Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 18
1.1. Ризосфера как зона взаимодействия растений и микроорганизмов 18
1.2. Механизмы положительного воздействия ассоциативных бактерий на растения 21
1.2.1. Азотфиксация 23
1.2.2. Продукция биологически активных веществ 24
1.2.3. Воздействия на минеральное питание 26
1.2.4. Биоконтроль фитопатогенов 28
1.3. Взаимодействие растений с бактериями, содержащими фермент 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат (АЦК) деаминазу 30
1.3.1. Механизмы регуляции роста растений посредством бактериального фермента АЦК деаминазы 30
1.3.2. Распространение АЦК деаминазы у микроорганизмов 35
1.3.3. Характеристика фермента и генов АЦК деаминазы 48
1.3.4. Роль АЦК деаминазы во взаимодействии клубеньковых бактерий с бобовыми растениями 49
1.4. Эффективность инокуляции небобовых растений смешанными культурами ассоциативных бактерий 51
1.5. Взаимодействие интродуцируемых бактерий с ризосферной микрофлорой 54
1.6. Активная колонизация корней как критерий селекции эффективных штаммов ассоциативных бактерий 56
1.7. Устойчивость почвенных бактерий к неблагоприятным факторам 61
1.7.1. Кислотность среды 63
1.7.2. Недостаток влаги 64
1.7.3. Токсичность тяжелых металлов 64
1.8. Взаимодействие ассоциативных бактерий и растений в стрессовых условиях 67
1.8.1. Экстремальная температура среды 69
1.8.2. Повышенная кислотность почвы 70
1.8.3. Дефицит влаги 72
1.8.4. Загрязнение почвы тяжелыми металлами 75
1.9. Заключение к обзору литературы 84
2. Объекты и методы исследований 87
2.1. Состав питательных сред для культивирования бактерий 87
2.2. Изоляция штаммов бактерий доминирующих в ризосфере проростков растений 89
2.3. Идентификация выделенных штаммов бактерий 90
2.4. Активность АЦК деаминазы бактерий 91
2.5. Продуцирование индолов бактериями 92
2.6. Нитрогеназная (ацетилен-редуктазная) активность бактерий в периодической культуре и на корнях растений 93
2.7. Продуцирование этилена бактериями 93
2.8. Продуцирование сидерофоров бактериями 94
2.9. Растворение фосфатов бактериями 94
2.10. Цитокининовая активность бактерий 94
2.11. Содержание белка в бактериях 95
2.12. Устойчивость бактерий к тяжелым металлам 95
2.13. Иммобилизация кадмия бактериями 95
2.14. Устойчивость бактерий к ионам ЬҐ и А1+3 96
2.15. Бактериостатическая активность 96
2.16. Получение мутантов бактерий дефектных по активности АЦК деаминазы 97
2.17. Численность интродуцированных популяций бактерий на корнях растений и в почве 98
2.18. Гнотобиотические растительно-бактериальные системы 99
2.19. Влияние бактерий на кислотоустойчивость ячменя в гидропонике 103
2.20. Вегетационные опыты 103
2.21. Полевые опыты 104
2.22. Использование изотопов 15NH33P 111
2.23. Определение неорганического фосфата (Р,) в растениях 112
2.24. Анализ общего содержания питательных элементов и тяжелых металлов в растениях и почве 112
2.25. Определение содержания АЦК и АБК в ксилемном соке растений 113
2.26. Математическая обработка данных 114
3. Значение взаимодействия ассоциативных бактерий в ризосфере для эффективности инокуляции растений 115
3.1. Ассоциации интродуцируемых бактерий, обладающих аддитивным эффектом на питание и рост растений
3.1.1. Задачи исследований 115
3.1.2. Результаты 115
3.1.3. Обсуждение 126
3.2. Роль взаимодействия интродуцируемых бактерий с аборигенной микрофлорой ризосферы в реакции растений на инокуляцию 132
3.2.1. Задачи исследований 132
3.2.2. Результаты 132
3.2.3. Обсуждение 142
3.3. Популяционное доминирование в ризосфере прорастающих семян как критерий селекции ростстимулирующих бактерий... 147
3.3.1. Задачи исследований 147
3.3.2. Результаты 147
3.3.3. Обсуждение 152
4. Роль ризобактерий, содержащих фермент ацк деаминазу, в устойчивости растений к абиотическим стрессам 162
4.1. Выделение и характеристика устойчивых к кадмию ассоциативных бактерий содержащих АЦК деаминазу 162
4.1.1. Задачи исследований 162
4.1.2. Результаты .163
4.1.3. Обсуждение 173
4.2. Взаимодействие АЦК-утилизирующих бактерий с растениями в стрессовых условиях, вызванных токсичностью кадмия 176
4.2.1. Задачи исследований 176
4.2.2. Результаты 176
4.2.3. Обсуждение 188
4.3. Зависимость эффекта АЦК-утилизирующих бактерий от уровня минерального питания растений 193
4.3.1. Задачи исследований 193
4.3.2. Результаты 193
4.3.3. Обсуждение 204
4.4. Роль бактериальной АЦК деаминазы в реакции растений на дефицит почвенной влаги 209
4.4.1. Задачи исследований 209
4.4.2. Результаты 209
4.4.3. Обсуждение 223
5. Взаимодействие производственных штаммов ассоциативных бактерий с растениями в зависимости от агроклиматических факторов 229
5.1. Экстремальные температуры среды 229
5.1.1. Задачи исследований 229
5.2.1. Результаты 229
5.3.1. Обсуждение 232
5.2. Повышенная кислотность почвы 234
5.2.1. Задачи исследований 234
5.2.2. Результаты 234
5.2.3. Обсуждение 243
5.3. Дефицит почвенной влаги 246
5.3.1. Задачи исследований 246
5.3.2. Результаты 246
5.3.3. Обсуждение 250
5.4. Загрязнение почвы тяжелыми металлами 253
5.4.1. Задачи исследований 253
5.4.2. Результаты 253
5.4.3. Обсуждение 272
Заключение 275
Выводы 289
Благодарности 294
Список использованной литературы 296
Приложение (Список печатных работ по теме диссертации) 351
- Механизмы положительного воздействия ассоциативных бактерий на растения
- Изоляция штаммов бактерий доминирующих в ризосфере проростков растений
- Роль взаимодействия интродуцируемых бактерий с аборигенной микрофлорой ризосферы в реакции растений на инокуляцию
- Взаимодействие АЦК-утилизирующих бактерий с растениями в стрессовых условиях, вызванных токсичностью кадмия
Введение к работе
Актуальность темы
Увеличение продуктивности сельскохозяйственных культур, эффективное и ограниченное использование удобрений и средств защиты растений, а также повышение устойчивости и адаптации растений к неблагоприятным агроклиматическим условиям и антропогенным воздействиям являются актуальными для сельского хозяйства, а также для решения экологических проблем и охраны окружающей среды. Данные вопросы привлекают внимание многих ученых, работающих в различных областях науки: растениеводстве, почвоведении, агрономии, агрохимии, экологии, микробиологии и других. Особенно важными для решения этих задач являются микробиологические подходы и приемы, которые основаны на использовании потенциала растений и почвенных микроорганизмов, и биологических механизмов взаимодействия компонентов растительно-микробных систем. Известно, что почвенные микроорганизмы активно взаимодействуют с растениями и могут оказывать как положительные, так и отрицательные эффекты на их рост и питание. В настоящее время накоплен большой материал о механизмах положительных воздействий ассоциативных ризосферных бактерий на растения. К таким механизмам относятся фиксация атмосферного азота, продуцирование биологически активных веществ, активизация потребления корнями питательных элементов, биоконтроль фитопатогенов и индуцирование системной устойчивости растений.
Основываясь на знаниях о взаимодействии растительно-бактериальных ассоциаций и примерах улучшения роста и питания растений посредством инокуляции полезными формами микроорганизмов, нами была изучена роль некоторых биотических и абиотических факторов в растительно-бактериальных взаимодействиях и оценена возможность применения ассоциативных бактерий для повышения устойчивости растений к различным стрессовым факторам. Основными предпосылками проведенных исследований были следующие рассуждения. Во-первых, растения, находясь в неблагоприятных условиях среды или атакуемые патогенными микроорганизмами, нуждаются в дополнительных ресурсах питания и энергии, оптимизации гормонального статуса, и снижения интенсивности воздействия стрессоров. Во-вторых, перечисленные выше положительные эффекты ассоциативных бактерий затрагивают именно те процессы метаболизма растений и их взаимодействия с окружающей средой, которые нарушаются при стрессе. Поэтому логично предположить, что бактериальные эффекты потенциально ориентированы против негативных воздействий стрессоров и могут быть особенно важны для растений именно в неблагоприятных условиях. В-третьих, растительно-микробные ассоциации являются надорганизменными системами, обладающими новыми и уникальными качествами, и это может существенно влиять на адаптацию партнеров к стрессовым факторам и повышать уровень гомеостаза самой ассоциации.
Цели и задачи исследований
Основной целью проведенных исследований являлось получение новых знаний о механизмах взаимодействия растений с полезными формами почвенных микроорганизмов в зависимости от биотических факторов, обусловленных активностью и взаимодействием ризосферных бактерий, и условий внешней среды, которые проявляются как абиотические стрессы. С одной стороны, представлялось важным оценить влияние внешних биотических и биотических факторов на взаимодействие растительно-бактериальных ассоциаций, а с другой стороны, изучить роль ассоциативных бактерий в адаптации растений к стрессам. Особое внимание уделялось изучению преимуществ, которые растения получают при образовании эффективных ассоциаций с полезными микроорганизмами для противостояния негативным воздействиям окружающей среды, и механизмов интеграции растений с микроорганизмами в ризосфере в зависимости от внешних условий. Получение таких знаний направлено на раскрытие значения микробных ассоциаций и взаимодействий бактерий в ризосфере для роста и питания растений, а также на обоснование и эффективное использование потенциала микроорганизмов в их способности повышать устойчивость растений к стрессовым факторам.
Конкретные задачи исследований состояли в следующем:
-
Изучить взаимодействие производственных штаммов ассоциативных бактерий в питательных средах и ризосфере, а также оценить их влияние на рост и питание растений при совместной интродукции на семена. Описать аддитивные эффекты и механизмы взаимодействия ассоциаций азотфиксирующих и фосфатмобилизующих штаммов с растениями.
-
Выделить и охарактеризовать группу бактерий, доминирующих в ризосфере проростков растений, по их влиянию на рост растений и коллекционных штаммов ростстимулирующих бактерий. Оценить значение фактора взаимодействия производственных штаммов ассоциативных бактерий с аборигенной бактериальной микрофлорой ризосферы ячменя.
-
На основе принципа популяционного доминирования бактерий в ризосфере проростков провести селекцию эффективных ростстимулирующих штаммов. Рассмотреть колонизирующую активность интродуцируемых штаммов как фактор, влияющий на эффективности инокуляции.
-
Выделить и изучить штаммы бактерий, активно колонизирующие ризосферу гороха и горчицы сарептской и обладающих АЦК-деаминазной активностью, которая рассматривается как важный механизм стимуляции роста растений в стрессовых условиях.
-
Изучить влияние производственных штаммов и вновь выделенных АЦК-утилизирующих штаммов на устойчивость растений к стрессу, вызванному тяжелыми металлами. Оценить воздействие бактерий на аккумуляцию токсичных и питательных элементов.
-
Показать зависимость эффективности инокуляции бактериями, содержащими АЦК деаминазу, от обеспеченности растений питательными элементами. Изучить влияние уровня минерального питания растений на гомеостаз растительно-бактериальных ассоциаций.
-
Оценить эффективность инокуляции ячменя производственными штаммами ассоциативных бактерий при стрессах, вызванных неблагоприятными почвенно-климатическими факторами, а именно экстремальными температурами, повышенной кислотностью почвы и засухой.
-
Изучить роль фермента АЦК деаминазы в реакции растений гороха и томатов на инокуляцию АЦК-утилизирующими бактериями в условиях дефицита почвенной влаги.
Научная новизна
В работе использованы оригинальные подходы для изучения взаимодействия штаммов ассоциативных бактерий друг с другом и с аборигенной ризосферной микрофлорой. С одной стороны это позволило экспериментально продемонстрировать важность популяционных отношений интродуцируемых бактерий для проявления их ростстимурирующих эффектов на растение, а с другой стороны дало новую информацию о причинах нестабильности эффектов интродуцентов или искажения ожидаемой реакции растения на инокуляцию. Впервые проведены детальные исследования поведения ассоциативных бактерий в ризосфере в стрессовых условиях, вызванных различными почвенно-климатическими факторами, что внесло вклад в понимание динамики интродуцируемых бактериальных популяций и роли партнеров в формировании растительно-бактериальных ассоциаций в зависимости от условий среды. Новизной обладают методические приемы селекции и результаты исследований ассоциативных бактерий, содержащих АЦК деаминазу. Изучение функционирования ассоциаций ризосферных бактерий с растениями в стрессовых условиях позволило получить уникальную информацию об устойчивости и механизмах интеграции компонентов таких растительно-микробных систем.
Ниже перечислены наблюдения, закономерности или методические приемы, которые были установлены или разработаны в ходе исследований:
-
Выявлена бинарная ассоциация производственных штаммов Azospirillum lipoferum 137 и Agrobacterium radiobacter 10, в которой азоспириллы активнее фиксируют азот и лучше приживаются на корнях растений. Впервые показано, что проявление симбиотических свойств партнеров ассоциации азотфиксирующих и фосфатмобилизирующих бактерий в ризосфере может быть важным механизмом усиления положительного эффекта интродуцентов на рост растений.
-
Впервые, с использованием метода изотопной индикации, установлено, что фосфатмобилизующие бактерии способны улучшать фосфорное питание растений за счет активизации поглощения фосфорного удобрения. Получены оригинальные результаты показавшие, что проявление аддитивного эффекта совместной инокуляции растений бактериями Az. lipoferum 137 и Ag. radiobacter 10 связано с индивидуальными особенностями механизмов воздействия этих штаммов на азотное и фосфорное питание растения. Образование данной растительно-бактериальной системы приводит к повышению коэффициента использования растениями азотного и фосфорного удобрения.
-
Впервые изучена динамика численности производственных штаммов ростстимулирующих бактерий в ризосфере различных сельскохозяйственных культур и почве. Показано, что штаммы активно колонизируют корни в различных почвенно-климатических условиях, в том числе при выращивании растений на загрязненных и кислых почвах, а также в условиях засухи. Обнаружены индивидуальные особенности штаммов, обусловленные генетическим контролем способности интродуцентов поддерживать численность популяции в ризосфере на определенном уровне.
-
Получены оригинальные данные о важности взаимодействия интродуцируемых штаммов с аборигенной бактериальной микрофлорой ризосферы растений. Впервые выделена и охарактеризована ассоциация ростстимулирующего интродуцента с фитопатогенным видом бактерий и описана способность биоконтрольных интродуцентов ингибировать активность полезных форм аборигенных бактерий.
-
Предложен метод селекции эффективных штаммов ростстимулирующих бактерий, обладающих высокой степенью ассоциативности, которая проявляется в их способности активно колонизировать корни проростков растений в нестерильной почве. Были изучены свойства и влияние на растения представителей сообществ культурабельных бактерий, доминирующих на корнях проростков ячменя, гороха и горчицы сатептской при выращивании растений на различных почвах, в том числе на загрязненных металлами почвах, на осадках сточных вод и горных отвалах. В результате исследований отселектированы штаммы с высоким потенциалом колонизации ризосферы, которые не уступают производственным штаммам по ростстимулирующей активности.
-
Впервые выделены и детально охарактеризованы устойчивые к тяжелым металлам ростстимулирующие бактерии, содержащие фермент АЦК деаминазу и колонизирующие ризосферу проростков растений, выращенных на загрязненных почвах. У большинства видов выделенных нами бактерий присутствие АЦК деаминазы ранее не было описано.
-
Впервые показано, что производственные штаммы ризобактерий и выделенные в ходе работы АЦК-утилизирующие бактерии повышают устойчивость инокулированных растений к токсичности кадмия и свинца. Важным механизмом ростстимулирующего эффекта бактерий на растения в присутствие тяжелых металлов является их способность поддерживать нормальное минеральное питание растений, и этим противодействовать негативному действию токсикантов.
-
Проведены оригинальные исследования о зависимости взаимодействия АЦК-утилизирующих бактерий с растениями от уровня минерального питания. Показано, что ростстимулирующий эффект бактерий может нивелироваться при дефиците фосфора и избытке азота в среде.
-
Экспериментально обоснована способность производственных штаммов ассоциативных бактерий повышать устойчивость инокулированных растений к негативному действию стрессов, вызванных неблагоприятными почвенно-климатическими факторами, такими как экстремальные температуры, повышенная кислотность почвы и засуха.
-
Впервые с помощью бактериального мутанта с пониженной активностью АЦК деаминазы и химических ингибиторов фитогормона этилена показана важная роль этого фермента в повышении устойчивости инокулированных растений к дефициту почвенной влаги.
-
Впервые описано положительное действие бактерий, содержащих АЦК деаминазу, на образование симбиоза бобового растения с клубеньковыми бактериями при дефиците влаги. Совместная инокуляция гороха этими бактериями существенно повышала количество клубеньков на корнях, как в оптимальных, так и в стрессовых условиях, вызванных недостаточным увлажнением.
-
Впервые изучен эффект бактериальной АЦК деаминазы на транспорт сигнальных молекул АЦК и абсцизовой кислоты (АБК) из корня в побег. Снижение концентрации АЦК и повышение концентрации АБК в ксилемном соке при инокуляции в условиях засухи указывает на индукцию бактериями системной устойчивости у растений.
-
Впервые обнаружено стимулирующее воздействие АЦК-утилизирующих бактерий на развитие корневых волосков у инокулированных растений.
Практическая ценность
Исследования имеют важное практическое значение для развития экологически безопасного и ресурсосберегающего сельскохозяйственного производства и поиска путей решения ряда экологических проблем:
-
Выделенные штаммы ростстимулирующих ассоциативных бактерий, которые являются активными колонизаторами корней и оказывают положительное действие на рост и минеральное питание растений, представляют собой ценный биологический ресурс для проведения прикладных исследований в земледелии. Штаммы АЦК-утилизирующих бактерий служат перспективными объектами для создания биопрепаратов нового типа, обладающих специализированным антистрессовым эффектом на растения и эффективных в неблагоприятных условиях, вызванных почвенно-климатическими и антропогенными факторами.
-
Экспериментальные данные о воздействиях производственных штаммов на растения и колонизации ризосферы интродуцентами обосновывают возможности эффективного применения биопрепаратов в широком диапазоне варьирования почвенно-климатических факторов, а том числе при стрессах, вызванных экстремальными температурами, повышенной кислотностью почвы, засухой и токсичностью тяжелых металлов.
-
Ряд наблюдений и выявленных закономерностей могут быть использованы в качестве практических рекомендаций для разработки и эффективному применению микробных биопрепаратов в сельском хозяйстве. Например, целесообразность использования комбинаций нескольких штаммов интродуцентов и селекции штаммов с высокой «буферностью» и эврибионтностью популяции, зависимость эффективности инокуляции АЦК-утилизирующими ризобактериями от уровня минерального питания растений, а также необходимость учета микробных взаимодействий в ризосфере при интерпретации данных о реакции растений на инокуляцию.
-
Результаты исследований важны для создания устойчивых к стрессам и высокопродуктивных растительно-микробных ассоциаций и ризосферных микробных сообществ, используемых в технологиях фиторемедиации загрязненных почв и восстановления нарушенных экосистем.
Апробация работы
Результаты работы были представлены на Республиканской научной конференции «Симбиотрофные азотфиксаторы и их использование в сельском хозяйстве» (Чернигов, 1987), на VIII Всесоюзном Баховском Коллоквиуме (Кобулети, 1988), на Всесоюзном совещании «Проблема азота в интенсивном земледелии» (Краснообск, 1990), на V Международном симпозиуме по несимбиотической азотфиксации (Florence, 1990), на Всесоюзных конференциях "Проблема азота в интенсивном земледелии" (Новосибирск, 1990) и "Микроорганизмы в сельском хозяйстве" (Пущино, 1992), на 9-м Баховском коллоквиуме (Москва, 1995), на Международных конференциях «Nitrogen fixation with Non-Legumes» (Giza, 1994), «The 1-st European Nitrogen Fixation Confference» (Szeget, 1994), "BIOTECHNOLOGY St.Petersburg' 94" (С.-Петербург, 1994), «BNF Associated with Rice» (Dhaka, 1994), «The 6-th International Symposium AABNF» (Herare, 1994), «Workshop on Associative Interactions of NF Bacteria with Plants» (Саратов, 1995), The 10-th International Congress «Nitrogen Fixation: Fundamentals and Applications» (С.-Петербург, 1995), «BNF with Non-Legumes» (Faisalabad, 1996), «Роль России и Сибири в развитии экологии на пороге XXI века» (Омск, 1997), «The 3-rd European Nitrogen Fixation Conference» (Lunteren, 1998), «New Approaches and Techniques in Breeding Sustainable Fodder Crops and Amenity Grasses» (С.-Петербург, 2000), «Tagungsband of the German Botanical Society» (Jena, 2000), «Trace Elements in Medicine» (С.-Петербург, 2002), «The 11-th International MPMI Congress» (С.-Петербург, 2003), «The 4-th International Crop Science Congress» (Brisbane, 2004), «Irrigation of Horticultural Crops» (Mildura, 2006), «Annual Main Meeting of the Society for Experimental Biology» (Glasgow, 2007), «Abiotic stress in legumes» (Tunis, 2007), и на Всероссийской конференции "Научные основы ведения агропромышленного производства в условиях крупных радиационных аварий" (Обнинск, 1996).
Исследования проводились в лаборатории экологии симбиотических и ассоциативных ризобактерий ГНУ ВНИИСХМ. Автор представлял результаты на семинарах в Санкт-Петербургском Аграрном Университете, ИБФРМ РАН (Саратов), университетах городов Вюрцбурга и Белефельда (Германия), Ватерлоо (Канада), Тегерана (Иран), Хитоцубаши, Мацуяма, Кобе и Киото (Япония), Сассари (Италия) и Ланкастера (Великобритания). Часть исследований выполнена в сотрудничестве с вышеперечисленными организациями, а также с Сибирским НИИСХ (г. Омск), Краснодарским ВНИИСХ, НИИОЗМСХ и ВНИИ овощеводства (г. Тирасполь), ВНИИМЗ (г. Тверь) и Агрофизическим НИИ (г. Санкт-Петербург).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 58 печатных работ, из которых 11 статей в международных рецензируемых журналах, 9 статей в отечественных рецензируемых журналах, 12 статей в сборниках и трудах конференций, и 26 тезисов докладов на конференциях.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, аналитического обзора литературы, описания объектов и методов исследований, изложения и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, благодарностей, списка использованной литературы и списка публикаций по теме диссертации. Работа изложена на 356 страницах и включает 42 таблицы и 43 рисунка. Список литературы включает 543 наименования, в том числе 455 зарубежных.
Механизмы положительного воздействия ассоциативных бактерий на растения
В настоящее время известен целый ряд механизмов положительного влияния ассоциативных и ризосферных бактерий на рост, питание и устойчивость к болезням растений. Результаты многочисленных исследований в данной области неоднократно систематизировались и обсуждались в обзорных статьях (Муромцев и др., 1985; Jagnow, 1987; Редькина, 1989; Lambert and Joos, 1989; Bashan and Levanony, 1990; Емцев, 1994; Glick, 1995; Каменева и Муронец, 1999; Dobbelaere et al., 2003; Persello-Cartieaux et al., 2003; Mantelin and Touraine, 2004; Игнатов, 2005). Только за последние три года вышло в свет несколько книг по проблемам взаимодействия растений с ассоциативными бактериями, что свидетельствует о важности и актуальности исследований, посвященных этому виду растительно-микробных систем (Siddiqui, 2005; Barton and Abadia, 2006; Gnanamanickam, 2006; Elmerich and Newton, 2007). Интерес к бактериальным ассоциантам растений, не образующим симбиотических структур и органов, связан также с обнаружением и характеристикой эндофитных видов, которые способны проникать и колонизировать ткани корней и надземных частей растений (Triplett, 1996; Schulz et al., 2006; Elmerich and Newton, 2007). В данном обзоре представлено краткое описание наиболее известных механизмов положительного воздействия ассоциативных бактерий на растения. Подробно в отдельной главе описано взаимодействие растений с бактериями, способными регулировать уровень фитогормона этилена, поскольку данный механизм был открыт относительно недавно (Glick et al., 1994) и большая часть наших исследований связана с изучением именно таких бактерий.
В течение несколько десятилетий изучения ассоциативных бактерий накоплен огромный материал о применении этих микроорганизмов для обработки (инокуляции) различных растений, главным образом сельскохозяйственных культур, который убедительно показал эффективность этого приема в целях получения высокого и качественного урожая. Следует уточнить, что в понятие инокуляции с одной стороны входит способ интродукции бактериальной популяции на органы растения для образования и регулирования растительно-бактериальных ассоциаций. С другой стороны, термин инокуляция выражает также само воздействие, оказываемое бактериями на растения. Прикладные аспекты взаимодействия ассоциативных бактерий с растениями были многократно систематизированы в обзорных статьях (Jagnow, 1987; Кожемяков и Доросинский, 1989; Kloepper et al., 1989; Bashan and Levanony, 1990; Okon and Labandera-Gonzalez, 1994; Glick, 1995; Майорова с соавт., 1996; Кожемяков и Тихонович, 1998; Vessey, 2003; Кожемяков и др., 2004; Zahir et al., 2004; Завалин, 2005; Чеботарь и др., 2007), поэтому в данном обзоре мы будем касаться эффективности инокуляции только в контексте рассмотрения других вопросов.
Наиболее подробно изучены взаимодействия растений с азотфиксирующими бактериями (диазотрофами), включая вопросы изоляции, экологии, таксономии, хемотаксиса и колонизации корней бактериями и их выживаемости в почве, биохимических и молекулярных механизмов процесса азотфиксации, а также других механизмов взаимодействия этих бактерий с растениями (Van Berkum and Bohlool, 1980; Умаров, 1986; Hartman, 1988; Садыков, 1989; Bashan and Levanony, 1990; Baldani et al., 1997; James, 2000; Bashan et al., 2004; Klipp et al., 2005). К наиболее изученным группам ассоциативных азотфиксаторов следует отнести бактерии родов Azospirillum, Azotobacter и Klebsiella. Результаты многочисленных исследований показали, что ассоциативная азотфиксация в определенных случаях может вносить существенный вклад в дополнительное обеспечение растений азотом. Большое значение азотфиксация имеет во взаимодействии ассоциаций некоторых видов растений и эндофитов, например, ассоциации сахарного тростника с диазотрофом Acetobacter diazotrophicus (Sevilla et al., 2001). Среди последних публикаций на тему ассоциативной азотфиксации интерес представляет сообщение о том, что при инокуляции риса бактерией Azospirillum amazonense растения содержали до 27% азота, источником которого была атмосфера
Изоляция штаммов бактерий доминирующих в ризосфере проростков растений
Для изучения роли взаимодействия интродуцируемых ассоциативных бактерий с микрофлорой ризосферы в реакции растений на инокуляцию и селекции высокоэффективных ростстимулирующих штаммов по принципу популяционного доминирования нами предложен метод выделения бактерий, доминирующих в культурабельном бактериальном сообществе ризосферы проростков растений. Такие бактерии условно названы ДР-бактерии (Доминирующие в Ризосфере). Термин «культурабельный» уточняет, что изучалась только та часть сообщества, представители которой могут расти на искусственных питательных средах. Для выделения ДР-бактерий семена растений поверхностно стерилизовали (см. раздел «Использование гнотобиотических растительно-бактериальных культур» ниже) и высевали в сосуды, наполненные различными почвами. Характеристика использованных почв представлена в тех главах, где описаны определенные группы выделенных бактерий. Корни 5-суточных проростков аккуратно отмывали от частиц почвы в стерильной воде и гомогенизировали. Из гомогената готовили ряд последовательных разведений, которые высевали на агаризованные питательные среды. Для выделения ДР-бактерий из проростков ячменя использовали среду N19. Для селекции АЦК-утилизирующих бактерий использовали среды BPF (для обогащения культуры псевдомонадами) и РЕ (для обогащения культуры бактериями, использующими вещества растительного происхождения) с последующим культивированием консорциумов на АЦК-содержащих средах DF и MDF. В некоторых экспериментах гомогенаты корней сразу высевали на АЦК-содержащие среды SMN и SMC. Более детально процедуры получения бактериальных изолятов описаны ранее (Белимов и др., 1998; Belimov et al., 2001, 2005). Через 4-5 суток инкубации при 28С с поверхности агара в каждом варианте опыта изолировали по 10-15 доминирующих типов колоний, различающихся между собой по морфологическим признакам. Чистоту изолированных штаммов ДР-бактерий проверяли многократным клонированием изолятов на агаризованных средах N19HBPF.
Штаммы идентифицировали методом секвенирования части (около 500 Ьр) гена 16S рибосомальной РНК. Для амплифицирования ДНК методом ПЦР использовали живые суточные клетки или тотальную ДНК бактерий, экстрагированную из суточных клеток как описано ранее (Bulat et al., 1998). Реакцию ПЦР проводили с использованием праймеров 8f (5 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ) и 519r (5 -GWATTACCGCGGCKGCTG-3 ) как описано ранее (Preisfeld et al. 2000). Аликвоты ПЦР продукта анализировали электрофорезом в 1% агарозном геле, содержащим 10 мкг/мл этидиум бромида. Очистку ПЦР продукта проводили с использованием китов E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (Peqlab Biotech. GmbH) или QIEAX II DNA (Qiagen). Секвенирование ДНК осуществляли на автоматических секвенаторах RRRTCS Kit (Applied Biosystems, Perkin-Elmer, Norwalk, Conn.) или Long-Read Tower System (Visible Genetics Inc) по стандартным протоколам производителей. Полученные последовательности ДНК анализировали с помощью программы BLAST и сравнивали с последовательностями, имеющимися в базе NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Номера полученных сиквенсов были представлены в NCBI и указаны в таблице 15. После нахождения ближайших генетических родственников изучаемых штаммов в базе NCBI было проведено уточнение таксономического положения изучаемых штаммов методами нумерической таксономии на основе информации о физиолого-культуральных и биохимических свойствах видов бактерий, близких к изучаемым штаммам (Hold et al., 1994; Звягинцев, 1991). Метод Якобсона (Jacobson et al., 1994). Бактерии выращивали 48 ч при 28С на жидкой среде MDF с добавлением 0,3 г/л АЦК или 1 г/л (NH4)2S04. Суспензии центрифугировали (9000 g; 10 мин) при комнатной температуре, клетки ресуспензировали в ОД М фосфатном буфере (рН = 7.0) и вновь центрифугировали. Затем клетки ресуспензировали в 0,1 М фосфатном буфере (рН = 8.0), разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе UD-20, и полученные клеточные экстракты центрифугировали (100000 g; 30 мин) при 4С. К 0,7 мл супернатанта добавляли 0,5 мл 10 мМ АЦК, смесь инкубировали в течение 20 ч при 28С, и определяли количество образовавшегося из АЦК аммония с использованием реактива Несслера.
Роль взаимодействия интродуцируемых бактерий с аборигенной микрофлорой ризосферы в реакции растений на инокуляцию
Целью нашей работы являлось исследование взаимодействий аборигенной бактериальной микрофлоры ризосферы ячменя с коллекционными штаммами ассоциативных бактерий. В задачи исследований входило: (1) выделить и изучить представителей бактерий доминирующих в ризосфере проростков ячменя (ДР-бактерий); (2) изучить взаимодействие ДР-бактерий с коллекционными штаммами ассоциативных бактерий; (3) оценить роль ДР-бактерий в эффективности взаимодействия интродуцируемых популяций с растениями ячменя.
Для выделения ДР-бактерий семена ячменя сорта Темп стерилизовали смесью перекиси водорода и этанола (1:1) и высевали в сосуды, наполненные различными почвами: серая лесная (Молдова), бурая лесная (Карпаты), дерново-подзолистая слабо- и хорошо-окультуренная (Московская и Ленинградская обл.), чернозем типичный (Венгрия), чернозем мицелярно-карбонатный (Крым), темно-каштановая (Румыния) и коричневая (Крым).
Из 115 штаммов бактерий, изолированных из ризосферы проростков ячменя, выращенного на данных почвах, 90 штаммов представляли собой грамотрицательные неспорообразующие подвижные палочки, различающиеся по форме и размерам. Остальные штаммы являлись грамотрицательными неподвижными кокками (12 штаммов) или спорообразующими палочками (13 штаммов). Изучение влияния метаболитов ДР-бактерий на рост коллекционных штаммов ассоциативных бактерий показало, что 55 штаммов ДР-бактерий полностью ингибир овали рост хотя бы одного коллекционного штамма, 12 штаммов ДР-бактерий ингибировали рост большинства коллекционных штаммов, а 6 штаммов ДР-бактерий полностью ингибировали рост всех коллекционных культур. Только 13 штаммов ДР-бактерий стимулировали рост 1-3 штаммов коллекционных культур, которыми, как правило, являлись Flavobacterium sp. ЛЗО и Ar. mysorens 7. Результаты экспериментов представлены в виде кластерной диаграммы, построенной по данным об устойчивости микроорганизмов, выраженной в баллах (Рис. 6). Штаммы, относящиеся к роду Azospirillum, были наиболее чувствительны к метаболитам ДР-бактерий и сгруппировались в отдельный кластер А при уровне сходства 73%. Количество баллов у азоспирилл, а также у чувствительных штаммов Pseudomonas sp. DC и Serracia rubidea 112, было в 2-3 раза меньше, чем у остальных тестируемых культур. Штаммы, вошедшие в кластер В, включающий в основном представителей семейства Entervbacteriaceae, были сравнительно устойчивы, при этом положительного влияния ДР-бактерий на их рост не обнаружено. Наиболее устойчивыми являлись штаммы, относящиеся к родам Agrobacterium, Arthrobacter и Flavobacterium, которые образовали кластер С. При сравнении кластерных диаграмм, построенных по данным для отдельных групп ДР-бактерий (выделенных при выращивании растений на определенной почве), установлено, что ДР-бактерии, присутствующие в различных почвах, как правило, обладали сходным спектром действия на рост конкретных штаммов ассоциативных диазотрофов (данные не представлены).
Изучение выживаемости в почве двух коллекционных штаммов, различающихся по устойчивости к метаболитам ДР-бактерий, показало, что численность чувствительного штамма Az. lipoferum 137 на 20-е и 40-е сутки инкубации была существенно выше при внесении в почву рифампицина, который препятствовал развитию аборигенных микроорганизмов (Рис. 7). Добавление в почву рифампицина не оказало существенного влияния на выживаемость устойчивого к микробным метаболитам штамма Ar. mysorens 7.
Среди ДР-бактерий был отобран штамм Д1, метаболиты которого in vitro стимулировали рост некоторых ассоциативных бактерий, в том числе Az. lipoferum 137. Штамм Д1 скользящих бактерий был идентифицирован методами нумерической таксономии как представитель скользящих бактерий вида Cytophaga jonsonae на основании изучения его морфологических и биохимических свойств (Белимов и др., 1998). Стимуляция роста азоспирилл данным штаммом выражалась в образовании характерного узора у совместных колоний на питательных средах с красителем конго красным, который окрашивает колонии азоспирилл в пурпурно-красный цвет (Рис 9). Наблюдается образование характерного узора у колоний, вызванное распространением азоспирилл в колониях скользящей бактерии С. jonsonae Д1, имеющей плоские полупрозрачные желтоватые колонии.
В чистой культуре штамм С. jonsonae Д1 не восстанавливал ацетилен, но стимулировал нитрогеназную активность у Az. lipoferum 137 при совместном культивировании бактерий (Рис. 10А). Динамика нитрогеназной активности у азоспирилл в присутствие С. jonsonae Д1 указывала на то, что бактерии образовывали устойчивую ассоциацию с высокой азотфиксирующей активностью. В вегетационном опыте С. jonsonae Д1 повысил также способность Az. lipoferum 137 колонизировать корни ячменя при совместной инокуляции на ранних этапах вегетации растений (Рис. 10Б).
Тем не менее, совместная инокуляция ячменя данными штаммами оказалась неэффективной из-за того, что С. jonsonae Д1 отрицательно повлиял на продуктивность растений (Рис. 11). Чистая культура Az. lipoferum 137 повысила надземную массу растений в фазу выхода в трубку, но не оказала существенного влияния на урожай зерна. Однако положительное влияние азоспирилл на урожай усилилось на фоне инокуляции растений штаммом С. jonsonae Д1. При совместной инокуляции масса зерна достоверно увеличилась на 25% относительно варианта, инокулированного чистой культурой С. jonsonae Д1.
Взаимодействие АЦК-утилизирующих бактерий с растениями в стрессовых условиях, вызванных токсичностью кадмия
Инокуляция рапса штаммами P. brassicacearum Am3, P. putida ВтЗ и P. marginalis Dpi стимулировала развитие корней у растений, выращенных на незагрязненной почве (Табл. 17). При внесении в почву кадмия положительное действие на корни проявилось при инокуляции P. putida Am2 и P. marginalis Dpi, а штаммы Ат2 и АтЗ повысили также массу проростков. В целом положительное действие бактерий на рост растений проявилось в большей степени в стрессовых условиях, т.к. достоверное увеличение массы всего растения получено на загрязненной кадмием почве. Инокуляция не влияла на содержание Cd в растениях (Табл. 17).
В опыте 1 с горчицей сарептской штаммы P. brassicacearum АтЗ и V. paradoxus 5С-2 не оказали стимулирующего действия на корни, но увеличили массу побегов на необогащенной кадмием дерново-подзолистой почве (Рис. 21). Однако при добавлении в почву кадмия только V. paradoxus 5С-2 повышал массу корней. Не обнаружено существенных различий между контрольными и инокулированными растениями по содержанию и накоплению кадмия в побегах (Рис. 22). Штаммы значительно различались по способности колонизировать ризосферу горчицы. Так, численность P. brassicacearum АтЗ снижалась в ходе эксперимента, а при 60 мг Cd/кг популяция интродуцента элиминировалась из зоны корней (Рис. 23). Напротив, штамм V. paradoxus 5С-2 интенсивно колонизировал корни в отсутствии и, особенно в присутствии кадмия в почве.
Во втором опыте горчицу сарептскую выращивали в коммерческом компосте "Pro-Mix ВХ" и инокулировали АЦК-утилизирующим штаммом V. paradoxus 5С-2 или штаммом Flavo bacterium sp. 5N-1, который не утилизирует АЦК (Belimov et al., 2005). В данных условиях добавление кадмия в компост приводило к ингибированию роста растений, а инокуляция снимала этот негативный эффект (Табл. 18). Оба штамма существенно повысили содержание кадмия в побегах, при этом вынос этого элемента биомассой увеличился более чем в 2 раза (Табл. 18).
В вегетационном опыте с горохом штамм P. brassicacearum АтЗ повысил массу побегов генотипа ВИР-188 на незагрязненной почве и массу корней и побегов генотипов ВИР-165 8 и ВИР-4788 на загрязненной кадмием почве (Табл. 19). На обеих почвах штамм P. marginalis Dpi стимулировал рост корней у ВИР-188 и ВИР-4788, а также рост побегов у ВИР-4788. Положительное действие штамма Rhodococcus sp. Fp2 проявилось на генотипах ВИР-188 и ВИР-1658 выращенных на незагрязненной почве.
Ни один из штаммов не повлиял на рост генотипа ВИР-3429. На обогащенной кадмием почве ростстимулирующий эффект, рассчитанный как % к контролям без инокуляции, от штаммов P. brassicacearum АтЗ и P. marginalis Dpi был сравним или превышал прибавки биомассы, полученные на незагрязненной почве. При этом, в условиях кадмиевого стресса эффект бактерий на корни растений коррелировал с их действием на побеги (г = +0.90, Р 0.001, п= 12).
Положительная корреляция обнаружена между реакцией необработанных и обработанных кадмием растений на инокуляцию штаммами АтЗ и Dpi (гкорснь = +0.86, Р = 0.006; Гноби. = +0.73, Р = 0.04; п = 8). Кадмий существенно ингибировал рост всех генотипов, при этом ухудшение роста корней и побегов неинокулированных растений варьировало от -34% (Р = 0.01; ВИР-188) до -47% (Р 0.001; ВИР-3429) и от -23% (Р = 0.004; ВИР-188) до -35% (Р 0.001; ВИР-4788), соответственно (Табл. 19).
В незагрязненной почве штаммы P. brassicacearum АтЗ и P. marginalis Dpi повысили содержание азота в побегах генотипов ВИР-3429 и ВИР-188 (Табл. 20). При добавлении кадмия в почву только Rhodococcus sp. Fp2 повысил содержание азота у ВИР-3429. Содержание фосфора в растениях в некоторых случаях снижалось в зависимости от генотипа растения и штамма. Инокуляция не влияла на содержание калия в побегах гороха, за исключением положительного эффекта от штамма Rhodococcus sp. Fp2 на генотип ВИР-4788 при обогащении почвы кадмием. Существенное повышение содержания кальция наблюдалось у ВИР-188, ВИР-3429 и ВИР-4788 при инокуляции Rhodococcus sp. Fp2. На загрязненной почве штаммы P. brassicacearum АтЗ и P. marginalis Dpi повысили содержание кальция у генотипов ВИР-3429 и ВИР-4788, соответственно. Содержание серы также повышалось у инокулированных растений, в основном у генотипов ВИР-188 и ВИР-4788 выращенных как на незагрязненной почве, так и при внесении кадмия. Влияние инокуляции на содержание железа было довольно специфичным: (1) без добавления кадмия
