Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Escherichia coli как условно-патогенный микроорганизм 9
1.1.1. Типы адгезинов Е. coli 9
1.1.1.1. Маннозочувствительные фимбрии или фимбрии 1 типа Е. coli 11
1.1.1.2. Маннозоустойчивые фимбрии Е. coli 13
1.2. Общая характеристика Тамм-Хорсфалл протеина 15
1.2.1. Структура Тамм-Хорсфалл протеина 17
1.2.1.1 . Аминокислотный состав Тамм-Хорсфалл протеина 19
1.2.1.2. Углеводный состав Тамм-Хорсфалл протеина 19
1.2.2. Способы идентификации и выделения Тамм-Хорсфалл протеина 22
1.3. Роль Тамм-Хорсфалл протеина в развитии восходящей уроинфекции 23
1.3.1. Взаимодействие Е. coli, несущих Р-фимбрии с Тамм-Хорсфалл протеином 24
1.3.2. Взаимодействие Е. coli, несущих фимбрии 1 типа с Тамм-Хорсфалл протеином 25
1.3.3. Взаимодействие Е. coli, несущих S-фимбрии с Тамм-Хорсфалл протеином 26
1.3.4. Взаимодействие Е. coli, несущих адгезии 075Х
с Тамм-Хорсфалл протеином 27
1.4. Биологическая роль ТХП 28
1.4.1. Исследование Тамм-Хорсфалл протеина на мышиных моделях 29
1.5. Патологическое значение Тамм-Хорсфалл протеина 30
1.5.1. Количественное содержание Тамм-Хорсфалл протеина в норме и при патологии 30
1.5.1.1. Экскреция Тамм-Хорсфалл протеина при трансплантации почки 31
1.5.2 Антителопродукция к Тамм-Хорсфалл протеину 33
1.5.2.1. Возрастная зависимость антителообразования к Тамм-Хорсфалл протеину 34
1.5.2.2. Антителопродукция к Тамм-Хорсфалл протеину при патологиях 35
1.5.3. Феномен Тамм-Хорсфалл протеина при трансплантации почки 37
Глава 2. Материалы и методы 39
2.1. Материалы 39
2.1.1. Штаммы микроорганизмов 39
2.1.2. Клинический материал 41
2.1.3. Среды, антибиотики и реактивы, используемые в работе 42
2.1.3.1. Среды 42
2.1.3.2. Антибиотики 42
2.1.3.3. Реактивы 42
2.1.3.4. Экспериментальные животные 43
2.1.3.5. Оборудование 43
2.2. Методы исследования . 44
2.2.1. Выделение Тамм-Хорсфалл протеина 44
2.2.2. Получение иммунных сывороток 45 2.2.3.Получение антигенного эритроцитарного диагностикума 46
2.2.4. Исследование бактериальной адгезии 48
2.2.4.1. Исследование адгезии Е. соїі в реакции агглютинации дрожжей 48
2.2.4.2. Реакция нейтрализации агглютинации дрожжей 49
2.2.4.3. а,б Реакция торможения агглютинации дрожжей 49
2.2.4.4. Исследование агглютинации эритроцитов барана 50
2.2.4.5. реакция нейтрализации эритроцитов барана 51
2.2.4.6. Реакция торможения агглютинации эритроцитов барана 52
2.2.4.7. исследование агглютинации эритроцитов морской свинки 52
2.2.4.8. Реакция нейтрализации эритроцитов морской свинки 53
2.2.4.9. Реакция торможения агглютинации эритроцитов морской свинки 53
2.2.5. Методы постановки серологических и иммунохимических реакций 54
2.2.5.1. Реакция агглютинации с иммунной сывороткой 54
2.2.5.2. Реакция торможения Тамм-Хорсфалл протеина агглютинации иммунной сыворотки 54
2.2.5.3. Определение концентрации ТХП в образцах мочи
по реакции нейтрализации антител 55
2.2.5.4. Реакция нейтрализации антител нативной мочой 55
2.2.5.5. Реакция преципитации в геле 56
2.2.5.6. Иммуноэлектофорез 57
2.2.6. Математическая и статистическая обработка данных 57
Глава 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение
3.1. Адгезия Е. coli на эпителиальные клетки мочевыводящего тракта и роль ТХП как протективного фактора 58
3.1.1. Изучение адгезинов музейных штаммов Е. coli в
сравнении с клиническими изолятами. Блокирующее действие ТХП на адгезию Е. coli к клеткам-мишеням 61
3.2. Тест-система для определения Тамм-Хорсфалл протеина 68
3.2.1. Тестирование иммунной сыворотки в РИД 68
3.2.2. Исследование активности сывороток 72
3.2.3. Исследование активности антигенного эритроцитарного диагностикума 72
3.3. Исследование продукции аутоаитител к Тамм-Хорсфалл протеину и влияние их на изменение уровня ТХП в моче 73
3.3.1. Исследование антителопродукции к Тамм-Хорсфалл протеину у доноров и реципиентов почечного трансплантата 74
Заключение 83
Выводы 86
Список публикаций по материалам диссертации 87
Список литературы 88
- Escherichia coli как условно-патогенный микроорганизм
- Аминокислотный состав Тамм-Хорсфалл протеина
- Среды, антибиотики и реактивы, используемые в работе
- Адгезия Е. coli на эпителиальные клетки мочевыводящего тракта и роль ТХП как протективного фактора
Введение к работе
В настоящее время трансплантация почек вошла в широкую медицинскую практику. Одним из наиболее частых послеоперационных осложнений является развитие восходящей уроинфекции. Escherichia coli в этиологической структуре этой патологии занимает ведущее место, в связи с чем исследование механизмов колонизации этим микробом мочевыделителыюго тракта является актуальным. Одним из физиологических барьеров на пути восходящей уроинфекции является Тамм-Хорсфалл протеин (ТХП).
Этот белок был обнаружен в моче здорового человека в 1950 г. исследователями I. Tamm и F. Horsfall (102). В норме он выявляется исключительно в почках, но при этом не является непосредственным структурным элементом органа, а активно секретируется эпителиальными клетками восходящего отдела петли Генле, выделяясь с мочой в количестве от 50 до 244 мкг/мл (5).
Несмотря на значительный исследовательский интерес, физиологическая функция этого белка полностью не расшифрована. В 1980 Orskov и соавт. доказали возможность связывания Тамм-Хорсфалл протеина с фимбриями 1 типа Escherichia coli (83). ТХП обладает способностью взаимодействовать с FimH доменом фимбрий 1 типа кишечной палочки, препятствуя тем самым адгезии Е. coli на уроэпителии.
Основой успешной колонизации слизистой мочевого тракта является соответствие фенотипа адгезина рецепторам, локализованным на клетках-мишенях. В этой связи актуальным является определение фенотипов адгезинов, характерных для уропатогенных вариантов Е. coli, и выявление степени блокирования их ТХП на клетках мишенях.
Рассматривая ТХП как фактор защиты мочевыводящего тракта, важным аспектом данной проблемы является выяснение возможности иммунного ответа на этот белок и определение роли аутоантител (ААТ) к ТХП при адгезии Е. coli на уроэпителии.
Цель и задачи работы.
Цель исследования заключалась в определении значения Тамм-Хорсфалл протеина в колонизации мочевыделительного тракта штаммами Е. coli, различающимися по фенотипу адгезинов.
По ходу достижения поставленной цели последовательно решались следующие задачи:
1. Разработать тест-систему, включающую иммунную сыворотку и антигенный диагностикум к ТХП;
Исследовать блокирующую активность Тамм-Хорсфалл протеина на адгезию различных штаммов Е. coli;
Исследовать иммунный ответ на ТХП у доноров и реципиентов почечного трансплантата;
Изучить влияние ААТ к ТХП на секрецию данного белка.
Научная новизна.
Впервые в нашей стране была создана тест-система для определения секреции ТХП в моче и ААТ к нему в сыворотке крови. Это позволило провести мониторинг данных показателей у реципиентов почечного трансплантата. Впервые аутоантитела к ТХП в сыворотке крови были выявлены у доноров почечного трансплантата.
Изучено блокирующее действие ТХП на разные фенотипы адгезинов Е. coli и таким образом, исследована защитная роль этого белка при развитии восходящей уроинфекции у лиц с трансплантированной почкой.
Практическая значимость
Предложен простой в исполнении и эффективный метод количественного определения ТХП в моче, а также детекции уровня ААТ к ТХП в сыворотке крови.
Данные сравнительного анализа адгезивных способностей музейных и клинических штаммов E.coli, а также выведенный индекс блокирования их адгезии Тамм-Хорсфалл протеином, свидетельствуют о роли ТХП как селективного фактора при колонизации эпителия мочевого тракта и развитии восходящей уроинфекции.
Положения, выносимые на защиту
Создана тест-система для количественного определения ТХП в моче и выявления ААТ к этому белку в сыворотке крови;
ТХП является селективным фактором для различных фенотипов адгезинов Е. coli при развитии восходящей уроинфекции;
Титр ААТ к ТХП в сыворотке крови выявляется не только у реципиентов, но и доноров почечного трансплантата;
ТХП способен связываться с ААТ непосредственно в организме, что сопровождается снижением его секреции.
Escherichia coli как условно-патогенный микроорганизм
Кишечная палочка - один из наиболее типичных представителей флоры, колонизирующей пищеварительный тракт. В случае дисбиоза этот вид микроба оказывается способным занимать новые экологические ниши. В различных концентрациях и разных соотношениях с другими микроорганизмами ее выявляют в биоценозах конъюнктивы, верхних дыхательных путей (непостоянно) и мочеполового тракта. Ключевым моментом в освоении кишечной палочкой новой среды обитания является адгезия (7).
В условиях макроорганизма адгезия бактерий на клетках-мишенях представляет собой многоступенчатый процесс и состоит из нескольких стадий: приближения, неспецифического взаимодействия поверхности микроорганизма и мембран клетки-мишени, сменяющегося специфическим лиганд-рецепторным взаимодействием адгезинов с определенными рецепторами (8). Представляя собой специфические макромолекулярные комплексы микробных клеток, адгезины, как правило, входят в состав фимбрий или поверхностных структур клеточной стенки, с помощью которых происходит фиксация бактерии на субстрате клетки-мишени. Начало изучению адгезинов кишечных бактерий положили работы Houwink А. и Iterson W., впервые описавших отличающиеся от жгутиков длинные тонкие нитевидные образования на поверхности грамотрицательиых бактерий, (названных впоследствии фимбриями или пилями). Ими же было высказано и предположение о том, что эти структуры могут играть роль «органа адгезии» бактерий к клеткам макроорганизма (49). За последующие 15 лет были проведены электоронно-микроскопические, биохимические, спектрофотометрические, рентгеноструктурные исследования фимбрий и предложена классификация их по морфологическим и функциональным признакам (7).
Duguid S.P. и Old D.C. использовали в качестве клеток-мишеней для адгезинов энтеробактерий эритроциты человека и 18-ти видов животных, в том числе обезьяны, лошади, овцы, барана, козы, свиньи, морской свинки и других видов млекопитающих. В серии работ, вышедших из этой лаборатории (30), были проведены электронно-микроскопические исследования поверхностной структуры бактерий в сопоставлении с их способностью фиксироваться на эритроцитах и вызывать реакцию гемагглютинации (РГА). Оказалось, что именно те бактерии, которые обладают фимбриями, вызывают агглютинацию эритроцитов. Попытка дифференцировать фимбрии по их связыванию с эритроцитами разных видов животных привела к выявлению двух основных групп адгезинов Е. coli. Агглютинационная способность одних ингибировалась присутствием в реакционной смеси 0,5% d-маннозы или а-метил-гі-маннозида, в связи с чем они получили название маннозочувствительных (МЧ) фимбрий, а поскольку такие фимбрии были выявлены у большинства изученных видов энтеробактерий (до 90%), то их стали называть общими. Морфологически МЧ фимбрии относятся к фимбриям 1 типа по классификации Brinton С.С. Кроме МЧ фимбрий были обнаружены и другие, подчас не отличимые по морфологическим признакам фимбрии, связывание которых с эритроцитами морской свинки и человека не тормозилась в присутствии d-маннозы. Они получили общее название машюзоустойчивых (МУ) фимбрий (16).
Пили первого типа, или маннозочувствительные пили, несущие адгезии FimH, экспрессируются на поверхности практически всех Е. coli и большинства других представителей семейства Enter-obacteriaceae (например
Salmonella, Klebsiella, Enterobacter). Обычно бактерия имеет на своей поверхности 200-500 перетрихиозио расположенных пилей. Каждая фимбрия имеет диаметр 7нм, достигая в длину 0,2-2,0 мкм и представляет собой полимер, образованный 1000 копиями основной структурной субъединицы - белка FimA, закрученных в а-спираль (7).
С помощью электронной микроскопии и РГА эритроцитов морской свинки и человека было выявлено широкое распространение штаммов, обладающих МЧ фимбриями среди изолятов, выделенных от больных с различными заболеваниями - диареей, сепсисом, циститом, менингитом, раневыми инфекциями. Особенно часто Е. coli, несущие МЧ-фимбрии, выделяли в урологических клиниках, и Brinton С.С. даже назвал мочеполовой тракт человека «примером экологической ниши для пилированных бактерий». Brinton С.С. также показал, что маннозочувствительную РГА могут вызывать и сами фимбрии, отделенные от бактериальных клеток (16).
Firon N. et al. используя большой набор линейных и разветвленных олигосахаридов маннозы и некоторые другие гликозиды в тесте ингибирования агглютинации эритроцитов морской свинки, вызываемой как клетками Е. coli, обладающими фимбриями 1 типа, так и изолированными фимбриями нашли, что наиболее активно блокируют реакцию разветвленные олигосахариды типа
Аминокислотный состав Тамм-Хорсфалл протеина
Как и другие белки гликопротеины мочи, ТХП отличается довольно высоким содержанием углеводов, которые составляют порядка 40% его общего сухого веса (73, 100, 106).
Молекулярный вес углеводной части, рассчитанный на основании содержания углеводных остатков, входящих в ТХП, равен 7180 Да (включая все остатки Сахаров, за исключением фукозы и сиаловой кислоты, которые занимают концевое положение). На один гликопротеиновый мономер ТХП приходятся две гетеросахаридные группы. Углеводный состав ТХП, приведенный в таблице 3, можно отнести к двум одинаковым гетеросахаридам при условии, что каждый их них содержит 8 галактозных остатков, вместо 7, определенных в более ранних исследованиях. Исходя из этого, каждый из гетеросахаридов должен содержать 1 галактозаминный, 5 глюкозаминных, 4 галактозных, 2 маннозных, 1 фукозный и 4N-ацетилнейраминовых остатка с общим молекулярным весом 3628 Да (3).
Расположение Сахаров в гетеросахариде и тип ковалентной связи гетеросахарида с белковой частью молекулы ТХП в настоящее время окончательно не определены (70).
В составе ТХП выделяют цепочки N-ацетиллактозаминового типа. Не редуцированные терминальные сахариды отличаются структурной гетерогенностью, но общая терминальная последовательность определяется как NeuAc (o2-3)Gal(/31-4)GlcNAc (84).
Имея в своем углеводном составе маннозные и галактозные окончания, Тамм-Хорсфалл протеин обладает способностью связывать Е. coli, препятствуя тем самым ее адгезии на уроэпителий (21).
Состав моносахаридов ТХП, выделенного из мочи здоровых людей и пациентов с почечной патологией варьирует. В белке Тамма-Хорсфалла, выделенном от здоровых людей, содержание N-ацетилгалактозамина оказалось более высоким, чем от пациентов с почечной патологией (табл. 4).
В группах пациентов с ИМП и гломерулонефритом наблюдалось также пониженное содержание N-ацетиглюкозамина. Белок, выделенный от пациентов с синдромом Бартера, обладал низким уровнем содержания маннозы и N-ацетилглюкозамина по сравнению с ТХП, выделенным от здоровых людей (81, 88).
От общего состава ТХП - 1% составляет липидный компонент (свободный и эфирный хлорэстерол - 0,15%; фосфолипиды - 0,26%) (3, 38).
Учитывая, что углеводная часть молекулы определяет способность ТХП связываться с адгезинами Е. coli, можно предположить, что при различных патологиях ингибирующее адгезию действие секретируемого белка может быть различным.
В литературе описаны различные способы выделения ТХП с помощью осаждения этанолом, осаждения в изоэлектрической точке при добавлении кислоты, осаждения с помощью бромида ацетилтриметиламмония, бензойной кислоты, хлористого натрия, а также при ультрафильтрации и даже обычном центрифугировании помутневшей при стоянии мочи. Наиболее удовлетворительные результаты дает метод получения ТХП путем высаливания его возрастающими концентрациями (до 0,58 М) хлористого натрия. При выдерживании мочи, к которой добавляют хлористый натрий, на холоду при периодическом встряхивании образуется полупрозрачный осадок, его отделяют центрифугированием. Полученный осадок растворяют в воде (примерно 0,01 часть первоначального объема) и диализируют против воды (периодически меняя ее) в течение нескольких дней. Весьма существенным для очистки ТХП является повторное осаждение 0,58М хлористым натрием с последующим диализом против воды. Полученный раствор содержит ТХП преимущественно в двух молекулярных формах из которых одна является тетрамером. В растворе находятся также более высокомолекулярные полимеры. При выдерживании в водном растворе на холоду в течение месяца более крупные молекулы ТХП постепенно диссоциируют на более мелкие. Диссоциацию можно ускорить добавлением к раствору гликопротеина небольших количеств солей, выдерживанием при комнатной температуре или разбавлением раствора водой. Добавление к раствору ТХП хлористого натрия до концентрации 0,03М приводит к тому, что более крупные молекулы ТХП осаждаются, в то время как небольшие молекулы остаются в растворе.
Среды, антибиотики и реактивы, используемые в работе
1. Измерение оптической плотности культур производили на колориметре фотоэлектрическом концентрационном КФК-2 МП при длине волны 530 нм;
2. Концентрирование белка производили на установке фирмы Amicon (США) укомплектованной ячейкой объемом .
3. Разделение материала на фракции и выделение белка в зависимости от величин молекулярных масс проводили методом мембранной фильтрации в ячейках Amicon с использованием мембран «Диафло» ( "Diaflo") марки РМ-30. ТХП выделяли по стандартной методике, описанной в 1950 г. I. Tamm и F. Horsfall (102) в нашей модификации.
Опытные образцы ТХП были получены путем солевого осаждения из суточной порции мочи мужчин после предварительного центрифугирования последней при 10.000 об/мин и удаления образовавшегося осадка. Осаждение ТХП включало суточное инкубирование отцентрифугированной мочи с хлоридом натрия (из расчета 33,93 гр NaCl на 1л мочи) при +2С с добавлением тиомерсала.
Осаждённый при насыщении до 0,85 М NaCl белок растворяли в 100 мл воды, концентрировали на мембране РМ-30 в диафильтрационной ячейке («Amicon») в атмосфере азота при давлении 20 пси (psi) и трижды промывали в тех же условиях дистиллированной водой и центрифугировали при 10.000 об/мин. Супернатант собирали и определяли концентрацию белка в нем методом Лоури (67). Полученные образцы сохраняли при -20 С с добавлением тиомерсала.
Тиражирование сыворотки к ТХП велось нами по следующей схеме (6). Двум кроликам - продуцентам в 4 точки был введен выделенный из мочи ТХП в дозе 100 мкг/кг живого веса в смеси с полным адъювантом Фрейнда. Через две недели животным внутривенно был введен преципитат, сформированный из референс- сыворотки и очищенного коммерческого ТХП. Для получения преципитата брались равные объемы реагентов (3 мл сыворотки и 3 мл ТХП). Через две недели от кроликов была получена сыворотка, с которой снова был сформирован преципитат к ТХП и введен тем же продуцентам.
С целью повышения специфичности иммунной сыворотки последующие реиммунизации кроликов проводили преципитатом, подготовленным следующим образом. Взятую от кроликов сыворотку предварительно сорбировали альбумином. Для этого готовился сорбент путём полимеризации альбумина в присутствии глютаральдегида. Полученный гель измельчали и промывали 10 раз физиологическим раствором с последующим центрифугированием. После последней промывки удаляли супернатант, а к осадку прибавляли трёхкратный объём сыворотки. Смесь инкубировали 3 часа при 37С и оставляли на 18 часов при температуре 4 С.
С адсорбированной сывороткой формировали преципитат, которым реиммунизировали продуцента. Процедуры взятия сыворотки, её сорбции, формирование специфического преципитата и реиммунизации им того же продуцента повторяли с интервалом в 3 недели.
Адгезия Е. coli на эпителиальные клетки мочевыводящего тракта и роль ТХП как протективного фактора
Тест систему (моноспецифическая сыворотка - эритроцитарный диагностикум) использовали для определения концентрации ТХП в образцах мочи.
Тест систему стандартизовали по чувствительности, используя в качестве стандартного препарата хроматографически очищенный ТХП. Для этого предварительно определяли максимальную степень разведения иммунной сыворотки, дающей агглютинацию с диапюстикумом на ТХП (см.2.2.5.1.) Предыдущее титру разведение сыворотки принимали за 2ГАЕ.
Реакцию нейтрализации антител проводили в микропланшетах для иммунологических реакций. Делали последовательные двукратные разведения стандартного ТХП, затем в каждую лунку добавляли иммунную кроличью сыворотку в дозе 2ГАЕ и антигенный эритроцитарный диагностикум в тех же объемах (25 мкл).
Реакцию учитывали по последнему разведению ТХП с выраженным отсутствием агглютинации. Полученные результаты принимали как показатель чувствительности системы. Он составил 7,6 мкг/мл. В последствии, при выполнении реакции с образцами мочи по такой тест системе можно было рассчитать исходную концентрацию искомого белка. Тест проводился с целью определить минимальное тормозящее разведение нативной мочи.
Реакция ставилась в микропланшетах для иммунологических реакций. Были сделаны последовательные двукратные разведения предварительно отцентрифугированной нативной мочи. Затем в каждую лунку добавлены 2ГАЕ иммунной кроличьей сыворотки и антигенный эритроцитарный диагностикум на ТХП в одинаковых объемах (25 мкл). Реакция учитывалась по последней лунке с выраженным отсутствием агглютинации. Реакции преципитации в геле.
Специфичность полученных сывороток к ТХП исследовали в иммунодиффузионном тесте - реакции преципитации по Оухтерлони (1,2). Оценивали идентичность сывороток, полученных нами от кроликов продуцентов с коммерческой референс сывороткой к ТХП, а также определяли наличие неспецифического компонента в выделенных нами образцах ТХП (в реакции с САЧ)
На отмытые от эмульсии обезжиренные и высушенные стекла от фотопластинок размером 6x9 см ровным слоем разливали горячий агар (4 мл на стекло). Толщина слоя агара равнялась 2мм. После застывания агара на каждой пластинке стандартными штампами прорезали лунки, из которых затем отсасыванием удаляли агар. В зависимости от цели эксперимента в соответствующие лунки вносили растворы: а) разных концентраций стандартного хроматографически очищенного ТХП; б) полученных сывороток от продуцентов; в) референс сыворотки; г) человеческого альбумина. Пластинки помещали во влажную камеру и через двое суток фиксировали образование полос преципитации.
После формирования преципитата пластины отмывали в течение трех суток гипертоническим раствором хлорида натрия, заливали 7% раствором уксусной кислоты и окрашивали кумаси, после чего производили отмывку красителя 7% уксусной кислотой.
Для проведения электрофореза использовали предметные стекла предварительно подготовленные как описано в п.2.2.5.5. Электрофоретическое разделение ТХП проводили на приборе ПЭФ-3, используя медипал-вероналовый буфер рН 8,2 и ионной силой 0,4. Градиент потенциала составлял 10 в/см, время электрофореза 3 часа. В качестве проявляющего агента использовали антисыворотку к ТХП, полученную нами на ранних сроках иммунизации кроликов продуцентов.
