Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Тиоловые редокс-системы У Е. COLI 11
1.1. Редокс-система глутатиона 11
1.1.1 Глутатион 11
1.1.2 Глутатионредуктаза 13
1.1.3 Глутаред оксины 14
1.2. Редокс-система тиоредоксина 16
1.2.1 Тиоред оксины 16
1.2.2 Тиоредоксинредуктаза 16
1.3. Функциональная связь между редокс-системами глутатиона и тиоредоксина 17
Глава 2. Окислительный стресс у бактерий 19
2.1. Источники АФК и повреждения, вызываемые окислительным стрессом 19
2.2. Механизмы защиты от окислительного стресса 22
2.3. Адаптивный ответ на окислительный стресс 24
2.4. Роль тиоловых редокс-систем при окислительном стрессе 26
Глава 3. Действие антибиотиков на бактерии 27
3.1. Молекулярные механизмы действия антибиотиков 27
3.1.1 Ингибиторы процессов образования клеточной стенки бактерий 28
3.1.2 Ингибиторы процессов биосинтеза белка 28
3.1.3 Ингибиторы репликации и транскрипции ДНК и РНК 29
3.2. Гипотеза об окислительном стрессе как универсальном механизме бактерицидного действия антибиотиков 30
Глава 4. Температурные стрессы у бактерий 33
4.1. Тепловой стресс 33
4.1.1. Характерные изменения в клетке при повышении температуры 33
4.1.2. Адаптивный ответ на тепловой стресс 34
4.1.2.1. Белки теплового шока 34
4.1.2.2 Регуляция ответа на тепловой шок 36
4.1.3. Роль тиоловых редокс-систем и экспрессии антиоксидантных генов при тепловом стрессе 38
4.2. Холодовой стресс 39
4.2.1. Характерные изменения в клетке при резком понижении температуры 39
4.2.2. Белки холодового шока 41
4.2.3. Роль тиоловых редокс-систем и экспрессии антиоксидантных генов при холодовом стрессе 42
Экспериментальная часть 45
Глава 5. Объекты и методы исследований 45
5.1. Бактериальные штаммы 45
5.2. Питательная среда и условия культивирования 46
5.3. Определение устойчивости бактерий к стрессовым воздействиям 47
5.4. Определение способности к образованию биопленок 48
5.5. Определение подвижности бактерий 49
5.6. Измерение внутри- и внеклеточной концентрации глутатиона з
5.7. Определение уровня дисульфидов в белках 50
5.8. Определение концентрации перекиси водорода 51
5.9. Определение активности гидропероксидаз НРІ и НРП 51
5.10. Определение экспрессии антиоксидантных генов (по активности Р-галактозидазы) 52
5.11. Статистическая обработка полученных результатов 53
5.12. Материалы 53
Глава 6. Характеристика бактерий escherichia coli, мутантных по Тиоловым редокс-системам 54
6.1. Рост и выживаемость бактерий 54
6.2. Способность к образованию биопленок 55
6.3. Подвижность бактерий 56
6.4. Концентрация внутри- и внеклеточного глутатиона 57
6.5. Уровень тиолов и дисульфидов в белках 58
6.6. Концентрация пероксида водорода в культуральной среде 59
6.7. Активность гидропероксидаз HPI и НРП 60
6.8. Экспрессия генов katGu sodA 62
6.9. Устойчивость бактерий к пероксидному стрессу 63
ГЛАВА 7. Роль тиоловых редокс систем в ответе бактерий escherichia coli на температурные стрессы 65
7.1. Рост и выживаемость бактерий при температурных стрессах 65
7.2. Влияние температуры культивирования на способность к образованию биопленок... 67
7.3. Продукция пероксида водорода при температурных стрессах 73
7.4. Экспрессия антиокисдантных генов при температурных стрессах 75
ГЛАВА 8. Роль тиоловых редокс систем в ответе бактерий escherichia coli на действие атибиотиков 81
8.1. Минимальные ингибирующие концентрации антибиотиков 81
8.2. Рост и выживаемость бактерий при действии антибиотиков 82
8.3. Влияние искусственных изменений уровня глутатиона внутри и снаружи клеток на устойчивость Е. coli к различным антибиотикам 87
8.4. Комбинированное действие антибиотиков и температурных стрессов 92
8.5. Способность к образованию биопленок в присутствии антибиотиков 98
8.6. Влияние экзогенных антиоксидантов на способность к образованию биопленок 100
Обсуждение 103
Заключение 115
Выводы 117
Литература
- Глутаред оксины
- Механизмы защиты от окислительного стресса
- Ингибиторы репликации и транскрипции ДНК и РНК
- Роль тиоловых редокс-систем и экспрессии антиоксидантных генов при тепловом стрессе
Глутаред оксины
Тиоредоксин представляет собой небольшой белок, имеющий длину от 105 до ПО аминокислот [Eklund et al, 1991]. Все тиоредоксины имеют одинаковую трехмерную структуру, которая состоит из трех а-спиралей и четырех складчатых Р-структур. Активный центр Cys-Gly-Pro-Cys локализован на петле, соединяющей первую Р-структуру с первой а-спиралью [Dyson et al., 1989; Martin, 1995].
Тиоредоксин 1 кодируется геном trxA. Он служит донором электронов для рибонуклеотидредуктазы, З -фосфоаденилсульфатредуктазы (PAPS) и метионинсульфоксидредуктазы [Gleason and Holmgren, 1988]. Тиоредоксин локализован на бактериальной мембране и в области нуклеоида, большая его часть сосредоточена в сайтах адгезии между внутренней и наружной мембранами Е. coli [Nygren etal, 1981, Bayer et al., 1987].
Тиоредоксин 2 кодируется геном trxC, восстанавливает рибонуклеотидредуктазу и PAPS-редуктазу in vitro [Lillig et al, 1999]. Содержание в клетке тиоредоксина 1 в десять раз выше, чем тиоредоксина 2. Аминокислотная последовательность двух тиоредоксинов совпадает на 38%. У тиоредоксина 2 обнаружена N-концевая последовательность из 30 аминокислот, которая включает в себя мотив С-Х-Х-С-Х16-С-Х-Х-С. Предполагают, что эта последовательность обеспечивает термостабильность или участвует в активации шаперонатеплового шокагЬрЗЗ [Burlacu-Miron etal, 1998, Jakob etal, 2000].
В восстановлении окисленного тиоредоксина участвует тиоредоксинредуктаза [Williams, 1995]. Тиоредоксинредуктаза является ферментом с молекулярным весом 70000, состоящая из двух идентичных субъединиц, каждая из которых связывает молекулу ФАД. В отличие от остальных флавопротеидов, тиоредоксинредуктаза содержит в активном центре только два аминокислотных остатка между цистеинами вместо четырех и проявляет слабую консервативность последовательности аминокислот в области активного центра фермента [Russel and Model, 1988]. При структурном анализе тиоредоксинредуктазы из Е. coli выявлены значительные конформационные изменения, связанные с переносом восстановительных эквивалентов с домена, связывающего НАДФН, на домен, содержащий дисульфид [Lennon etal, 2000].
Несмотря на важную роль тиоредоксина в метаболизме Е. coli, при делеции гена, кодирующего тиоредоксин 1 (trxA), не происходит существенного изменения фенотипа [Russel and Model, 1985].
Системы глутатиона и тиоредоксина считаются параллельными редокс-ситемами клетки, не обменивающимися восстановительными эквивалентами [Das and White, 2002]. Однако при наличии дефектов в той или иной системе, они по функциям могут дублировать друг друга. В связи с этим делеция компонентов одной из систем часто никак не проявляется фенотипически, и только множественные мутации, затрагивающие обе системы, ведут к существенным нарушениям метаболизма. Глутаредоксин или тиоредоксин необходимы для восстановления сульфата в сульфит с помощью PAPS-редуктазы, поэтому двойные мутанты grxAtrxA теряют способность ассимилировать сульфат. В связи с этим в данном штамме происходит резкое снижение уровня глутатиона со сдвигом редокс-статуса в сторону окисленной формы [Miranda-Vizuete et al, 1996]. У двойных мутантов gshAtrxA повышена также индукция рибонуклеотидредуктазы и Grxl (в 55 раз выше, чем в клетках дикого типа).
Показана обратная корреляция между уровнями глутаредоксина и тиоредоксина при относительно стабильном содержании других редоксинов. Вероятнее всего глутаредоксин 1 и тиоредоксин 1 имеют перекрывающиеся специфические функции, связанные с восстановлением рибонуклеотидредуктазы [Potamitou etal, 2002а].
Наряду с глутатионом тиоредоксины и глутаредоксины участвуют в создании общих восстановительных условий в цитоплазме, что было подтверждено в экспериментах с лишенной сигнальной последовательности щелочной фосфатазой [Derman etal, 1993].
Экспрессия глутаредоксинов и тиоредоксинов индуцируется в условиях окислительного стресса при нарушении редокс-равновесия в клетке [Prieto-Alamo et al, 2000, Potamitou et al, 2002a]. При этом была показана устойчивость штаммов, лишенных всех тиоредоксинов, к окислительному стрессу. Вероятно, в отсутствии тиоредоксинов происходит образование дисульфидных связей в белке OxyR, что приводит к активации других антиоксидантных систем клетки, таких как AhpC и каталаза, имеющих более высокую способность удалять пероксид водорода [Ritz et ah, 2000]. Таким образом, система тиоредоксина не является необходимой для защиты от окислительного стресса в клетках Е. coli, однако критична для сохранения клеточного белкового дисульфид/дитиолового редокс контроля [Lu and Holmgren, 2014].
Продукция активных форм кислорода (АФК) является неизбежным следствием аэробного существования живых систем. Около 90% таких АФК как супероксидный радикал, пероксид водорода, гидроксильный радикал продуцируются в качестве побочных продуктов электронно-транспортной цепи (ЭТЦ) в процессе окислительного фосфолирирования [Gonzalez-Flecha and Demple, 1995]; кроме того, возникновение АФК в клетках является следствием воздействия конкурирующих микроорганизмов и внешних окислительно-восстановительных реакций [Imlay, 2008]. На верхней части схемы отображено четырех-электронное восстановление молекулы кислорода в ЭТЦ (Рис. 1). На нижней части схемы показано последовательное присоединение по одному электрону к молекуле кислорода с образованием промежуточных продуктов -АФК - супероксидный радикал, пероксид водорода, гидроксильный радикал. В конце концов, частично восстановленные формы кислорода могут принимать четвертый электрон и совместно с двумя протонами образовывать молекулу воды.
АФК воздействуют на все биологические макромолекулы: ДНК, РНК, белки и липиды. В результате разрывов цепи ДНК и модификации азотистых оснований и углеводных остатков нарушается и полностью блокируется репликация [Sies, 1993]. Известно более 20 продуктов распада окисленной ДНК, таких как 7,8-дигидро-8-оксогуанин (8-oxo-G), 1,2-дигидро-2-оксоаденин (2-охо-А), гидроксиметилмочевина, мочевина, тиминовые гликоли, тимин и другие [Farr, 1991, Shigenaga, 1991, Dizdaroglu, 1992]. В основе повреждающего действия пероксида водорода лежит реакция прямого окисления несвязанных внутриклеточных ионов восстановленного железа, частично ассоциированных с молекулой ДНК, приводящая к образованию высокореактивного ОН- (реакция Фентона) [Imlay and Linn, 1988, Henle et al, 1999].
Механизмы защиты от окислительного стресса
Для борьбы с АФК в клетке существуют специальные механизмы, направленные на их деградацию. Благодаря этому в цитоплазме поддерживается очень низкая ( 10 8 М) стационарная концентрация АФК [Halliwell and Gutteridge, 1989]. Однако в определенных условиях возрастает скорость продукции АФК или снижаются защитные способности клеток, вследствие чего возникает окислительный стресс (ОС).
В ходе эволюции живые организмы выработали механизмы поддержания свободных радикалов на допустимом уровне, а также способы репарации окислительных повреждений. Важными компонентами защиты от действия АФК являются низкомолекулярные антиоксиданты, такие как глутатион, витамин Е, аскорбиновая и мочевая кислоты. Глутатион реагирует со всеми видами АФК, включая пероксид водорода, супероксидный радикал, гидроксильный радикал и синглетный кислород [Sies, 1997]. Реакции низкомолекулярных антиоксидантов с АФК протекают как неферментативно, так и с участием ферментов. Например, конъюгацию восстановленного глутатиона с клеточными компонентами, поврежденными АФК катализирует глутатион-S-трансфераза [Лущак, 2001].
В условиях окислительного стресса протекторное действие оказывают также алкилоксибензолы (АОБ) микробного происхождения. С одной стороны, АОБ, обладая антиоксидантними свойствами, снижают уровень АФК. С другой стороны, эти биологически активные вещества обладают способностью модифицировать структуру биополимеров, что в отношении ферментных белков приводит к повышению их активности, функциональной и операционной стабильности в широком диапазоне неоптимальных для катализа условий [Николаев с соавт., 2010].
Основными антиоксидантными ферментами в клетке являются супероксиддисмутазы и пероксидазы. У бактерий дисмутацию 02 до молекулярного кислорода и пероксида водорода катализируют две цитоплазматических супероксиддисмутазы: Fe-СОД, экспрессия которой модулируется внутриклеточным уровнем железа [Niederhoffer et al, 1990] и Mn-СОД, которая быстро синтезируется при подаче кислорода, и имеет 6 глобальных эффекторов транскрипции кодирующего ее гена sodA [Compan and Touati, 1993]. Еще одна супероксиддисмутаза (CuZn-SOD) локализована в периплазматическом пространстве [Benov and Fridovich, 1994] и активируется при переходе в стационарную фазу роста [Korshunov and Imlay, 2006].
Пероксид водорода у бактерий Е. coli разлагается двумя каталазами: HPI (hydroperoxidase I), которая особо важна при аэробном росте бактерий и кодируется геном katG под контролем регуляторного белка OxyR [Loewen et al, 1985] и HPII (hydroperoxidase II), которая индуцируется в стационарной фазе роста и кодируется геном katE под контролем os (RpoS) субъединицы РНК-полимеразы [Loewen et al, 1998].
Система репарации окислительных повреждений ДНК включает в себя эндонуклеазу IV, индуцируемую окислительным стрессом, и экзонуклеазу III, индуцируемую в стационарной фазе роста и в голодающих клетках. Оба фермента действуют на двойную цепь ДНК, гидролизуя связи на З -концах [Demple and Harrison, 1994].
Окисленные метионин и пистеин могут быть репарированы под действием метионинсульфоредуктаз и дисульфидредуктаз (тиоредоксин и глутаредоксин) [Moskovitz etal, 1995, Cabiscol etal, 2000]. 2.3. Адаптивный ответ на окислительный стресс
Адаптивный ответ бактериальных антиоксидантных систем на окислительный стресс координируется глобальными транскрипционными регуляторами SoxRS и OxyR, контролирующими экспрессию многих антиоксидантных генов. Под контролем SoxRS находится индукция экспрессии генов, отвечающих на супероксидный стресс. К их числу относятся гены sodA (кодирует Mn-SOD), nfo (кодирует эндонуклеазу IV), тагАВ (оперон множественной антибиотикоустойчивости), tolC (кодирует белок внешней мембраны), micF (кодирует антисмысловую РНК, репрессор трансляции OmpF), fpr (кодирует НАДФН-ферредоксин оксидоредуктазу), zwf (кодирует глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу), аспА (кодирует аконитазу), fumC (кодирует фумаразу С), асгАВ (кодирует помпу «drug efflux pump»), fur (железосвязывающий регуляторный белок) и другие [Pomposiello et al, 2001, Imlay, 2008].
К числу OxyR-регулируемых генов, отвечающих на повышение концентрации Н202, относятся katG (кодирует каталазу-гидропероксидазу I), ahpFC (кодирует НАДН-зависимую алкилгидропероксидредуктазу), grxA (кодирует глутаредоксин А), gor (кодирует глутатионредуктазу), dps (кодирует ДНК-защищающий белок), oxyS (кодирует регуляторную РНК) [Zheng et al, 2001]. Оба регулона могут взаимодействовать друг с другом, например, SoxRS регулон может быть активирован пероксидом водорода [Semchyshyn, 2009].
Механизм активации SoxRS регулона является двухступенчатым. Белок SoxR связывается с молекулой ДНК в специфическом сайте и активирует экспрессию гена soxS, в результате чего повышается уровень белка SoxS. SoxS, являясь вторичным транскрипционным фактором, повышает экспрессию генов SoxRS регулона [Hidalgo et al, 1997]. Активация белка SoxR происходит при его окислении супероксидом, а также NO радикалом с образованием динитрозил-железо/дитиоловых производных [Ding and Demple, 2000]. Одноэлектронное окисление/восстановление [2Fe-2S] кластера регулирует транскрипционную активность SoxR. Только окисленный белок SoxR стимулирует экспрессию гена soxS в 30 раз. Предполагают, что в клетке содержатся специфические редуктазы, поддерживающие [2Fe-2S] кластеры в восстановленном состоянии.
Белок OxyR является хорошо изученным членом семейства LysR белков-активаторов транскрипции. Аналогично SoxR, OxyR может существовать в окисленной и восстановленной формах, причем восстановленная форма связывается с промотором oxyR, обеспечивая механизм ауторегуляции, а окисленная форма способна связываться со всеми промоторами генов, подконтрольных OxyR. Окисленный OxyR активирует транскрипцию при связывании N-терминального домена с карбокси-терминальным доменом а-субъединицы РНК-полимеразы [Storz and Imlay, 1999, Lushchak, 2011]. Активация OxyR под действием перекиси водорода происходит в результате окисления остатка Cysl99 до сульфеновой кислоты (Q99-SOH). Несмотря на активную научную дискуссию [Zheng etal, 1998, Kim etal, 2002], большинство данных указывают на конденсацию остатка Cys208 с сульфеновой кислотой и образование дисульфидной связи, что приводит к выраженным конформационным изменениям в регуляторном домене OxyR [Choi et al, 2001]. Окисление белка OxyR происходит уже при концентрации пероксида водорода ЮОнМ с периодом полураспада дисульфидной связи 30 секунд. Такая сверхчувствительность белка необходима для предотвращения повреждений ДНК и ферментов при субмикромолярных концентрациях внутриклеточной перекиси [Park et al, 2005, Jang and hnlay, 2007]. Инактивация окисленного белка происходит в результате его восстановления с участием глутаредоксина 1 в присутствии глутатиона [Aslundefa/, 1999].
Ингибиторы репликации и транскрипции ДНК и РНК
Одним из важных механизмов адаптации к воздействию пониженных температур является увеличение доли короткоцепочных и ненасыщенных жирных кислот. В фосфолипидах мембран бактерий Е. coli наблюдается увеличение количества цис-вакценовой кислоты и снижение количества пальмитиновой кислоты [Marr and Ingraham, 1962]. Этот тип ответа был назван гомеовискозной адаптацией. Ключевую роль в изменении состава жирных кислот играет кодируемая fabF Р-кетоацил-АЦФ-синтаза II, которая является ответственной за элонгацию пальмитолеиновой кислоты в цис-вакценовую. Таким образом, под действием холодового шока происходит увеличение биненасыщенных фосфолипидов по сравнению с насыщенными фосфолипидами [Sinensky, 1974]. Однако не всегда холодовой стресс сопровождается изменением насыщенности и изомерии жирных кислот. В частности показано, что в соответствующим образом оптимизированной среде бактерии Е. coli могут расти при 10С, не меняя состав жирных кислот [Головлев, 2003].
Важную роль в адаптации к низким температурам, по-видимому, играет трегалоза. В условиях холодового стресса индуцируется экспрессия генов otsA (трегалозо-6-фосфат синтаза) и otsB (трегалозо-6-фосфат фосфотаза) [Phadtare and Inouye, 2004]. Предполагают, что трегалоза может участвовать в стабилизации клеточных мембран и предотвращать денатурацию и агрегацию специфичных белков при низких температурах. Еще одной функцией трегалозы in vivo может быть связывание свободных радикалов [Kandror etal, 2002].
В результате геномного анализа ответа на холодовой стресс была показана также экспрессия генов, отвечающих за транспорт и метаболизм таких Сахаров как фруктоза, глюкоза, мальтоза, рибоза, манноза и ксилоза. Однако, непосредственный защитный эффект вышеперечисленных Сахаров не выявлен, в связи с чем предполагают их участие в перестройке клеточного метаболизма к низким температурам [Phadtare and Inouye, 2004].
Неправильная укладка белков не рассматривалась ранее как основная проблема при холодовом шоке. Однако, геномный анализ клеток дикого типа Е. coli при 15С показал резкое повышение индукции генов, кодирующих белки теплового шока и молекулярные шапероны, такие как htpG, торА, торВ и ppiA, кодирующие HtpG, GroEL, GroES и пептидил-пролил-цис-трансизомеразу соответственно [Phadtare and Inouye, 2004].
Протеомный анализ физиологического ответа энтерогеморрагической кишечной палочки на снижение температуры (до 14С и 25С) и активности воды (до aw 0,985 и 0,967) выявил значительное повышение экспрессии генов, кодирующих ферменты пентозо-фосфатного пути. Наибольшую индукцию показали гены трансальдолазы А и транскетолазы В, находящиеся под позитивным контролем RpoS [Moen et ah, 2009, Kocharunchitt et ah, 2012]. Кроме того, была обнаружена активация генов биосинтеза таких аминокислот как гистидин, валин, изолейцин и триптофан [Kocharunchitt etal., 2012].
При идентификации генов, чья экспрессия повышалась при переходе от 37С к 23С у бактерии Е. coli, была обнаружена целая группа генов, отвечающая за образование биопленок [White-Ziegler etal, 2008].
Важным следствием холодового шока является практически полная остановка синтеза большинства клеточных белков и активация синтеза некоторых белков, получивших название белков холодового шока (cold shock proteins, Csp). В зависимости от степени индукции Csps Е. coli можно разделить на два класса. К первому классу относятся белки, концентрация которых при снижении температуры возрастает в 10 и более раз, ко второму - белки, индуцируемые в меньшей степени [Thieringer etal., 1998]. В первый класс входят главные белки холодового шока CspA, CspB, CspG и Cspl, которые действуют как шапероны для РНК и ДНК, а также CsdA (хеликаза), RbfA (рибосомсвязывающий фактор), NusA (белок, участвующий в терминации и антитерминации транскрипции) и PNP (рибонуклеаза) [Goldstein et al, 1990, Nakashima et al, 1996, Wang et al, 1999]. Ко второму классу относятся рекомбиназа RecA, фактор инициации трансляции IF-2, ДНК-связывающий белок нуклеоида H-NS, субъединица ДНК гиразы GyrA, молекулярные шапероны Hsc66 и HscB, пируватдегидрогеназа и дигидролипоамид-ацетил-трансфераза.
Среди главных белков холодового шока наиболее активно синтезируется CspA. В связи с обнаружением сродства этого белка к одноцепочечным ДНК и РНК предполагают, что CspA выполняет функции РНК-шаперона и отвечает за стабилизацию структуры этих молекул при пониженных температурах. CspA присутствует в клетках и при оптимальной ростовой температуре. В этих условиях его содержание зависит от фазы роста культуры: уровень максимален на ранней фазе экспоненциального роста и падает почти до нуля в поздней фазе роста. Функции при оптимальной температуре неизвестны [Скабкин, 2004].
Повышенная экспрессия главных Csps при низких температурах является необходимым условием адаптации бактерий к росту и размножению при холодовом стрессе, однако ни один из этих белков сам по себе не является критичным для выживания клеток при низких температурах.
Важно, что к индукции белков холодового шока приводит также добавление определенных ингибиторов синтеза белка, таких как хлорамфеникол, тетрациклин, эритромицин [VanBogelen and Neidhardt, 1990, Jiang etal, 1993].
Роль тиоловых редокс-систем и экспрессии антиоксидантных генов при тепловом стрессе
Суммируя представленные в этом разделе данные, следует отметить, что штаммы, несущие мутации по компонентам тиоловых редокс-систем, существенно различаются по физиолого-биохимическим свойствам как от родительского штамма, так и между собой. Особенно важным являются различия в параметрах, характеризующих антиоксидантную активность, что делает эти штаммы удобной моделью для изучения роли антиоксидантных систем при действии антибиотиков.
При изучении влияния температуры на скорость роста бактерий родительского штамма была выявлена характерная кривая с максимумом при 40С (Рис. 5). Выживаемость бактерий в интервале температур от 20С до 46С существенно не изменялась (Рис.5). Небольшое статистически достоверное повышение и понижение выживаемости бактерий наблюдали при 20С и 44С, соответственно.
При температурах, близких к оптимальным (37 и 40С), большая часть мутантов росла с меньшей скоростью, чем клетки родительского штамма (Рис. 6). Наиболее выраженное снижение удельной скорости роста (ц) наблюдалось у штаммов, мутантных по gor, trxA и gortrxB. При снижении температуры культивирования до 20С и повышении до 46С скорость роста значительно ингибировалась у всех изученных штаммов. В последнем случае наибольший эффект наблюдался у двойных мутантов gshAtrxA и gortrxB, где рост останавливался почти полностью. При 46С более высокую скорость роста, чем клетки родительского штамма, показывал мутант trxB, а при 20С - мутант gshAtrxA.
При изменении температуры культивирования для большинства изученных штаммов наблюдалась тенденция к увеличению выживаемости при снижении температуры до 20С и к ее уменьшению при 46С (Рис. 7). Примечательно, что наличие мутаций gshAtrxA и gortrxB приводило к снижению выживаемости по сравнению с родительским штаммом при всех ростовых температурах. Клетки, дефицитные по глутатиону (gshA), демонстрировали пониженную выживаемость только при 37С и 40С. Мутант trxA был более устойчив, чем родитель, при повышенных температурах.
В культурах бактерий родительского штамма изменение температуры от 37С до 42С (мягкий тепловой шок) не влияло на способность к биопленкообразованию (Рис. 8). При 44 С величина удельного биопленкообразования (SBF) возрастала в 1,7 раза по сравнению с 37С. При смещении температуры культивирования в сторону пониженных значений наблюдали усиление способности к биопленкообразованию с максимумом при температуре 24С (в 1,6 раза).
Отсутствие глутатиона в gshA мутантах существенно снижало биопленкообразование при всех тестированных температурах, кроме 46С (Рис 8). При этом полностью отсутствовали характерные для родительского штамма максимумы при 24С и 44С. Рис. 8. Удельное биопленкообразование клетками родительского штамма Е. соїіи мутанта по глутатиону в диапазоне температур 20С-46С.
Мутанты по генам gor, trxA, grxA, grxB, gshAtrxA и gortrxB проявляли повышенную способность к биопленкообразованию в диапазоне температур 30С-40С, но утрачивали характерные для родителя максимумы при 24С и 44С, за исключением gortrxB мутанта, который сохранял наибольшее значение величины SBF при 24С (Рис. 9, 11). При этой температуре мутант, делеционный по тиоредоксинредуктазе, также показывал наивысшую способность к биопленкообразованию (Рис. 10). Примечательно, что кривая зависимости удельного биопленкообразования от температуры для двойного мутанта gshAtrxA была полностью противоположна аналогичному графику для бактерий родительского штамма (Рис. 9).
Удельное биопленкообразование клетками родительского штамма Е. соїіи мутанта по тиоредоксинредуктазе в диапазоне температур 20С-46С. Рис. 11. Удельное биопленкообразование родительского штамма Е. coli и мутантов по генам gor, grxA, grxBn trxA в диапазоне температур 20С-46С.
При повышении температуры до 44 С все мутанты показывали значительное снижение накопления биопленок, по сравнению с родителем при данной температуре. При критической для роста Е. coli температуре 46С все изученные мутанты сохраняли более высокую способность к формированию биопленок, чем клетки родительского штамма.
Во всем диапазоне пониженных температур (20С - 30С) наблюдали повышение величины удельного биопленкообразования у grxB и gortrxB мутантов по сравнению с родительским штаммом.
Для всех штаммов было определено также валовое биопленкообразование (Таблица 10). Интересно отметить, что для температур 22С, 24С и 42С не были обнаружены статистически значимые корреляции между валовым и удельным биопленкообразованием.
Статистический анализ показал обратные зависимости между базовым уровнем экспрессии sodA и валовым биопленкообразованием при 20С и при 40С (г = - 0,79 и - 0,84, соответственно, Р 0,05). Также обнаружены прямые корреляции между активностями каталаз и валовым биопленкообразованием при тепловом стрессе, а именно, зависимость между валовым биопленкообразованием при 40С и активностью каталазы HPI (г = 0,7, Р 0,05), валовым биопленкообразованием при 46С и активностями гидропероксидаз HPI и НРП (г = 0,67 и 0,7, соответственно).
