Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Биологические функции и метаболизм природных фенольных соединений 11
Глава 2. Адаптация esherichia coliк окислительному стрессу 37
Глава 3. Объекты, методы и материалы исследований 52
Глава 4. Исследование антиоксидантной активности экстрактов растений 60
Глава 5. Исследование антиоксидантнои активности флавоноидов 113
Обсуждение 123
Заключение 133
Выводы 136
Литература 136
- Биологические функции и метаболизм природных фенольных соединений
- Адаптация esherichia coliк окислительному стрессу
- Исследование антиоксидантной активности экстрактов растений
- Исследование антиоксидантнои активности флавоноидов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Активные формы кислорода (АФК) оказывают токсическое действие на организмы, повреждая мембранные липиды, белки и ДНК. Образование активных форм кислорода может происходить как в процессе нормального аэробного метаболизма, так и при действии экзогенных физико-химических факторов, прямо или косвенно, генерирующих АФК. Для нейтрализации вредного воздействия активных форм кислорода бактерии конститутивно синтезируют антиоксидантные ферменты, а также обладают механизмами адаптивного ответа, регулируемыми на генетическом уровне. У бактерий Escherichia coli в ответе на действие перекиси водорода (Н2О2) и супероксидного аниона (Ог") важную роль играют две группы генов (регулонов), контролируемых, соответственно, транскрипционными факторами OxyR и SoxRS (Storz, Imlay, 1999; Pomposiello, Demple, 2002).
В последние годы большое внимание уделяется изучению антиоксидантной активности (АОА) экстрактов лекарственных растений, которые находят широкое применение в официальной и народной медицине и косметике. Во многих случаях обнаружена высокая антиоксидантная активность экстрактов и предполагается, что эта активность может вносить существенный вклад в их лечебный эффект. Показано также, что АОА экстрактов связана с наличием в них полифенолов, в том числе, флавоноидов и таннинов (Pietta, 1998; Masaki et al, 1995; Shahidi et al., 1992). Эти соединения обладают способностью к прямому ингибированию свободных радикалов (Rice-Evans et al., 1995) и хелатированию металлов, включая железо (Afanas'ev et al., 1989; Sestili et al., 2002; Melidou et al., 2005). В то же время было показано, что в определенных условиях полифенолы могут участвовать в генерации АФК и действовать как прооксиданты (Hoshino et al., 1999; Smith et al., 2003).
В исследованиях на животных показаны антимутагенные эффекты полифенолов, а также положительное действие при лечении многих заболеваний сердечно-сосудистой и нервной системы, в профилактике рака и старения (Chung et al., 1998; Nijveldt et al., 2001). Наименее исследовано влияние полифенолов и экстрактов растений на бактерии, в том числе на те, которые являются компонентами кишечной микрофлоры человека. Как и у других энтеробактерий, важный этап жизненного цикла грамотрицательных бактерий Е. coli связан с пребыванием в кишечнике животных и человека. В процессе переваривания пищи кишечные бактерии могут прямо
контактировать с экстрактами растений и полифенолами и участвовать в их метаболизме (Halliwell et al., 2005). Были доложены данные о токсическом и мутагенном действии полифенолов на бактерии (Максимов с соавт., 2003; Edenharder, Grunhage, 2003; Smith et al., 2003), однако сведения об антиоксидантных и прооксидантных эффектах растительных экстрактов на бактерии малочисленны.
Цель настоящей работы - изучить антиоксидантное действие водно-спиртовых экстрактов растений Урала и Западной Сибири на бактерии Е. coli.
Основные задачи исследований:
Изучить антиоксидантные свойства растительных экстрактов путем исследования их влияния на рост и выживаемость бактерий Е. coli в условиях окислительного стресса.
Используя репортерные штаммы Е. coli, изучить влияние экстрактов на экспрессию антиоксидантных генов в отсутствие экзогенных оксидантов и в условиях окислительного стресса.
Изучить способность экстрактов к хелатированию ионов железа в цитоплазме бактерий.
Сравнить антиоксидантное действие экстрактов и некоторых полифенолов на бактерии с их активностью в условиях in vitro.
Научная новизна. Впервые исследовано антиоксидантное действие растительных экстрактов и некоторых полифенолов на бактерии Е. coli. Выявлена тесная связь между радикал-связывающей, металл-хелатирующей активностями, способностью защищать ДНК от окислительных повреждений in vitro и способностью экстрактов снижать бактериостатическое и бактерицидное действие Н2О2 в аэробно растущих культурах Е. coli. Выявлена корреляция между антиоксидантной активностью экстрактов и содержанием в них полифенолов.
Показано прооксидантное действие ряда экстрактов, которое выражалось в способности стимулировать экспрессию генов, кодирующих каталазу-гидропероксидазу HPI и супероксиддисмутазу Mn-SOD. Обнаружено, что прооксидантные эффекты экстрактов связаны с их способностью генерировать Н202. Выявлена корреляция между про- и антиоксидантными свойствами экстрактов. Таким образом, показано, что слабое прооксидантное действие экстрактов может вносить определенный вклад в защиту растущих клеток Е. coli от последующей экспозиции к высоким концентрациям Н2О2.
Теоретическое и практическое значение работы. Изучение антиоксидантных эффектов экстрактов растений и их отдельных компонентов на бактерии Е. coli позволяет получить новые данные об адаптации кишечной микрофлоры к окислительному стрессу.
Будучи хорошо изученными в физиолого-биохимическом и генетическом отношении, генно-инженерные штаммы бактерий Е. coli могут быть использованы как относительно простые тест-системы для скрининга растений, обладающих высокой антиоксидантной активностью, и изучения молекулярных механизмов действия субстратов растительного происхождения и составляющих их биологически активных компонентов.
Полученные результаты позволили составить список растений, произрастающих на территории Российской Федерации, которые могут быть использованы как потенциальные источники получения антиоксидантов. Особый интерес представляет обнаружение антиоксидантных свойств в растениях, которые широко применяются в официальной и народной медицине, что способствует пониманию механизмов их лекарственного действия.
Основные положения, выносимые на защиту
Выявлены виды растений, экстракты которых обладают выраженным антиоксидантным действием на бактерии Е. coli при пероксидном стрессе.
Обнаружены экстракты, обладающие прооксидантным действием. Эти экстракты продуцировали образование пероксида in vitro и стимулировали экспрессию антиоксидантных генов у бактерий in vivo.
Антиоксидантная активность экстрактов in vivo коррелировала с показателями in vitro и была связана с содержанием в испытанных образцах полифенолов.
Изучено действие некоторых полифенолов на бактерии Е. coli. Обнаружена корреляция между их антиоксидантной активностью in vitro и in vivo.
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на VI Съезде общества физиологов растений в рамках международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем», Сыктывкар, 2007 г.; региональной научной конференции молодых ученых «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии», Пермь, 2007 г.; VII международной конференции «Загрязнение окружающей среды, адаптация, иммунитет», Пермь-Н.Новгород-Пермь,
2008 г.; VII международной научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Экология и научно-технический прогресс», г. Пермь, 2008 г.; II Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов биологов «Симбиоз Россия 2009», Пермь, 2009 г.; на 13-м международном молодежном симпозиуме студентов и аспирантов биологов 'SymBioSE 2009' 'Biology: Expansion of Borders', г. Казань, 2009 г.
По теме диссертации опубликовано 20 работ, в том числе две статьи в иностранных рецензируемых журналах.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 159 страницах печатного текста, содержит 14 таблиц и 41 рисунок. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав экспериментальной части, обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 265 наименования работ отечественных и зарубежных авторов.
Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Изучение неспецифического отклика и адаптивных реакций клеток на различные стрессовые воздействия» (индекс приоритетного направления 4.1.13, номер госрегистрации 01910055305). Исследования поддержаны грантом РФФИ № 07-04-96030, грантом от Программы интеграционных проектов фундаментальных исследований, выполняемых в УрО РАН совместно с учеными СО РАН, а также грантом Президиума УрО РАН для молодых ученых (2009 г.).
Список принятых сокращений. АОА - антиоксидантная активность, РСА - радикал-связывающая активность, DPPH - дифенилпикрилгидразил, КОЕ - колониеобразующая единица, OD - оптическая плотность, НРІ -каталаза гидропероксидаза I.
Биологические функции и метаболизм природных фенольных соединений
Фенольные соединения представляют собой разнообразную группу вторичных метаболитов растений. Эти вещества играют важную роль в стратегии адаптации растений, во взаимоотношениях с окружающей средой и, в итоге, в общем процессе эволюции растительного мира и живых организмов (Kefeli et al., 2003; Высочина, 2004). Фенольные вещества в большом количестве содержатся в клетках растений, среднесуточная доза потребления человеком этих веществ в пищу может достигать 2 г, что приблизительно в 10 раз больше, чем в случае с витамином С, и в 100 раз выше по сравнению с потреблением витамина Е и каротиноидов (Scalbert et al, 2005).
В последние годы научный интерес к биогенным фенольным соединениям значительно возрос в связи с их широким спектром биологических активностей. Известно, что фенолы растительного происхождения обладают антиоксидантными свойствами, способны оказывать противовоспалительное, антимикробное, противоопухолевое действие, проявлять мощные терапевтические эффекты при заболеваниях, обусловленных окислительным стрессом (Motohashi, Sakagami, 2008). В то же время, они обладают прооксидантным, мутагенным и цитотоксичным действием (Sergediene et al, 1999).
Молекулы этих веществ имеют одно или несколько бензольных колец, содержащих одну и более гидроксильных групп. Наличие разного рода заместителей обуславливает структурное и функциональное разнообразие фенолов. К настоящему времени известно свыше 8000 биогенных фенольных соединений (Han et al., 2007), которые встречаются в виде гликозидов с широким набором моно-, ди- и трисахаридов, а также в свободном виде без углеводной части (агликоны), известны полимерные формы. В зависимости от числа бензольных колец и соединенных с ними структурных элементов природные фенольные соединения подразделяются на группы: - фенольные кислоты (гидроксибензойные и гидроксикоричные); флавоноиды (флавонолы, флавоны, изофлавоны, флаваноны, антоцианидины и флаванолы); - стильбены; - полимерные соединения (лигнаны, меланины). Наиболее распространенную и многочисленную группу природных фенольных соединений образуют флавоноиды. По разным оценкам, на сегодняшний день выделено более 5000 индивидуальных флавоноидов (Walle, 2004).
Флавоноиды являются производными бензо-у-пирона и образуют Сб-С3-С6-структуру, в которой два бензольных ядра А и В соединены трехуглеродным фрагментом С (рис. 1.). В зависимости от степени окисленности-восстановленности кольца С флавоноиды подразделяют на несколько основных подклассов (Beecher, 2003), характеристика которых представлена в Табл. 1.
Флавоноиды способны образовывать полимерные молекулы, которые называются таннинами и также подразделяются на несколько групп: конденсированные таннины (проантоцианидины), гидролизуемые таннины и сложные таннины. В растительном мире наиболее распространены конденсированные таннины. Их можно рассматривать как продукты конденсации флаван-3-олов и, в частности, (+)-катехина, (+)-эпикатехина, (+)-галокатехина и (-)-эпигаллокатехина.
Несмотря на сходство структуры, отдельные группы флавоноидов значительно различаются по свойствам и биологической активности. Флавоноиды являются одними из самых распространенных компонентов пищи человека и животных. В большом количестве эти вещества содержатся во фруктах, овощах, злаках, шоколаде, чае, кофе и вине. До середины 1990-х гг. эти соединения не принимались во внимание как антиоксиданты. Интерес к антиоксидантным свойствам флавоноидов возник после описания «французского парадокса», связанного с относительно низкой смертностью жителей Средиземноморья от сердечнососудистых заболеваний, несмотря на потребление пищи, содержащей большое количество жиров. Наблюдаемый эффект был объяснен постоянным употреблением жителями этого региона красного вина и насыщенных жиров (Nijveldt et aL, 2001). В свою очередь, положительное влияние красного вина было связано с высоким содержанием в нем флавоноидов, обладающих выраженным антиоксидантным действием (Hertog et aL, 1995). Табл. 1. Краткая характеристика основных подклассов флавоноидов.
На протяжении длительного времени считалось, что биологическая активность флавоноидов по отношению к животным и человеку связана с их антиоксидантным действием, которое, в свою очередь, осуществляется исключительно за счет прямого связывания радикалов или подавления их образования.
В настоящее время накапливаются данные о более сложных механизмах действия флавоноидов на клеточном и молекулярном уровне. Эти механизмы, кроме указанной выше прямой нейтрализации радикалов, могут включать более тонкие и специфические реакции, включая взаимодействие с системами сигнальной трансдукции, приводящее к изменению клеточного редокс-статуса и формированию адаптивного ответа на окислительный стресс (Forman et al., 2002; Halliwell et al., 2005). Накопленные к настоящему времени данные свидетельствуют о том, что механизмы АОА с участием флавоноидов могут включать: - непосредственное связывание активных форм кислорода (АФК) (Silva et al, 2002); - хелатирование ионов переходных металлов, участвующих в процессе генерации АФК в реакциях типа Фентона (Ferrali et al., 1997; Melidou et al., 2005); -индукцию или защиту систем АО защиты клетки (Williams et al., 2004). Радикал-связывающая активность флавоноидов (РСА). С точки зрения термодинамики, флавоноиды обладают малыми значениями окислительно-восстановительных потенциалов (+0,23 Е +0,75 В) по сравнению с АФК (+1,00 Е +2,13 В) и поэтому способны восстанавливать последние. В ходе взаимодействия флавоноидов с АФК образуются ароксильные радикалы, реагирующие далее между собой с формированием стабильных хиноновых структур (рис. 2).
Bors и соавт. описали три структурных детерминанты, обеспечивающих РСА: 1) оргао-дигидроксильная или катехоловая группа (3 ,4 -ОН) в кольце В (Раздел 1.1., рис. 1), отвечающая за высокую стабильность образующегося радикала; 2) конъюгация кольца В и 4-оксо группы посредством 2,3-двойной связи, которая способствует делокализации электрона с кольца В и 3) конъюгация 3- и 5-ОН групп с 4-оксо-группой, обеспечивающая делокализацию электрона от 4-оксо-группы на другие заместительные группы (Bors et al., 1990). Сочетание всех трех структурных особенностей обеспечивает образование более стабильных ароксильных радикалов. Таким образом, представители флавонолов (например, мирицетин и кверцетин) должны обладать высокой степенью РСА, что подтверждается экспериментально (Silva et al., 2002).
Адаптация esherichia coliк окислительному стрессу
Окислительный стресс является результатом воздействия на организмы избыточных количеств АФК: супероксидного аниона (02" ), перекиси водорода (Н202), гидроксильного радикала ( ОН) и гидроперекисей (ROOH). Возникновение АФК в клетках является неизбежным следствием функционирования ферментов дыхательной цепи (Messner, Imlay, 2002), а также результатом действия экзогенных оксидантов и факторов, инициирующих образование АФК (Chance et al, 1979; Eisenstark, 1989; Basaga, 1990).
В процессе аэробного дыхания не менее 98 % потребляемого клетками кислорода подвергается четырехэлектронному восстановлению ферментами дыхательной цепи с образованием нейтральной молекулы воды. Наряду с этим во время дыхания протекают реакции одно-, двух- и трехэлектронного восстановления с образованием Н2О2 и 02 (Chance et al., 1979; Pryor, 1986).
В этом состоит парадокс аэробной жизни или «парадокс кислорода»: кислород необходим для жизни большинства организмов и, одновременно, опасен для их существования (Davies, 1995). у Если Ог" - малоактивный радикал с периодом полураспада 10" сек, то Н202 является стабильным продуктом, и ее образование in vivo в аэробных условиях показано во многих случаях (McCormick et al., 1976; Berglin et al., 1982). В лабораторных условиях в качестве генераторов 02- используют такие соединения, как паракват и менадион (Fridovich, 1978; Demple, 1991; Fair, Kogoma, 1991). 02 "-генерирующие соединения легко восстанавливаются клеточными ферментами до семихинонов, которые, в свою очередь, окисляются кислородом, продуцируя 02 ". Многократное окисление и восстановление хинонов создает непрерывный поток 02_. Кроме хинонов, в образовании 02 могут участвовать ионы металлов с переменной валентностью (Меп+): 02 + Ме" 02- + Men+1. (5) Поскольку 02 нестабилен, то легко дисмутирует. Дисмутация может происходить как спонтанно, так и при участии ферментов (супероксиддисмутаз), что существенно увеличивает скорость образования Н202 (Beyer et al, 1991): 202-- + 2КҐ-+Н202. (6) Внутриклеточные концентрации Н202 выше 1 мкМ являются токсичными для клеток и приводят к их гибели (Antimes, Cadenas, 2001). Токсичное действие Н202, как и 02 связывают с тем, что эти соединения являются предшественниками гидроксильного радикала ( ОН), который является мощным оксидантом (период полураспада порядка 10"9 сек). Имея высокий стандартный окислительно-восстановительный потенциал (Ео = + 2.3 В), гидроксильный радикал быстро вступает в реакцию практически с любыми биомолекулами в местах его образования (Basaga, 1990). Реакция Фентона — один из главных источников образования ОН в присутствии ионов переходных металлов, например, Fe + или Си (Park et ah, 2005).
Благодаря эффективной работе систем антиоксидантной защиты, в нормальных условиях Н202 и 02 не представляют опасности для клеток. Однако при повреждении защитных систем или в неблагоприятных условиях, когда поток АФК оказывается велик, возникает опасность окислительного повреждения клетки.
Практически все клеточные компоненты, включая нуклеиновые кислоты, белки и липиды, подвергаются атаке АФК (Fridovich, 1978; Lesko et al., 1980; Davies, 1987). Окислительные повреждения ДНК включают как повреждение азотистых оснований, так и повреждение сахарного остатка. Взаимодействие ОН с остатками Сахаров приводит к высвобождению пуриновых и пиримидиновых оснований и, следовательно, к разрыву цепи ДНК. Важным условием протекания этой реакции является наличие свободного Fe , которое способствует образованию ОН вблизи ДНК и ее окислительному повреждению. Разрывы цепей и другие повреждения, которые блокируют репликацию, могут быть причиной гибели клеток, а повреждение оснований вносит значительный вклад в мутагенез (Aust, Eveleigh, 1999). Кроме того, с ДНК могут реагировать продукты окисления липидов, содержащие пероксидные, карбоксильные и гидроксильные группы, а также альдегиды и алканы (Farr, Kogoma, 1991). Другим следствием окислительного повреждения ДНК может быть синтез «неправильных» белков, что в свою очередь, может вызвать индукцию белков теплового шока, участвующих в их деградации (Goff, Goldberg, 1985; Demple, 1991; Matuszewska et al, 2008). В отличие от ионов Fe2+, механизм токсического действия ионов меди внутри клеток Е. coli не связан с окислительным повреждением ДНК (Macomber et al., 2007).
Вследствие укорочения цепочек жирных кислот нарушается мембранная проницаемость, возникает осмотический дисбаланс, снятие трансмембранного протонного градиента и снижение внутриклеточного рН (Farr et al, 1988). Стоит отметить, что бактериальные мембраны более устойчивы к перекисному окислению по сравнению с мембранами эукариот, так как в составе бактериальных мембран содержатся преимущественно насыщенные и мононенасыщенные жирные кислоты.
АФК могут вызывать окислительное повреждение белков. Внутриклеточные белки под действием оксидантов могут образовывать дополнительные дисульфидные связи, что получило название «дисульфидного стресса» (Aslund et al., 1999). Такой вид повреждений является обратимым, так как клетки восстанавливают редокс-баланс за счет активации систем антиоксидантной защиты. Необратимое окисление аминокислотных остатков под действием ионизирующего излучения или реакций типа Фентона может привести к утрате ферментативной активности и деградации модифицированных белков (Levine et al., 1981; Davies et al., 1988).
Вследствие окисления функциональных групп и повреждения в активных центрах металлоферментов возможно изменение клеточного метаболизма. Например, окислительный стресс приводит к ингибированию ключевого фермента гликолиза, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, что, в свою очередь, вызывает сдвиг метаболизма в сторону пентозофосфатного цикла (Меньшикова, Зенков, 1997). Это способствует восполнению пула НАДФН, необходимого для репарации окислительных повреждений (Brumaghim et al., 2003; Giro et al., 2006).
Исследование антиоксидантной активности экстрактов растений
Исследования свойств экстрактов in vitro. Одним из важных показателей, имеющих отношение к АОА растительных субстратов, является содержание в них фенольных соединений. Для первой партии экстрактов определялось отдельно содержание двух фракций: дубильных веществ (таннинов) и флавонолов. Экстракты существенно отличались между собой по содержанию как флавонолов, так и таннинов. Высокое содержание флавонолов отмечено у пятилистника, манжетки, чины и шиповника, высокое содержание таннинов - у пятилистника, лабазника и шиповника Низкое содержание обеих фракций отмечено у подорожника и лопуха. (Табл.4). Из списка экстрактов, указанных в табл. 4, для более детального анализа были выбраны 10 образцов с высоким и низким содержанием фенольных соединений.
Предполагается, что одним из основных механизмов антиоксидантной активности полифенолов является их способность к прямой нейтрализации свободных радикалов, таких как гидроксильный радикал, супероксид и др. Из ряда широко применяемых современных методов для определения такой способности нами был выбран метод определения радикал-связывающей активности (РСА), использующий 2,2-дифенилпикрилгидразил (DPPH). Измерения показали, что РСА экстрактов варьировала в широких пределах, изменяясь от 83.1 до 11.9 %. Наиболее высокая активность обнаружена у экстрактов из листьев пятилистника (83.1 %), шиповника (82.1 %), земляники (80.7 %) и медуницы (75.5 %), низкие значения отмечены у чины (16.7 %) и лопуха (11.9 %) (рис. 6).
Накапливаются данные о том, что антиоксидантная активность полифенолов и многих других биосубстратов связана со способностью хелатировать ионы металлов и, прежде всего, ионов железа. Хелатирующая активность экстрактов варьировала в диапазоне от 90 до 18.5 %. Наиболее высокая активность выявлена у листьев земляники (90 %), пятилистника (89.8 %), манжетки (84.6 %) и шиповника (78.7 %), низкая хелатирующая активность отмечена у чины (18.5 %) .
Было проверена также способность указанных выше экстрактов к защите плазмидной ДНК от окислительного действия гидроксильных радикалов в ходе реакции Фентона in vitro. В наибольшей степени защитное действие оказывали экстракты из листьев шиповника и пятилистника. У экстрактов этих растений коэффициент защиты составил 1.64 и 1.73, соответственно. Заметное защитное действие выявлено также у экстрактов из листьев земляники (1.40) и лабазника (1.46). (рис. 8). Экстракты лопуха, черемухи и чины не оказывали существенного защитного эффекта (1.03, 1.17 и 1.27, соответственно).
В предварительных экспериментах была выявлена концентрация экстрактов (5 мг/мл), при добавлении которой не наблюдалось заметного бактерицидного действия на растущие клетки Е. соїі. В то же время, при этой концентрации экстракты оказывали некоторое влияние на рост бактерий, стимулируя или ингибируя рост в пределах от 3 до 31 % от контрольного уровня. В наших условиях обработка аэробно растущих бактерий Е. coli 2 мМ Н202 приводила к выраженному ингибированию роста. Экстракты растений, использованные в этой работе, существенно различались по способности снижать бактериостатическое действие Н202 В табл. 5 показано влияние предобработки экстрактами растений первой партии на рост Е. coli в присутствии оксиданта. Среди них приблизительно 70 % экстрактов значительно снижали бактериостатическое действие оксиданта и имели показатель антиоксидантной активности (обозначаемый далее как АОАІ). Наибольший защитный эффект (от 2.7 до 8.1) выявлен у шиповника майского, кровохлебки лекарственной, манжетки обыкновенной, полыни эстрагон и земляники лесной. У восьми экстрактов отмечено слабое протективное действие (AOAj 2.7) или его отсутствие. Предобработка экстрактами цветков чистотела большого, астрагала датского, чины Гмелина и синюхи голубой, листьев лопуха войлочного усиливала бактериостатическое действие Н202 (АОА! 1).
Нами было изучено влияние предобработки экстрактов на рост бактерий в присутствии менадиона. Это соединение в аэробных условиях генерирует супероксидный анион 02 и вызывает у бактерий окислительный стресс. Предобработка некоторыми экстрактами снижала бактериостатическое действие менадиона (0.5 мМ), однако в целом защитный эффект был выражен слабее, чем при действии Н202. Наибольший эффект оказывали экстракты из листьев шиповника, кровохлебки и манжетки, которые снижали бактериостатическое действие менадиона примерно в два раза. Примечательно, что экстракты из этих растений проявляли высокую АОА и при обработке бактерий Н202.
Исследование антиоксидантнои активности флавоноидов
К настоящему времени хорошо установлена тесная связь между антиоксидантной активностью экстрактов растений и содержанием в них фенольных веществ (Шее-Evans et al., 1995; Wojdylo et al., 2006). Это относится и к лекарственным растениям, многие из которых содержат большое количество фенолов, таких как флавоноиды и танины (Masaki et al., 1995; Guo et al., 2008). В связи с этим, в нашей работе была проведена оценка антиоксидантной активности танниновой кислоты и флавоноидов различных подклассов в тех же условиях и теми же методами, которыми определяли АОА экстрактов растений. Известно, что возможными механизмами антиоксидантного действия растительных фенолов могут быть прямая нейтрализация свободных радикалов (Silva et al., 2002) и хелатирование ионов металлов, включая ионы железа (Sestili et al., 2002; Melidou et al., 2005), что предотвращает протекание реакций типа Фентона, генерирующих АФК.
С целью выявления механизма антиоксидантного действия активность флавоноидов сравнивали с таковой у тролокса, антиоксиданта, обладающего только радикал-связывающей активностью, и хелаторами железа - 2,2 -дипиридилом и дефероксамином. Известно, что дипиридил является хелатором железа (II), способным проникать внутрь клеток Е. coli и защищать от летального действия Н2Ог (Park, Imlay, 2003). Дефероксамин представляет собой хелатор железа (III), который также может проникать внутрь клеток Е. coli и связывать свободные ионы Fe3+, а в присутствие кислорода связывать и промотировать окисление ионов Fe (Keyer, Imlay, 1996).
Способность испытуемых веществ к прямой нейтрализации свободных радикалов оценивали с помощью метода определения радикал-связывающей активности (РСА) с DPPH. В результате были определены концентрации, при которых испытуемые соединения связывали 50 % DPPH-радикалов в тест-системе (IC50, мМ). Наиболее высокую РСА проявил таннин (IC50 0.005 мМ), кверцетин и катехин (0.014 и 0.019 мМ, соответственно) (Табл. 12). Чуть ниже оказалась РСА у тролокса (0.04 мМ) и дефероксамина (0.036 мМ). Слабую РСА проявили флавоноиды гесперетин и нарингенин (0.188 и 1.082 мМ, соответственно). Не выявлено радикал-связывающей активности у дипиридила.
Результаты оценки металл-хелатирующей способности полифенолов представляли в виде концентрации испытуемого вещества, при которой наблюдалось связывание 50 % ионов Fe2+ в тест-системе (ЕС5о, мМ) (Kim et al, 2005) (Табл. 12). Как и следовало ожидать, высокую металл-хелатирующую способность проявили хелаторы железа (II) дефероксамин (ЕС5о= 0.08 мМ) и дипиридил (1.47 мМ). Среди фенолов наиболее высокая металл-хелатирующая способность была обнаружена у кверцетина, танниновой кислоты и катехина (0.24, 0.05 и 1.42 мМ, соответственно). Слабая металл-хелатирующая способность была зарегистрирована у нарингенина (6.85 мМ) и гесперитина (8.36 мМ). У тролокса металл-хелатирующая способность отсутствовала.
Существенный вклад в биологическую активность полифенолов может вносить их способность к аутооксилению в аэробных условиях и продукции АФК (Smith et al., 2003). В наших условиях наибольшую скорость продукции Н2О2 демонстрировали кверцетин, таннин и катехин (0.064, 0.050 и 0.013 мкмоль/мин, соответственно). У остальных испытуемых веществ продукция пероксида была незначительной (не более 0.003 мкмоль/мин) (Табл. 12).
В предварительных экспериментах нами было установлено, что в аэробных условиях тестируемые полифенолы, тролокс и хелаторы железа в концентрации до 0.2 мМ не оказывали существенного бактерицидного влияния на рост бактерий Е. coli. Кверцетин (0.2 мМ) и таннин (0.2 мМ) вызывали подавление роста приблизительно на 20 %.
Предобработка клеток в течение 40 мин нарингенином, гесперетином и тролоксом не оказывала существенного влияния на длительность периода остановки роста, обусловленной действием оксиданта. Добавление пероксида к клеткам, предобработанным кверцетином, таннином и дефероксамином, приводило к неполному подавлению роста, и в этих культурах наблюдалось более раннее возобновление линейного роста. Величины оптической плотности, достоверно отличающиеся от контроля, наблюдались уже через 40, 50, 70 и 80 мин после добавления Н202 в культурах, предобработанных кверцетином, таннином, дефероксамином и катехином, соответственно (рис. 37).
В отсутствие оксиданта обработка клеток Е. coli QC771 испытуемыми веществами в течение 40 мин, не оказывала существенного влияния на выживаемость бактерий. Исключение составили кверцетин и дипиридил, которые вызывали некоторое снижение выживаемости на 10 и 14 %, соответственно.Обработка клеток 10 мМ Н202 вызывала бактерицидное действие, снижая выживаемость более чем в 1000 раз (рис. 38). Предварительная обработка бактерий кверцетином (0.1 мМ), таннином (0.1 мМ) и дефероксамином (0.1 мМ) способствовала повышению их выживаемости в 140, 8.2 и 8.4 раза, соответственно. Нарингенин вызывал противоположный эффект, понижая выживаемость в 16 раз. Другие флавоноиды и тролокс не оказывали значительного защитного эффекта. В отличие от дефероксамина, дипиридил в диапазоне концентраций 0.01-1 мМ не оказывал защитного действия в этих условиях.
В наших опытах из всех тестируемых веществ только кверцетин и таннин оказывали стимулирующее влияния на экспрессию гена katG, который кодирует каталазу HPI (Табл. 13). Индекс индукции составил 1.46 и 1.66, соответственно. Измерения в интактных клетках показали, что в присутствие кверцетина и таннина общая каталазная активность повышалась по сравнению с контролем в 1.54 и 1.29 раза, соответственно.
Обработка клеток E.coli NM111, несущих слияние katG::lacZ, 2 мМ Н2О2 приводила к дополнительному повышению активности р-галактозидазы от 446 ± 23 до 1220 ± 87 единиц Миллера. В этих условиях предобработка клеток тролоксом не оказывала существенного влияния на экспрессию katG::lacZ. В присутствие нарингенина и гесперетина индукция понижалась приблизительно на 30% по сравнению с контролем. Предварительная обработка клеток кверцетином, таннином, дипиридилом и дефероксамином повышала экспрессию слияния более чем в 2 раза (Табл. 13). Катехин оказывал лишь слабое стимулирующее действие на экспрессию katGr.lacZ как в отсутствие, так и после добавления Н2О2.
Предобработка кверцетином и таннином также повышала общую каталазную активность в клетках, подвергнутых окислительному стрессу (19 ± 1 и 18.9 ± 3, соответственно). В клетках, обработанных только Н2О2, это значение составляло 11.4 ± 1.5. В этих условиях предобработка бактерий хелаторами железа дипиридилом и дефероксамином способствовала повышению каталазной активности до 18.3 ± 0.9 и 19.6 ± 3, соответственно.
Поскольку хелатирование внутриклеточного свободного железа может препятствовать протеканию реакций типа Фентона и вносить некоторый вклад в защиту от окислительного стресса, нами была исследована металл-хелатирующая способность тестируемых веществ in vivo. Для этого измеряли величину экспрессии слияния iucC::lacZ в клетках E.coli BN407. Чем выше величина экспрессии гена iucC, кодирующего элементы системы транспорта железа, тем меньше свободного железа присутствует в клетке и, следовательно, выше металл-хелатирующая способность испытуемых веществ (De Lorenzo, Neilands, 1986; Bagg, Neilands, 1987).
