заболеваний, или инфекций, вызываемых бактериями, грибами и простейшими, или атеросклероза, или сахарного диабета, или заболеваний, связанных с реакцией гиперчувствительности замедленного типа, или заболеваний, развивающихся вследствие мутации генов соматических клеток // Патент РФ № 2269359 от 10 февраля 2006.
Материалы диссертации внедрены в лекционные курсы по общей и частной медицинской микробиологии для студентов и врачей в Санкт-Петербургском Государственном медицинском университете им. акад.И.П.Павлова.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
-
Наличие фосфолипидов в поверхностной оболочке и матриксе бактериальных биопленок позволяет использовать новые принципы в выборе антибиотиков, активных против микробов, находящихся в составе сообществ.
-
Добавление ДНКазы на разных стадиях существования бактериальных биопленок ведет к нарушению их образования, уменьшению биомассы, снижению эффективности формирования и сохранению антибиотикоустойчивых клонов.
-
Совместное применение ДНКазы и антибиотиков ведет к усилению антибактериального эффекта при действии на биопленки неродственных бактерий разного возраста.
Апробация результатов исследования
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на следующих конференциях симпозиумах и съездах:
Международная конференция «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины» Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет им. акад. И.П. Павлова, 2006 г.
Научно-практическая конференция «Санкт-Петербургский научно-технический потенциал в решении проблем лабораторной медицины – Сделано в Санкт-Петербурге”, 2007 г.
1st European Congress of Microbiology June 29 – July 3, 2003. Ljubljana, Slovenia.
43rd Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy (ICAAC) September 14–17, 2003. Chicago, Il, USA.
Fourth International Conference on Circulating Nucleic Acids in Plasma/Serum (CNAPS-IV)) (London, 2006),
Диссертация апробирована на заседании кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии/НИЦ отдела молекулярной биологии и генетики и на проблемной комиссии «микробиология и иммунология» СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова (2007).
Личный вклад автора
Личное участие автора осуществлялось на всех этапах работы. Автор участвовал в определении идеи исследования. Лично автором выполнены микробиологические и молекулярно-генетические исследования, разработаны методы идентификации внеклеточной ДНК матрикса и созданы оригинальные праймеры. Произведены статистическая обработка результатов и анализ полученных данных.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 4 статьи в ведущих рецензируемых изданиях РФ.
Структура и объем диссертации
