Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Ответ бактерий Escherichia coli на температурные стрессы 11
1.1. Влияние температуры на рост и развитие микроорганизмов 11
1.2. Ответ бактерий Е. coli на тепловой шок
1.2.1. Влияние теплового шока на структуру и функции мембран 14
1.2.2. Влияние теплового шока на ДНК 15
1.2.3. Белки теплового шока: характеристика и функции 16
1.2.4. Регуляция ответа на тепловой шок у Е. coli 1.3. Ответ на тепловой шок у других микроорганизмов 23
1.4. Ответ Е. coli на холодовой шок 24
1.5. Ответ Е. coli на воздействие этанолом 26
Глава 2. Ответ Е. coli на окислительный стресс 27
2.1. Реактивные формы кислорода и их токсическое действие на живые клетки 27
2.2. Регуляция ответа Е. coli на окислительный стресс 2.2.1. Ответ на действие перекиси водорода, роль oxyR регулона 31
2.2.2. Роль rpoS (katF) регулона в защите клеток от окислительного стресса 32
2.2.3. Ответ на действие генераторов супероксид аниона, роль soxRS регулона 33
2.3. Роль глутатиона в ответе Е. coli на окислительный стресс 35
2.3.1. Клеточные функции глутатиона 35
2.3.2. Ферменты биосинтеза глутатиона 39
2.3.3. Глутатионоксидоредуктаза 40
2.3.4. у-Глутамилтранспептидаза. 41
2.3.5. Глутатион-8-трансфераза .43
2.4. Проявление признаков, характерных для окислительного стресса, при тепловом шоке клеток разных типов 43
Глава 3. Объекты и методы исследований 45
3.1. Бактериальные штаммы 45
3.2. Питательная среда и условия культивирования 47
3.3. Определение содержания белковых и небелковых тиолов 48
3.4. Определение содержания внутриклеточного глутатиона 49
3.5. Определение активности глутатионредуктазы 51
3.6. Определение активности каталазы 53
3.7. Определение активности Р-галактозидазы 56
3.8. Определение содержания ионов калия в клетке 56
3.9. Определение содержания белка 58
3.10. Статистическая обработка данных 58
Глава 4. Роль антиоксидантных систем в отклике бактерий Е. coli на тепловой шок 60
4.1. Влияние теплового шока на рост Е. coli, несущих мутации в антиоксидантных генах... 60
4.2. Влияние теплового шока на активность антиоксидантных систем 62
4.2.1. Экспрессия генов katG и katE и активность каталазы 63
4.2.2. Экспрессия генов sodA и soxS 67
4.2.3. Уровни внутри- и внеклеточного глутатиона 71
4.2.4. Экспрессия гена gor и активность глутатионредуктазы 78
4.3. Влияние обработки этанолом на рост, уровни небелковых тиолов и калия у Е. coli, несущих мутации в антиоксидантных генах 81
Глава 5. Роль антиоксидантных систем в отклике бактерий Е. coli на холодовой шок 87
5.1. Влияние холодового шока на рост Е. coli, несущих мутации в антиоксидантных генах 87
5.2. Влияние холодового шока на активность антиоксидантных систем 89
5.2.1. Экспрессия генов katG и katE и активность каталазы 89
5.2.2. Экспрессия генов sodA и soxS 93
5.2.3. Уровни внутри- и внеклеточного глутатиона 96
5.2.4. Экспрессия гена gor и активность глутатионредуктазы 100
Заключение 103
Выводы 110
Список литературы 1
- Ответ бактерий Е. coli на тепловой шок
- Роль rpoS (katF) регулона в защите клеток от окислительного стресса
- Определение активности глутатионредуктазы
- Экспрессия гена gor и активность глутатионредуктазы
Ответ бактерий Е. coli на тепловой шок
Из всех физических факторов, влияющих на рост и выживаемость микроорганизмов, наиболее важная роль принадлежит температуре. В период роста культуры на благоприятной среде скорость роста мало зависит от небольших изменений в составе среды, но определяется некоторыми лимитирующими скорость процессами, ответственными за синтез вновь образующегося клеточного вещества и зависящими от температуры.
В довольно узком интервале температур наблюдается линейная зависимость логарифма скорости роста микроорганизмов от обратных величин абсолютной температуры (зависимость Аррениуса). У большинства бактерий температурный коэффициент скорости роста (Q10) в этом интервале близок к 2; иными словами, при увеличении температуры на 10С скорость роста клеток удваивается. Г. Вильсоном (1922) было показано, что истинная скорость роста числа жизнеспособных клеток не совпадает с общей скоростью роста культуры, так как некоторые клетки утрачивают способность к росту, хотя и остаются в культуре в неизменном виде. В пределах температуры 15-25 изменение скорости истинного роста числа жизнеспособных клеток очень сходно с кривой общего роста. При температурах выше 25 скорость истинного роста падает за счет образования нежизнеспособных клеток, поскольку общая скорость образования клеток продолжает возрастать, по крайней мере, до 40. Между 40 и 50 истинная скорость роста числа жизнеспособных клеток остается близкой к нулю, выше 50 происходит ее быстрое падение за счет непосредственной гибели нерастущих клеток (Wilson, 1922).
Влияние повышения температуры на биохимическую реакцию выражается в увеличении ее скорости, следовательно, все скорости процессов, связанных с ростом клетки, обнаруживают с повышением температуры тенденцию к ускорению. Но, с другой стороны, с повышением температуры нарастает дезорганизующее или денатурирующее влияние термического воздействия. Температурные коэффициенты процессов денатурации зависят от степени сложности веществ, на которые оказывается это действие. По мере повышения температуры дезорганизующее действие термического фактора будет постоянно превышать его влияние на общую скорость воспроизведения.
При понижении температуры наблюдается замедление скорости роста культуры за счет снижения скорости роста клеток, снижения скорости химических реакций. Показано, чтобы добиться удвоения клеток при температуре 8 Е. coli необходимо выращивать 41 час, а при оптимальной температуре достаточно 21 минуты. В случае остановки роста культуры при низкой температуре происходит прекращение деления клеток, и утрата ими жизнеспособности (Карасевич, 1975).
Моно (1942, цитир. по кн. «Физиология бактерий», 1954) показал, что при оптимальных условиях роста общий выход биомассы Е. coli пропорционален количеству вещества, являющегося источником углерода, в то время как скорость роста остается без изменения при значительных колебаниях концентрации последнего. Биомасса незначительно изменяется при изменении температуры в пределах низких значений, но начинает быстро снижаться с приближением к 40. У Е. coli, как и у многих других бактерий, существенное снижение выхода биомассы происходит при температуре выше 42С (Nichols, James, 1981).
Необходимо отметить, что резкие колебания температуры (температурный шок) оказывают гораздо более неблагоприятное влияние на клетки, чем постепенное изменение температуры или постоянное воздействие пониженных или повышенных температур. Так внезапное понижение температуры от 37 до 0С вызывало гибель клеток, которая была тем больше, чем быстрее шел предшествующий рост культуры. После холодового шока от 30 до 10-15С культура при возвращении в прежние условия обнаруживает склонность к синхронному росту (Fitz-James, 1968). Следует отметить, что растущая культура не гомогенна в своих реакциях на температуру в связи с вариациями индивидуальных клеток. Наиболее чувствительны к изменениям температуры делящиеся клетки. Кроме того, культура в целом обнаруживает регулярные периодические изменения в реакциях, происходящие с более или менее постоянной частотой (Гельман и др., 1972).
Известны многочисленные данные о том, что предварительное воздействие низкими температурами в течение нескольких часов приводит к повышению выживаемости бактерий после замораживания. Это явление наблюдалось у Bacillus subtilis, Е. coli, Lactococcus lactis и Enterococcus faecalis (Panoff et al, 1998) и получило название криотолерантности. Было показано, что при понижении температуры происходят адаптивные изменения в мембранах бактерий, синтезируются белки холодового шока (Panoff al., 1998). У бактерий можно индуцировать и термотолерантность, т.е. способность клеток приобретать устойчивость к повышению температуры в результате предварительной термальной обработки или воздействием этанолом (Логинова и др., 1973; Gerner, Schneider, 1975; Li, Hahn, 1978; Spiro et al, 1982). Были предложены несколько механизмов развития термотолерантности, включающие изменения в клеточных мембранах (Yatvin, 1977), синтез защитных соединений, таких как полиолы (Henle et al., 1982) и синтез белков теплового шока (Li, Webb, 1982; Hahn, Li, 1982).
Выделены группы бактерий (психрофилы), которые адаптированы к жизни при низких температурах. Максимальной скорости их рост достигает при температурах ниже 20С, хотя их рост вообще возможен в пределах от точки замерзания до 30С. Психрофильные бактерии представлены некоторыми морскими светящимися бактериями и железобактериями. К мезофилам относят бактерий с температурным оптимумом от 20 до 42С. В эту большую группу микроорганизмов входит и Е. coli. К группе термофильных, относят бактерий, способных расти при высоких температурах порядка 70 и даже выше (Bacillus stearothermophilus, Methylococcus capsulatus) (Шлегель, 1987; Мирошниченко и др., 1998).
Изменение температуры у бактерий до экстремальных значений вызывает изменение практически всех клеточных компонентов, включая белки, нуклеиновые кислоты и липиды (Rho et ah, 1972). Ниже эти эффекты рассмотрены более детально.
Роль rpoS (katF) регулона в защите клеток от окислительного стресса
В настоящее время хорошо установлена важная роль белков теплового шока в жизнедеятельности клеток всех типов. Первичная структура большинства белков теплового шока весьма консервативна и существенно не различается у клеток, относящихся к эволюционно далеким организмам (Евстигнеева и др., 2001). Так белок DnaK Е. coli гомологичен эукариотическим белкам из семейства HSP70 (Bardwell, Craig, 1984); GroEL -эукариотическим митохондриальным HSP60 (McMullin, Hallberg, 1988); HptG - гомолог эукариотического HSP83 (Bardwell, Craig, 1984). Исходя из этого, предполагается, что белки теплового шока выполняют сходные функции во всех организмах, включенные в механизм физиологического ответа на клеточном уровне на внешние воздействия, как при экстремальных воздействиях, так и в условиях нормального роста и развития. Многочисленные данные свидетельствуют о том, что белки теплового шока синтезируются не только при тепловом шоке, но также при многих других стрессах: при действии этанола, окислительном стрессе при голодании и переходе в стационарную фазу (VanBogelen et al., 1987; Jenkins et al, 1988).
Было показано, что при высокой температуре белки теплового шока Е. coli составляют главную фракцию клеточных белков (около 20 %). Так ключевые белки теплового шока GroEL и GroES, необходимые в больших количествах для роста бактерий при всех температурах (Fayet et al, 1989), составляют около 1 % от всех клеточных белков при 30С и 12 % - при 46С (Herendeen et al, 1979). Другой белок теплового шока DnaK при 46С составляет около 4 % от всех клеточных белков. Скорость синтеза GroEL при 46С (максимальная температура, при которой Е. coli сохраняет способность к росту) в 10 раз выше, чем при 30С. В то же время, скорость синтеза белков теплового шока при температуре ниже 30С остается относительно постоянной.
Белки теплового шока являются составной частью клеточного механизма, обеспечивающего правильное сворачивание и сборку полипептидов, их деградацию и репарацию (Morimoto et ah, 1994). Эти белки относят к классу шаперонов (Georgopoulos, Welch, 1993). В настоящее время идентифицированы около 31 гена теплового шока. Большая часть белков теплового шока, кодируемых этими генами, распределяют в две группы: шапероны и АТФ-зависимые протеазы. Наиболее изучены шапероны - DnaK (шаперон), DnaJ и GrpE (кошапероны), которые формируют DnaK шаперонный механизм, и GroEL (шаперонин) и GroES (кошаперонин), которые составляют GroE шаперонный механизм (Georgopoulos, Welch, 1993). Деградацию белков осуществляет одна из протеаз: ClpXP, ClpAP, Lon, ClpB, FtsH, HtrC. Детали протеолиза до конца еще не изучены.
DnaK - белок с м.в. 70 кДа, подобно другим членам семейства HSP70, состоит из консервативного N-концевого домена, который проявляет слабую АТФ-азную активность, и пептидсвязывающего домена, который примыкает к АТФ-азному домену, и имеет С-конец. АТФ-азный и пептидсвязывающий домены DnaK функционально связаны. Взаимодействие АТФ с N-концевым доменом DnaK индуцирует конформационные изменения в пептидсвязывающем домене и ведет к освобождению пептида. Связывание пептида с С- доменом DnaK вызывает конформационные изменения N-терминального домена и стимулирует его АТФ-азную активность (Flynn et ai, 1989; Jordan, McMacken, 1995). DnaK имеет высокое сродство к гидрофобным пептидам (Gragerov et al., 1994). Обычно, гидрофобные участки белков спрятаны внутри структуры. У денатурированных белков или у вновь синтезированных полипептидов открытые гидрофобные регионы могут стать мишенью для связывания с HSP70. Таким образом, белки могут быть защищены от образования агрегатов (Frydman et ah, 1994). Шаперонный комплекс GroE имеет кольцевую организацию обоих белковых компонентов GroEL и кофактора GroES, ответственного за регулирование АТФ-азной активности GroEL и усиление связывающей способности при неблагоприятных условиях. GroES представляет собой простое семичленное кольцо, a GroEL состоит из двух колец (по 7 субъединиц в каждом) с выраженной центральной полостью. Стабильное взаимодействие наблюдается в присутствии АДФ или АТФ, что позволяет предположить, что осуществляется АТФ-азный гидролиз GroEL. С GroEL одновременно могут связываться одно или два кольца GroES (Llorea et al, 1994). Денатурированные белки связываются с GroEL около входа в центральную полость (Langer et al, 1992). Полагают, что различие между нативными и ненативными белками основано на взаимодействии гидрофобных остатков, расположенных на поверхности связывающихся интермедиатов, и гидрофобных остатков, расположенных у входа в центральную полость (Fenton et al, 1994; Chen et al, 1994). Освобождение GroE-связанных белков осуществляется в присутствии АТФ или комплекса GroES/АТФ. GroES повышает эффективность реакции освобождения (Todd et al., 1994). Для многих белков однократное связывание и освобождение оказываются недостаточным для правильного свертывания и, поэтому процесс связывание-освобождение повторяется многократно, до тех пор, пока белки не перестанут связываться с GroEL (Todd et al, 1994; Weissman et al, 1994). Связывание с GroEL может приводить к частичному развертыванию неправильно свернутых белков так что после освобождения эти молекулы имеют больше шансов на быстрое и правильное скручивание (Todd et al, 1994; Weissman et al, 1994; Ranson et al, 1995). GroEL может взаимодействовать с белками на различных стадиях свертывания от ранних интермедиатов, лишенных внутренней стабильности, до поздних, достаточно стабильных. В то время как ранние интермедиаты могут подвергаться раскручиванию при взаимодействии с GroEL, поздние интермедиаты - нет (Lilie, Buchner, 1995).
Определение активности глутатионредуктазы
Чтобы выяснить вклад антиоксидантных систем в ответе Е. coli на тепловой шок, измеряли удельную скорость роста бактерий, несущих мутации в генах, контролирующих различные компоненты этих систем. Клетки UM202 содержат мутацию в гене katG, ведущую к потере активности каталазы HPI (Triggs-Raine, Loewen, 1987). Ген katG является членом регулона, индуцируемого перекисью водорода и контролируемого геном oxyR. Кроме того, Разрегулируется S-38 фактором, концентрация которого увеличивается при переходе в стационарную фазу (Eisenstark et ah, 1996).
Тепловой шок снижал скорость роста как мутантов, так и клеток родительского типа MP 180 {katG +), но ингибирующее действие теплового шока было более выражено у мутантов katG (рис. 7).
Чтобы оценить роль глутатиона в устойчивости Е. coli к тепловому шоку, использовали штаммы JTG10 и 821, дефицитные по синтезу GSH вследствие мутации в гене gshA. Обнаружено, что мутанты были более устойчивы к тепловому шоку, чем клетки родительского типа АВ1157 (gshA+) (рис. 7).При этом штамм 821 казался значительно устойчивее к действию теплового шока по сравнению с JTG10. Ранее было показано, что клетки Е. coli 821 были более устойчивы к действию менадиона, куменгидропероксида и N-этилмалеимида (NEM) (Смирнова и др., 1999). Было высказано предположение, что повышенная устойчивость 821 штамма не связана с мутацией в gsh локусе. Возможной причиной повышенной устойчивости Е. coli 821 может быть наличие в клетках кроме мутаций gsh еще одной или нескольких мутаций в других локусах (Смирнова и др., 1999). Следует учесть,
Действие теплового шока 30—»45С на растущие аэробные клетки Е. coli. Высота столбиков соответствует удельной скорости роста (ц) после теплового шока в процентах от значения при 30С. wt — Е. coli дикого типа; gsh - мутанты, дефицитные по синтезу глутатиона (GSH); katG - клетки, несущие мутации в гене, кодирующем каталазу HPI; sodAB - клетки, несущие мутации в генах, кодирующих синтез супероксиддисмутаз А и В; soxR - клетки с мутацией в гене, контролирующем ответ Е. coli на действие генераторов супероксид аниона. что штамм E.coli 821 был выделен селекцией клеток АВ1157, обработанных №метил-г\[ -нитро-г\[-нитрозогуанидином (MNNG) (Apontoweil, Berends, 1975а). Штамм Е. coli JTG10 был получен совершенно иным способом, а именно, в результате трансдукции мутации gshAy.TnlOkm в АВ1157 с помощью бактериофага PI (Greenberg, Demple, 1986). В последнем случае вероятность появления других мутаций резко снижается.
Штамм QC909 является sodAsodB двойным мутантом, лишенным активности супероксиддисмутаз Mn-СОД и Fe-СОД (Carlioz, Touati, 1986). Не выявлено статистически значимых различий в действии теплового шока на рост клеток QC909 и клеток родительского типа GC4468 (рис. 7).
В работе исследовался также ответ на стрессы клеток Е. coli JHC1092, несущих мутацию в регуляторном гене soxR, который является частью двухгенной системы soxRS, контролирующей ответ аэробных клеток Е. coli на действие генераторов 0{ (Greenberg, Demple В, 1988). sodA - один из генов, в регуляции которого, принимает участие soxRS. Не выявлено статистически значимой разницы в ответе JHC1092 (soxR ) и его родительского штамма GC4468 (soxR+) на тепловой шок (рис. 7).
Влияние теплового шока на активность антиоксидантных систем
Для слежения за экспрессией генов, кодирующих компоненты антиоксидантных систем, были использованы штаммы Е. coli, несущие слияния промоторов генов katG, katE, sodA, soxS и gor с опероном гена lacZ (смотри раздел 3.1), структурного гена (3-галактозидазы. Продукты генов katG, sodA и soxS генов были названы выше. Ген katE кодирует синтез каталазы HPII. katE находится под контролем 5-38 фактора, (кодируемого katF(rpoS)) и активируется в стационарной фазе и при голодании по углероду (Loewen, 1992). Ген gor кодирует синтез глутатионредуктазы (GOR, ЕС 1.6.4.2), катализирующей восстановление окисленной формы глутатиона (GSSG). Ген gor находится под контролем OxyR регулона во время логарифмического роста и дополнительно под контролем 8-38 фактора (Eisenstark et ah, 1996).
Экспрессия генов katG и katE и активность катал азы
В процессе роста при 30С экспрессия katG-lacZ повышалась на 20 % от начального уровня. Тепловой шок (30-»45С) вызывал снижение экспрессии katG-lacZ в 2,5 раза по сравнению с тем уровнем, который наблюдался при 30С (рис. 8). В культуре, адаптированной к росту при 42С, начальный уровень экспрессии katG-lacZ оказался в 2.5 раза ниже, по сравнению с тем уровнем, который наблюдался при 30С. Однако через 80 минут культивирования при 42С экспрессия katG-lacZ повышалась в 4 раза по сравнению с исходным уровнем, превышая в 2 раза уровень экспрессии, наблюдаемый при 30С (рис. 8).
Подобным же образом изменялась экспрессия katE-lacZ (рис. 9). В процессе роста при 30С экспрессия katE-lacZ повышалась на 20 % от начального уровня. Тепловой шок вызывал снижение экспрессии katE-lacZ в 4 раза по сравнению с тем уровнем, который наблюдался при 30С. В культуре, адаптированной к росту при 42С, начальный уровень экспрессии katE-lacZ был на 40 % ниже, чем при 30С в это же время. Однако, в процессе роста при 42С экспрессия katE-lacZ повышалась в 2.4 раза по сравнению с исходным уровнем (рис. 9).
Экспрессия гена gor и активность глутатионредуктазы
Для исследования роли антиоксидатных систем при температурном шоке Е. coli нами были изучены три антиоксидатные системы, которыми обладают эти бактерии. В первую очередь это каталазы (HPI и НРИ), участвующие в деградации перекиси водорода; супероксиддисмутазы (Mn-СОД и Fe-СОД), катализирующие дисмутацию супероксидного аниона, и глутатион. У бактерий в репарации повреждений ДНК участвует также система, называемая SOS-ответом, но в нашей работе роль этой системы в ответе на температурный шок не изучалась.
Одним из признаков окислительного стресса у таких бактерий как Е. coli считается индукция генов, откликающихся на повышение внутриклеточной концентрации оксидантов, и, соответственно, повышение активности антиоксидантных ферментов, кодируемых этими генами (Farr, Kogoma, 1991; Demple, 1991). В наших условиях не отмечалось повышения активности указанных компонентов антиоксидантной защиты в ответ на тепловой шок, скорее, наоборот, наблюдалось их ингибирование. В то же время, пониженная устойчивость к тепловому шоку мутантов, дефицитных по каталазе HPI, может указывать на то, что повышение уровня активных форм кислорода, в частности, Н2О2, может иметь место при тепловом шоке растущих клеток Е. coli. Представляется возможным, что явления, характерные для окислительного стресса при внезапном тепловом шоке Е. coli, связаны не только с увеличением продукции АФК как прямого результата повышения температуры, но и с ингибированием активности компонентов антиоксидантной защиты.
Исследования на эукариотических клетках показали, что глутатион, участие которого в антиоксидантной защите клеток эукариот твердо установлено, может принимать участие и в ответе клеток на тепловой шок. Повышение уровня внутриклеточного глутатиона в ответ на тепловой шок рассматривается как одно из доказательств причастности глутатиона к терморезистентности эукариотических клеток (Mitchell, Russo, 1983). Об этом свидетельствует также повышенная чувствительность к тепловому шоку клеток, предварительно обработанных реагентами, снижающими концентрацию внутриклеточного глутатиона (Mitchell, Russo, 1983). Менее изученной является роль глутатиона в защите бактериальных клеток от теплового стресса. В настоящей работе показано, что у бактерий Е. coli тепловой шок приводил к снижению внутриклеточного глутатиона и соотношения GSHin/GSSGin, а дефицит глутатиона не повышал чувствительности клеток к тепловому стрессу. Это указывает на то, что в эукариотических клетках и у бактерий Е. coli поведение и роль глутатиона в ответе на тепловой шок существенно различаются.
Могут ли наблюдаемые при тепловом шоке Е. coli изменения в статусе внутриклеточного глутатиона свидетельствовать о наличии в этой ситуации окислительного стресса? Ранее были подробно исследованы изменения в поведении глутатиона при действии экзогенных оксидантов на растущие клетки Е. coli (Smirnova et al., 2000). Сравнительный анализ показывает, что изменения в статусе глутатиона при тепловом шоке Е. coli, обнаруженные в нашей работе, в наибольшей степени схожи с теми, которые наблюдались при действии перекиси водорода на клетки, дефицитные по каталазе HPI, и при действии менадиона на клетки, дефицитные по супероксиддисмутазе (Smirnova et al., 2000). На первый взгляд, это должно указывать на наличие окислительного стресса при тепловом шоке, поскольку в клетках дикого типа тепловой шок ингибировал экспрессию генов, кодирующих активность именно этих ферментов, и фенотипы мутантов katG и sodA и клеток дикого типа при действии теплового шока могут быть близки. Однако ситуация выглядит более сложной, если рассматривать изменения статуса глутатиона при , тепловом шоке как внутри клеток, так и снаружи. Данные, представленные на рис. 14, показывают, что тепловой шок сопровождался значительным увеличением экстраклеточного глутатиона, и убыль значительной части внутриклеточного глутатиона могла быть следствием его экспорта наружу. Примечательно также, что тепловой шок не приводил к увеличению уровня GSSG внутри клеток, а увеличение экстраклеточного глутатиона происходило, главным образом, за счет GSH. Эти данные затрудняют возможность объяснения снижения внутриклеточного глутатиона при тепловом шоке как результата прямого окисления глутатиона эндогенными оксидантами.
Ранее было показано, что в отличие от клеток эукариот у Е. coli глутатион не является существенным компонентом антиоксидантной защиты от перекиси водорода и соединений, генерирующих супероксид анион (Greenberg, Demple, 1986; Смирнова и др., 1999). Более того, присутствие глутатиона у этих бактерий оказывает ингибирующее действие на экспрессию soxS, индуцируемую паракватом (Ding, Demple, 1996) и экспрессию katG, индуцируемую перекисью водорода (Смирнова и др., 1997). Эти данные дают одно из возможных объяснений положительного эффекта мутации gshA на устойчивость Е. coli к тепловому шоку. Клетки gshA, дефицитные по синтезу GSH, потенциально имеют более высокую способность к индукции каталазной активности, и это может быть одной из причин их повышенной устойчивости к тепловому шоку. Представляется, что, как и в случае окислительного стресса, при тепловом шоке Е. coli глутатион не принимает прямого участия в антиоксидантной защите.
Данные о поведении клеток Е. coli, адаптированных к росту при повышенной температуре, дают дополнительные доказательства в пользу того, что повышение температуры среды выше ростового оптимума сопровождается повышением уровня АФК. В таких клетках при переходе к аэробному росту при повышенной температуре наблюдалась интенсивная индукция каталазной активности на уровне транскрипции. Высокий уровень внутри- и внеклеточного восстановленного глутатиона у адаптированных клеток является, возможно, одним из элементов адаптации к росту при повышенной температуре.
Мы не отметили увеличения экспрессии sodA в ответ на повышение температуры от 30 до 45С, так же как и существенного влияния мутаций sodA и sodB на устойчивость Е. coli к тепловому шоку. Ранее было сообщено, что нет различия между СОД1" и СОД штаммами в чувствительности к 53 С (Privalle, Fridovich, 1987; Kogoma, Yura, 1992). В то же время было показано, что выживаемость Е. coli sodAsodB после повышения температуры от 37 до 45-48С значительно ниже, чем у клеток родительского типа (Privalle, Fridovich, 1987). Указанные различия могут быть связаны, в первую очередь, с различиями в температурных градиентах. Возможно, что при 53 С происходит такое же сильное ингибирование активности супероксиддисмутаз, как и в наших условиях, что делает два фенотипа неразличимыми. Следует также отметить, что мы оценивали чувствительность клеток к тепловому шоку по его влиянию на рост, тогда как в указанных выше работах использовался тест на выживаемость бактерий после высева на чашках с агаром.
