Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 8
1.1. Механизмы образования активных форм кислорода и их токсическое действие на основные компоненты клетки 9
1.1.1. Пути образования и характеристика АФК 9
1.1.2. Повреждающее действие АФК на компоненты клетки 12
1.2. Механизмы адаптивного ответа микроорганизмов на окислительный стресс 16
1.2.1. Общие регуляторные механизмы адаптации микроорганизмов к стрессовым условиям 17
1.2.2. Регулоны защиты микроорганизмов от действия окислительного стресса 23
1.2.3. Механизмы защиты микроорганизмов от действия АФК 28
1.3. Полиамины и их физиологическая роль 37
1.3.1. Пути биосинтеза полиаминов 38
1.3.2. Влияние полиаминов на процессы жизнедеятельности клетки...40
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 44
2.1. Объекты исследования и условия культивирования 44
2.2. Определение активности Р-галактозидазы 46
2.3. Выделение плазмидной ДНК из клеток Escherichia coli 47
2.4. Трансформация Escherichia coli плазмидной ДНК 48
2.5. Определение степени суперспирализации ДНК 48
2.6. Определение содержания полиаминов в клетках 49
2.7. Определение активности ферментов синтеза полиаминов 50
2.8. Определение содержания свободных радикалов кислорода в клетках Е. coli 51
2.9. Определение активности глюкозо-6 фосфат дегидрогеназы 52
2.10. Определение активности фумаразы 52
2.11. Определение содержания белка 53
2.12. Определение антиоксидантных свойств полиаминов in vitro 53
2.13. Определение частоты мутаций 54
2.14. Подсчет числа живых клеток 54
2.15. Статистическая обработка данных 54
ГЛАВА 3. Полиамины как регуляторы количества свободных радикалов кислорода в клетках Escherichia coli 55
3.1. Влияние супероксидного стресса на активность ключевых ферментов синтеза полиаминов 55
3.2. Антиоксидантные свойства полиаминов in vitro 58
3.3. Антиоксидантные функции полиаминов in vivo 60
ГЛАВА 4. Роль полиаминов в регуляции экспрессии генов soxRS регулона Escherichia coli 63
4.1. Влияние полиаминов на экспрессию гена soxS в условиях супероксидного стресса 64
4.2. Влияние пониженного содержания полиаминов в клетке на уровень экспрессии soxS в условиях супероксидного стресса 68
4.3. Функции полиаминов как положительных транскрипционных модулятров экспрессии генов-мишеней SoxS 70
ГЛАВА 5. Роль полиаминов как топологических модуляторов ДНК в регуляции уровня экспрессии генов soxRS регулона 73
5.1. Влияние путресцина на топологию ДНК в условиях супероксидного стресса 74
5.2. Роль путресцина как топологического модулятора в регуляции генной экспрессии... 77
5.3. Влияние путресцина на частоту мутаций при супероксидном стрессе 80
ГЛАВА 6. Влияние полиаминов на активность адаптивных ферментов в клетках Escherichia coli 82
ГЛАВА 7. Обсуждение результатов 89
7.1. Полиамины как регуляторы количества свободных радикалов кислорода в клетках Escherichia coli 89
7.2 Роль полиаминов в регуляции экспрессии генов soxRS регулона Escherichia coli 92
7.3. Роль полиаминов как топологических модуляторов ДНК в регуляции уровня экспрессии генов soxRS регулона 98
7.4. Влияние полиаминов на активность адаптивных ферментов в клетках Escherichia coli 103
Выводы 110
Литература 111
- Повреждающее действие АФК на компоненты клетки
- Влияние супероксидного стресса на активность ключевых ферментов синтеза полиаминов
- Влияние полиаминов на экспрессию гена soxS в условиях супероксидного стресса
- Влияние путресцина на топологию ДНК в условиях супероксидного стресса
Введение к работе
Актуальность проблемы. В течение последнего десятилетие проблема окислительного стресса привлекает все большее внимание как со стороны исследователей в области фундаментальных биологических наук, так и со стороны специалистов практической медицины. Многочисленные исследования свидетельствуют о том, что окислительный стресс является непосредственной причиной возникновения различных болезней человека, в том числе злокачественных новообразований, а также процессов старения организма (Ames et al, 1993). Общность основных механизмов защиты клеток про- и эукариот от окислительного стресса делает актуальным использование микроорганизмов в качестве модели для изучения повреждающего эффекта активных форм кислорода (АФК) на клетку, а также защитных механизмов клетки от этих повреждений (Sigler et al, 1999). В то же время, изучение специфичности адаптивных реакций прокариотических клеток к действию окислительного стресса может способствовать решению проблемы лечения бактериальных инфекций (Островский Д.Н., 1997), поскольку продукция АФК фагоцитами является важным защитным механизмом, лежащим в основе неспецифического иммунитета (Storz, Imlay, 1999). Кроме того, механизм действия некоторых антибиотиков основан на индукции окислительного стресса (Goswami et al, 2006).
В настоящее время интенсивные исследования в области микробиологии и молекулярной биологии обеспечили значительный прогресс в изучении - генов и белков, участвующих в адаптации микроорганизмов к окислительному стрессу (a Demple, 1999). В то же время малоизученным остается вопрос о роли метаболических факторов, которые, как известно, принимают активное участие в адаптивных реакциях клеток на стресс, обеспечивая наиболее адекватное и экономичное приспособление клетки к условиям среды (HengeAronis et al, 1996). Среди таких факторов особый интерес представляют биогенные полиамины, поликатионная природа которых обусловливает возможность их взаимодействия с отрицательно заряженными группами
5 биополимеров клетки (Igarashi et al., 2000). Результатом таких взаимодействий является значительное влияние полиаминов на клеточные процессы как про-так и эукариот, что дает основание рассматривать их как универсальные клеточные регуляторы (Tabor et al, 1985). В последнее время появляется все больше сведений о существенной роли этих соединений в адаптации микроорганизмов к различным видам стресса (Ткаченко и др., 1997, 1998). В том числе имеется ряд публикаций о возможном участии полиаминов в защите клеток от действия АФК (Chattopadhyay et al, 2003; Jung et al, 2003). Однако в литературе лишь немногочисленные работы посвящены исследованию механизмов протекторного действия этих соединений. К их числу относятся статьи, посвященные изучению роли полиаминов в адаптации Е. coli к действию перекиси водорода (Ткаченко и др., 2001, 2003). В то же время в литературе практически отсутствуют данные о механизмах защитного действия полиаминов при окислительном стрессе, вызванном супероксидными радикалами.
Цель настоящей работы - выяснение роли полиаминов в адаптации Е. coli к условиям супероксидного стресса, индуцированного паракватом.
Основные задачи исследования:
Исследовать активность ферментов системы синтеза полиаминов в условиях супероксидного стресса.
Изучить антиоксидантные свойства полиаминов и их роль в защите клеток от действия супероксидных радикалов.
Выяснить характер и механизмы влияния полиаминов на экспрессию генов soxRS регулона.
4. Проследить топологические перестройки молекулы ДНК при
супероксидном стрессе и оценить действие полиаминов на топологию ДНК в
данных условиях.
5. Изучить влияние полиаминов на активность адаптивных ферментов,
частоту мутаций и количество жизнеспособных клеток в культурах Е. coli,
подвергнутых супероксидному стрессу.
Научная новизна и практическая значимость работы. Установлено, что в ответ на супероксидный стресс в клетках Е. coli происходит возрастание активности ключевых ферментов синтеза полиаминов и их конечных продуктов.Впервые показана способность полиаминов нейтрализовать супероксидные радикалы in vitro в системе феназинметосульфат-NADH, а также их участие в поддержании гомеостатического уровня супероксидных радикалов в клетках Е. coll. Выявлена роль полиаминов как положительных транскрипционных модуляторов экспрессии генов soxRS регулона. Установлена роль путресцина как модулятора топологического состояния в транскрипционной регуляции генов soxRS регулона. Впервые описана зависимость характера защитных функций полиаминов от силы стрессорных воздействий. Обнаружен положительный эффект путресцина на активность адаптивных ферментов в клетках Е. coli в условиях сильного стресса.
Полученные результаты расширяют представления о механизмах, лежащих в основе защитных функций полиаминов от действия активных форм кислорода.
Основные положения, выносимые на защиту.
В ответ на супероксидный стресс в клетках Е. coli индуцируется активность ферментов синтеза полиаминов, продукты которых, функционируют как антиоксиданты, нейтрализующие супероксидные радикалы.
В адаптации Е. coli к супероксидному стрессу полиамины выполняют две функции: нейтрализаторов супероксидных радикалов и положительных модуляторов генной экспрессии. Преобладание той или иной функции определяется силой стрессорного воздействия.
В условиях супероксидного стресса полиамины участвуют в регуляции топологического состояния ДНК. Модулирующая активность путресцина в отношении топологии ДНК оказывает положительное влияние на экспрессию генов soxRS регулона.
7
4. Функционирование полиаминов как положительных
транскрипционных модуляторов генов soxRS регулона способствует возрастанию в клетках Е. соН активности адаптивных ферментов и повышению жизнеспособности клеток.
Повреждающее действие АФК на компоненты клетки
Установлено, что АФК могут окислять белки различными способами. Одни аминокислоты, например лейцин, модифицируются в реакции Фентона. Другие окисляются с помощью гидропероксидного и супероксидного радикалов, и, наконец, третьи могут подвергаться действию гидроксильного и пероксидного радикалов (Sigler et al, 1999). Одной из мишеней для перекиси водорода являются SH- группы белковых молекул. Окисление сульфгидрильных групп ведет к образованию дисульфидных связей и, как следствие, к денатурации и агрегации белков (Tamarit et. al, 1998; Imlay, 2003). В результате действия гидроксильного радикала образуются карбонильные производные аминокислот (Dukan et al, 2000). Вызванные супероксидным радикалом повреждения аминокислотных остатков могут распространяться на соседние молекулы, вызывая их повреждения (Hawkins, Davies, 2001). Наиболее чувствительными к таким воздействиям являются тирозиновые и триптофановые аминокислотные остатки (Imlay, 2003).
Особенно чувствительной мишенью для окисления являются металлосвязывающие сайты и простетические группы белков (Dean et al, 1997). Эксперименты с мутантам Е. coli, у которых отсутствует цитоплазматическая супероксиддисмутаза, показали, что эти клетки не могут расти без добавки в среду культивирования никотинамида, разветвленных, ароматических и серосодержащих аминокислот а также показывают высокий уровень спонтанных мутаций и получают энергию только в процессах брожения (Carlioz, Touati 1986). Как оказалось, в основе этих нарушений лежит окислительное инактивирование ферментов группы дегидратаз, содержащих в своем активном центре [4Fe-4S] кластеры. Супероксидный радикал, взаимодействуя с молекулой фермента, приводит к разрушению активного центра и высвобождению свободного железа (Flint et al., 1993), что, в свою очередь, вызывает увеличение пула восстановленных ионов железа в клетке и может приводить к образованию гидроксильного радикала в реакции Фентона (Liochev, Fridovich., 1999). К дегидратазам относятся ферменты цикла трикарбоновых кислот аконитаза В и фумаразы А и В (Gardner, Fridovich, 1991; Liochev, Fridovich, 1993), дегидратаза дигидроксикислот, участвующая в синтезе аминокислот с разветвленными боковыми цепями (Кио et al, 1987). Показано, что помимо супероксидного радикала, прямое окисление [4Fe-4S] кластеров может осуществлять также и перекись водорода, однако это положение требует дальнейших исследований (Imlay, 2003).
Воздействуя на белки, АФК вызывают изменения конформационной структуры молекулы, которые становятся удобной мишенью для действия протеолитических ферментов (Gardner, Fridovich, 1991; Davis, 1997).
Наиболее уязвимыми к действию АФК являются нуклеиновые кислоты (Ames et al, 1992). Молекулы ДНК атакуются, в основном, гидроксильными радикалами, которые действуют как на уровне азотистых оснований, так и на уровне сахара (Newcomb et al, 1998; Storz, 1999). Взаимодействие АФК с дезоксирибозой приводит к фрагментации сахарного остатка и высвобождению азотистых оснований, вследствие чего происходят разрывы ДНК являющиеся одной из основных причин гибели клеток под действием окислительного стресса (Wang, 1998).
Идентифицировано более 20 видов повреждений азотистых оснований активными формами кислорода (Cooke et al, 2003). Окисление тимина, например, приводит к образованию тимингликолей, при распаде которых образуется мочевина (Demple, Harrison, 1994). Интересно, что в одноцепочечных образцах ДНК образование тимингликолей вызывает возрастание количества мутаций, в то время как в двухцепочечной ДНК тимингликоли и их производные оказывают сильный токсический эффект за счет того, что функционируют как сильные блокаторы репликации (Basu et al, 1989).
Цитозин-производные, образующиеся при окислительном стрессе, являются аналогами производных тимина. Кроме того, цитозингликоли могут подвергаться дезаминированию, давая урацил-производные, образующие пары с аденином, что приводит к усилению мутагенного эффекта за счет CGA транзиций (Fridberg et al, 1995).
Среди продуктов окисления пуринов известен 8-оксогуанин, который является сильным мутагеном, но не блокирует синтез ДНК (Michaels, Miller, 1992). Однако в наибольшем количестве при окислительном стрессе образуется другое гуанин-производное - 2,6-диамино-4-гидрокси-5- амидопиримидин (Fapy-G), который имеет открытое имидазольное кольцо. Он не имеет сильного мутагенного эффекта, но вызывает гибель клеток, так как ингибирует синтез ДНК (Wang, 1998; Wallace, 2002).
Таким образом, активные формы кислорода, вызывая широкий спектр повреждений различных компонентов клетки, представляют серьезную опасность для функционирования клетки. Поэтому микроорганизмы обладают достаточно сложной многоуровневой системой защиты от действия АФК, механизмы которой рассмотрены в следующем разделе.
Влияние супероксидного стресса на активность ключевых ферментов синтеза полиаминов
Среди факторов, способных вызывать окислительный стресс, чаще всего выступают активные формы кислорода, супероксидный радикал и перекись водорода, защиту от которых обеспечивают, соответственно, soxRS и oxyR регулоны (Stors, Imlay, 1999). Активные формы кислорода (АФК) образуются в аэробных организмах как побочные продукты дыхательной цепи и представляют собой потенциальный источник эндогенного окислительного стресса.
Экспериментальное воспроизведение супероксидного стресса возможно лишь при использовании нейтральных соединений, способных проникать в клетку и там генерировать супероксидные радикалы, которые, являясь носителем отрицательного заряда, сами не могут проникать через клеточные мембраны. Механизм действия этих соединений основан на одноэлектронном восстановлении молекулярного кислорода до супероксидного радикала за счет окисления редоксферментов клетки. К числу таких соединений относятся паракват, менадион, плюмбагин, феназинметасульфат и другие (Sigler et ah, 1999). Поскольку в процессе переноса электронов происходит их циклическое восстановление и окисление, эти вещества получили название редоксциклирующих соединений (Moody, Hassan, 1982). Известная способность полиаминов выступать в качестве универсальных регуляторов физиологических процессов клетки (Tabor, Tabor, 1985), а также их участие в защите клеток Е.соН от стресса, вызванного перекисью водорода (Ткаченко и др., 2001; 2003), послужили основанием для предположения о возможном участии этих соединений в адаптивных реакциях Е.соН в ответ на стресс, индуцированный супероксидными радикалами. Влияние супероксидного стресса на активность орнитиндекарбоксилазы (ОДК) и содержание путресцина в клетках различных штаммов Е. coli. 1- активность ОДК в клетках, не подвергутых стрессу; 2- активность ОДК в клетках при супероксидном стрессе; 3- возрастание внутриклеточной концентрации путресцина в стрессированных клетках в процентах по отношению к нестрессированным. Пробы взяты через 2 часа после индукции стресса. -р 0.05 относительно нестресс и ровашюй культуры (1). Для оценки вовлеченности полиаминов в адаптивный ответ клетки исследовано влияние супероксидного стресса, индуцированного добавкой параквата, на активность системы синтеза полиаминов и количество этих соединений в экспоненциально растущей культуре E.coli. Показателем интенсивности биосинтеза полиаминов в клетке принято считать активность орнитиндекарбоксилазы (ОДК), поскольку продукт ее реакции, путресцин, является предшественником для синтеза большинства клеточных полиаминов (Thomas, Thomas, 2003). Изучение активности этого фермента во всех исследованных нами штаммах E.coli показало значительную степень его индукции в ответ на супероксидный стресс, что приводило к существенному возрастанию количества путресцина в клетках (рис.1). Некоторые отличия в степени индукции между различными штаммами E.coli, по-видимому, связаны с начальным уровнем активности фермента, значения которого, в свою очередь, определяются индивидуальными особенностями штаммов (Tabor, Tabor, 1985). В отличие от других полиаминов, кадаверин не является производным путресцина и количественно не связан с его уровнем в клетке. Синтез кадаверина осуществляется независимым путем, катализируемым лизиндекарбоксилазой (Tabor, Tabor, 1985). Исследование активности этого фермента при супероксидном стрессе, как и в случае с ОДК, продемонстрировало значительную степень индукции, максимальное значение которой наблюдалось через 45 минут после добавки параквата и оставалось на этом уровне в течение всего эксперимента (рис.2). При этом пул кадаверина, который практически отсутствовал в клетках в нормальных условиях, начинал резко возрастать и на фоне высокой активности лизиндекарбоксилазы не имел тенденции к снижению. Таким образом, существенная индукция системы синтеза полиаминов в ответ на супероксидный стресс достоверно свидетельствует в пользу ее вовлеченности в стрессовый ответ, что явилось основанием для дальнейшего изучения роли полиаминов в адаптации клеток E.coli к действию супероксидных радикалов. Присутствие организма в аэробных условиях приводит к образованию АФК (Imlay, 2003). Избежать окислительного стресса в этих условиях наряду с постоянно функционирующими супероксиддисмутазой и каталазой позволяют антиоксиданты, вещества, которые непосредственно взаимодействуют с АФК, поддерживая их концентрацию в клетке на достаточно низком уровне (Sigler et al, 1999; Лущак, 2001). Некоторые исследователи склонны считать, что такими свойствами могут обладать полиамины, с чем связывают их протекторное действие при повреждении ДНК активными формами кислорода (На et al, 1998 а; Ткаченко и др., 2001; Jung et al, 2003). Кроме того, на полиаминдефицитном мутанте показано, что внесение в среду культивирования тирона, вещества, способного улавливать супероксидные радикалы, значительно улучшает ростовые характеристики данного штамма в аэробных условиях (Jung et al, 2003). Одним из наиболее распространенных приемов, позволяющих определить наличие у какого-либо соединения антиоксидантных свойств, является тестирование способности данного вещества влиять на скорость реакции восстановления нитросинего тетразолия в системе генерации супероксидных радикалов NADH-феназинметосульфат (Liu et al, 1997). Результаты исследований показали, что путресцин обладает способностью ингибировать реакцию восстановления тетразолия, препятствуя переносу электронов от супероксидного аниона на тетразолий (рис.3). При этом наблюдаемое замедление скорости реакции было прямо пропорционально концентрации добавленного в систему путресцина.
Влияние полиаминов на экспрессию гена soxS в условиях супероксидного стресса
Наличие у полиаминов свойств положительных транскрипционных модуляторов в отношении soxS в условиях умеренного и сильного супероксидного стресса поставило вопрос о существовании подобной активности у этих соединений по отношению к генам-мишеням soxRS регулона.
Данный регулон включает более 10 основных генов, продукты которых обеспечивают различные механизмы антиоксидантной защиты клетки (Stors et al, 1999). Всего же к настоящему времени описано более 100 генов, оложительно или отрицательно изменяющих экспрессию в ответ на паракват (Pomposiello et al, 2001). Снижение уровня супероксидного радикала обеспечивается за счет индуцируемой, марганецсодержащей формы супероксиддисмутазы, которая кодируется геном sodA (Fridovich, 1995). Помимо нейтрализации супероксидных радикалов, существует механизм, направленный на ограничение поступления в клетку ксенобиотиков, в том числе и редоксциклирующих агентов, способных быть источником супероксидных радикалов в цитоплазме. Сюда относится антисмысловая малая РНК (micF), функции которой связаны с подавлением трансляции мРНК пориновых белков внешней мембраны OmpF. Основной мишенью разрушительного действия супероксидных радикалов являются Fe-S кластеры ферментов-дегидратаз, поэтому в клетке функционирует ферредоксинредуктазная система (fpr), функции которой, как считают, направлены на поддержание восстановленного состояния Fe-S кластеров (Hidalgo et al, 1996; Storz et al, 1999). Кроме того, дополнительно синтезируются устойчивые к действию супероксидных радикалов изоформы данных ферментов, в частности фумараза С (fumC) и аконитаза (аспА). Репарирующие функции клетки при супероксидном стрессе обеспечиваются эндонуклеазой IV (nfo), участвующей в восстановлении ДНК, поврежденной активными формами кислорода.
В данной серии экспериментов были использованы штаммы Е. coli, несущие однокопийные хромосомные генные слияния промоторной области исследуемого гена с беспромоторной частью структурного гена lacZ. В наибольшем количестве в клетках Е. coli содержится путресцин, который претерпевает наиболее значительные изменения в клетке и среде при изменении условий роста (Tabor, Tabor, 1985). Поэтому дальнейшие наши исследования были посвящены изучению роли этого представителя полиаминов.
Исследование уровней индукции генов soxRS регулона при сильном супероксидном стрессе показало их значительное возрастание в присутствии экзогенно добавленного путресцина, причем степень стимуляции колебалась у разных генов (рис. 11). Наименьший стимулирующий эффект (40-50%) наблюдался в отношении гена sodA, индукция которого в условиях стресса также была незначительная. По - видимому, это связано с изначально высоким уровнем экспрессии данного гена (1300-1500 ед. Миллера), что обусловлено постоянным образованием супероксидного радикала в клетке как побочного продукта работы дыхательной цепи ( Messner et ml, 1999). Иная картина имела место в отношении генов nfo wfpr\ исходно низкий уровень экспрессии которых (200-400 ед. Миллера) индуцировался при супероксидном стрессе также незначительно, однако степень стимуляции путресцином достигала своих наивысших значений, порядка 120-130%. Промежуточный по величине эффект путресцина наблюдался в отношении %/шиС и micF.
Таким образом, в условиях сильного супероксидного стресса путресцин оказывает положительное влияние на уровень экспрессии генов-мишеней soxRS регулона, при этом разные гены дифференцированно реагируют на путресцин, что свидетельствует об участии полиаминов как транскрипционных модуляторов в тонкой настройке стрессового ответа клетки на генетическом уровне.
Следовательно, в условиях супероксидного стресса влияние полиаминов на генную экспрессию обусловлено, как минимум, двумя механизмами, преобладание которых зависит от силы стрессорных воздействий. В условиях слабого стресса, когда преобладают функции улавливания супероксидных радикалов, данные соединения вызывают снижение уровня экспрессии soxS, максимальный эффект в данных условиях оказывает спермидин. При сильном стрессе спермидин и путресцин, в отличие от кадаверина, стимулируют экспрессию soxS, что свидетельствует о преобладании в данных условиях свойств положительных транскрипционных модуляторов. Двойственность адаптивных функций полиаминов при окислительном стрессе подтверждается экспериментами с использованием ингибитора их синтеза, ДАБ. Дифференцированное влияние путресцина как транскрипционного регулятора на гены- мишени soxRS регулона, свидетельствуют об участии полиаминов в тонкой настройке стрессового ответа клетки на генетическом уровне.
Влияние путресцина на топологию ДНК в условиях супероксидного стресса
Многообразие структурных и метаболических функций, выполняемых полиаминами в процессе жизнедеятельности клеток (Abraham, Pihl, 1981; Kumar, 1997) послужило основанием для предположения об участии данных соединений в процессе адаптации клеток к стрессовым ситуациям. Исследования роли полиаминов в адаптации Е. coli к изменяющимся условиям среды подтвердили вовлеченность полиаминов в стрессовый ответ клетки на тепловой, осмотический и другие виды стрессовых воздействий (Ткаченко и др. 1997,1998,2001).
На возможные функции полиаминов в стрессовой адаптации к окислительному стрессу указывают ранее полученные сведения о повышенной чувствительности мутантов E.coli с нарушенным синтезом полиаминов к воздействию параквата (Minton et al, 1990). О подобной роли полиаминов в растительных организмах свидетельствовали также данные о том, что в клетках растений, устойчивых к действию параквата, уровень полиаминов (в первую очередь путресцина) значительно выше, по сравнению с растениями, чувствительными к параквату (Rach et al, 2000). Эти сведения, а также полное отсутствие данных о механизмах защитного действия полиаминов при окислительном стрессе, вызванном супероксидными радикалами, послужили основанием для проведения исследований по теме диссертации.
Начало исследований было посвящено выяснению вопроса о степени вовлеченности полиаминов в адаптивный ответ на супероксидный стресс. С этой целью изучено изменение активности ключевых ферментов синтеза полиаминов в этих условиях. Показанная нами значительная индукция ферментов синтеза полиаминов, орнитиндекарбоксилазы и лизиндекарбоксилазы, и, соответственно, возрастание количества их продуктов в клетках в ответ на добавку параквата к культуре E.coli (рис. 1, 2) достоверно подтверждают участие полиаминов в адаптивных реакциях клетки к супероксидному стрессу. Известно, что в условиях аэробного роста при функционировании дыхательной цепи в клетках E.coli происходит постоянное образование активных форм кислорода как результат побочных реакций химического одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода на уровне флавинсодержащих переносчиков (Messner, Imlay, 1999). В ответ на постоянное присутствие активных форм кислорода в клетках непрерывно функционируют системы антиоксидантной защиты, осуществляющие гомеостатический контроль уровня свободных радикалов в клетке (Halliwell, Gutteridge, 1995). Это, прежде всего, антиоксидантные ферменты супероксиддисмутаза, которая катализирует восстановление супероксиданионов до перекиси водорода (Fridovich, 1995) и гидропероксидазы I и II, восстанавливающие перекись водорода до воды и молекулярного кислорода (Loewen et al., 1994; Zheng et ah, 2001; Altuvia et al., 1997). Помимо антиоксидантных ферментов, существенную роль в защите клетки от активных форм кислорода играют так называемые «ловушки» свободных радикалов, такие как глутатион, который нейтрализует гидроксильные радикалы и синглентный кислород (Halliwell, Gutteridge, 1995; Grand, Dawes, 1996), белки, содержащие метиониновые и тирозиновые аминокислотные остатки (Lupo et al, 1997) и сравнительно недавно описанная аконитазная система улавливания супероксидных радикалов (Tang et al, 2002). Нарушение антиоксидантного баланса в клетках, которое может возникнуть не только в результате внешнего воздействия, но и в результате нарушения в работе самой антиоксидантной системы ведет к накоплению АФК в клетках и развитию окислительного стресса (Sies 1993). Существенное содержание полиаминов, в первую очередь путресцина, в клетках E.coli даже в обычном, не подвергнутом стрессу, состоянии свидетельствует о возможной их роли в регуляции внутриклеточного уровня свободных радикалов. Обоснованность изучения функции полиаминов как ловушки свободных радикалов подтверждается показанными ранее качественными различиями в интенсивности флуоресценции клеток E.coli дикого штамма и полиаминзависимого мутанта, обработанных флуоресцентным красителем, чувствительным к свободным радикалам (Jung et ah, 2003). Показанная нами в экспериментах in vitro, способность полиаминов ингибировать реакцию восстановления тетразолия, препятствуя переносу электронов от супероксидного аниона на тетразолии, доказывает наличие у этих соединений способности нейтрализовать свободные радикалы супероксида (рис. 3, 4). Возможность взаимодействия полиаминов с активными формами кислорода, в частности с гидроксильными радикалами, связывают с наличием у этих соединений аминогрупп.(На et ah, 1998а). Эти данные хорошо согласуются с результатами наших исследований (рис. 4), а различия антиоксидантных способностей полиаминов, по-видимому, обусловлены количеством содержащихся аминогрупп. Поэтому спермидин, имеющий три таких группы обладает более выраженные антиоксидантные свойствами, тогда как кадаверин и путресцин, имеющие в своем составе по две аминогруппы, проявляли практически равные антиоксидантные возможности.
Способность полиаминов нейтрализовать свободные супероксидные радикалы in vivo в условиях нормального аэробного роста показана в экспериментах с использованием ингибитора орнитиндекарбоксилазы ДАБ (рис. 5). Повышенный уровень экспрессии soxS в условиях дефицита полиаминов свидетельствует о возрастании в клетках количества супероксидных радикалов, а снижение экспрессии soxS до исходного уровня при добавке путресцина подтверждает его способность регулировать количество супероксидных радикалов в клетках E.coli. Зависимость уровня экспрессии soxS от содержания полиаминов в клетках также свидетельствует о функционировании данных соединений как антиоксидантов в условиях аэробного роста (рис. 5).
Определение содержания свободных радикалов в интактных клетках E.coli и в клетках с пониженным содержанием полиаминов, обработанных ДАБ, показало возрастание количества АФК в последних (рис. 6). Эти данные хорошо согласуются с возрастанием экспрессии soxS при снижении уровня полиаминов в клетках и доказывают участие полиаминов в регуляции количества супероксидных радикалов в клетках E.coli в условиях нормального аэробного роста.
Таким образом, индукция системы синтеза полиаминов в ответ на супероксидный стресс и возрастание содержания этих поликатионов в клетках E.coli достоверно свидетельствуют об их вовлеченности в стрессовый ответ клетки. В условиях нормального аэробного роста полиамины, наряду с другими системами антиоксидантной защиты, участвуют в регуляции количества активных форм кислорода, в частности супероксидных радикалов, в клетке.
