Содержание к диссертации
Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
Техногенное загрязнение окружающей среды 11
Влияние засоления на высшие растения 23
1.2.1 Бактериально-растительное взаимодействие у 29
высших растений
Влияние засоления на микроорганизмы 34
Представители семейства Enterobacteriaceae 38 как возможные протекторы солевых стрессов
у растений
Глава 2 ОБЪЕКТЫ, МЕТОДЫ И УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ 45
ЭКСПЕРЕМЕНТОВ
Объекты исследования 45
Характеристика культур 46 2.2 Методы исследований 49
Методы культивирования бактерий и 49 питательные среды
Определение коэффициента насыщенности, 50 показателя текучести клеточных мембран и
состава жирных кислот бактерий Klebsiella planticola штамма ТСХА-91 и штамма ТСХА-91 Rif200
2.2.3 Микроскопические методы исследования. 51
Атомно-силовая микроскопия бактериальных
клеток Klebsiella planticola и Klebsiella
pneumoniae
Методика определения всхожести семян, длины 52 наибольшего листа и корней газонных трав по фону засоления (модельный опыт 1)
Методика определения аскорбиновой кислоты в 53 проростках газонных трав при инокуляции семян растений Klebsiella planticola по фону засоления (модельный опыт №2)
Методика определения всхожести семян, длины 54 наибольшего листа и корней газонных трав при инокуляции семян растений бактериями Klebsiella planticola и Klebsiella pneumoniae по фонуе засоления (модельный опыт №3)
Методика определения всхожести семян, длины 55 наибольшего листа и корней газонных трав при инокуляции семян растений Klebsiella planticola
по фону внесения регуляторов роста и засоления (модельный опыт №4)
Методика проведения вегетационного опыта по 57 определению выживаемости бактерий Klebsiella planticola в фитоплане газонных трав при почвенном засолении
Методика по изучению влияния Klebsiella 59 planticola на содержание кадмия в корнях и листьях капусты китайской сорта Ласточка по фону засоления и повышенной концентрации кадмия в почве
Цитофотометрический анализ клеток апикальной 60 меристемы корня райграса пастбищного сорта Дуэт при инокуляции растений Klebsiella planticola по фону различных концентраций хлорида натрия (модельный опыт №5)
Определение митотического индекса в меристеме 62 корней райграса пастбищного сорт Дуэт при действии Klebsiella planticola штамм ТСХА-91 в условиях засоления (модельный опыт 6)
Изучение некоторых иммунобиологических 62 свойств Klebsiella planticola штамм ТСХА-91 и Klebsiella pneumoniae 204
2 2 13 Статистическая обработка экспериментальных 64
данных
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ 65
3.1 Определение коэффициента насыщенности, 65
показателя текучести клеточных мембран и
состава жирных кислот бактерий Klebsiella
planticola штамма ТСХА-91 и штамма ТСХА-
91 Rif200
3.1.2 Атомно-силовая микроскопия бактериальных 70
клеток Klebsiella planticola и Klebsiella pneumoniae
3.2 Изучение действия бактерий рода Klebsiella 11
planticola и Klebsiella pneumoniae, а также
регуляторов роста на всхожесть, рост и
развитие газонных трав в условиях засоления
3.3. Изучение влияния Klebsiella planticola на 95
морфофизиологические показатели газонных
трав в условиях засоления
3.4. Исследование воздействия Klebsiella planticola 100
а на некоторые показатели качества газонных
трав, культивируемых в условиях засоления почвы
3.5. Изучение способности бактерий рода Klebsiella 110
усиливать резистентность организма к
стрессорным воздействиям
*
ВЫВОДЫ 117
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 119
ПРИЛОЖЕНИЕ 144
*
Введение к работе
Актуальность. В настоящее время проблема засоления почв, лимитирующая рост и продуктивность растений, приобретает все большее значение, как в условиях городов, так и в сельской местности. Во всем мире 950 млн. гектаров используемых почв являются засоленными и 77 млн. гектаров орошаются соленой водой (Epstein Е. et al., 1980).
Одной из крупных проблем озеленения больших городов является техногенное засоление почвы, вследствие использования противогололедных реагентов на дорогах в зимний период (Гладков Е.А., 2003; Калашникова О.В., 2003). Это приводит к нарушению экологической обстановки, гибели зеленых насаждений (деревьев и кустарников), изреженности и недолговечности газонов. По данным лаборатории солеустойчивости ИФР РАН только за 1999 год в Москве погибло 40000 деревьев и кустарников, что привело к резкому ухудшению экологической ситуации в городе: качество воздуха стало хуже, резко возрос уровень аллергических заболеваний, патологии органов дыхания, болезней крови (анемии). Поэтому, техногенное засоление почв в городской среде является важной проблемой. Разработка новых методов защиты растений от влияния солевого стресса в условиях крупных городов России стала чрезвычайно актуальна.
Среди методов ремедиации засоленных почв микробные биопрепараты пока еще не нашли широкого распространения.В настоящее время для ремедиации земель используют агротехнические мероприятия, вывоз фунта или его полную замену, что требует больших экономических затрат и полностью не решает проблему восстановления почв. Техногенное загрязнение окружающей среды в городах носит комплексный характер. Происходит не только засоление почв, но и их загрязнение тяжелыми металлами, нефтепродуктами. Это оказывает стрессорное действие на растения.
В последние годы для защиты растений от воздействия стрессорных факторов окружающей среды стали активно использовать микробиологические методы С этой целью начали применять биопрепараты, основу которых составляют различные микроорганизмы, относящиеся к родам- Aeromonas, Alcahgenes, Azospinllum, Azotobacter, Bacillus, Klebsiella, Pseudomonas, Xanthobacter (Емцев B.T., 1994, Голодяев Г.П , 1997, 1998, 1999, 2000, 2002, Станкевич Д С , 2002, Егоров С Ю , 2003, Белимов А А, 2004; Архипова Т Н с соавтр, 2004, Hirano Shin-ichi et al, 2004) Главным преимуществом метода биоремедиации является длительность действия и гармонизация биосферы Данный метод признан дешевой и безвредной технологией очистки почв от различных поллютантов, не наносящей дополнительный ущерб окружающей среде. (Автухович ИЕ 2003). Биоремедиация включает в себя фиторемедиацию, фитостабилизацию, компостирование, использование различных биосмесей и микробных биопрепаратов, реакционные системы очистки, контролируемое естественное разложение
Участие микроорганизмов в снятии стрессорного воздействия засоления на растения до настоящего времени исследовалось недостаточно Это и определило цель и задачи настоящего исследования
Целью исследования было изучение протекторного действия бактерий рода Klebsiella на газонные травы в условиях засоления почвы
В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи: 1. Изучить влияние бактерий рода Klebsiella (Klebsiella planticola и Klebsiella
pneumoniae) на рост и развитие газонных трав в условиях засоления 2 Исследовать совместное воздействие К planticola и биологически
активных веществ (регуляторов роста) на газонные травы в условиях
засоления 3. Изучить приживаемость К planticola при инокуляции семян газонных трав
в условиях засоления почвы
Определить влияние К. planticola на морфофизиологические показатели газонных трав в условиях засоления.
Изучить влияние К. planticola на некоторые показатели качества газонных трав, культивируемых в условиях засоления почвы.
Изучить роль К. planticola на содержание кадмия в различных растениях под влиянием засоления и загрязнения почвы кадмием.
Научная новизна. Впервые установлен протекторный эффект
инокуляции бактериями рода Klebsiella (К. planticola и К. pneumoniae)
газонных трав, культивируемых в условиях засоления. Выявлено неизвестное
ранее для К. pneumoniae свойство обеспечивать нормальный рост растений в
условиях высокой концентрации хлорида натрия. Инокуляция семян газонных
трав бактериями совместно с обработкой регуляторами роста растений (6-
БАП, крезацин) способствует взаимному усилению роста растений по фону
засоления. Инокуляция растений бактериями оптимизирует
морфофизиологические показатели растений газонных трав, увеличивает количество митозов в апикальной части корня, что приводит к менее интенсивному падению митотического индекса в условиях засоления. Протекторный эффект бактеризации газонных трав в условиях засоления хлоридом натрия обусловливает также повышение содержания в растениях пролина. Кроме того, установленная способность Klebsiella planticola проникать в растения, что по-видимому, способствует активизации защитных механизмов, повышающих иммунный статус растений, что позволяет им проявить устойчивость к засолению.
Впервые выявлено, что в условиях засоления почвы инокуляция бактериями газонных трав способствует снижению содержания кадмия в растениях.
Практическая значимость. Результаты проведенной работы позволяют сделать заключение, что бактерии рода Klebsiella, оказывают многогранное воздействие на растения газонных трав, способствуют их солеустойчивости и могут быть рекомендованы для защиты от солевого стресса как при использовании противогололедных реагентов в городской среде, так и в
сельскохозяйственной практике. Кроме того, полученные данные позволяют использовать бактерии К. planticola для стимуляции роста растений в условиях загрязнения почвы кадмием.
При подборе штаммов бактерий, устойчивых к стрессорам-противогололедным реагентам, тяжелым металлам и ксенобиотикам следует учитывать наличие повышенного коэффициента насыщенности жирных кислот и снижение показателя текучести клеточных мембран бактерий, позволяющие считать, что данный штамм бактерий способен адаптироваться к экстремальным факторам среды.
По итогам исследований получен патент РФ № 2189155 от 20 сентября 2002 года, подана заявка на изобретение № 2004119090 от 24 июня 2004 года
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на Международной научной конференции молодых ученых «Молодые ученые -аграрной науке», посвященной 140-летию Российского государственного аграрного университета - МСХА им. К.А. Тимирязева (Москва, 2005), VIII Международном симпозиуме молодых ученых, аспирантов и студентов «Техника экологически чистых производств в XXI веке: Проблемы и перспективы» (Москва, 2004), Всероссийской научно-практической конференции "Медицинская микробиология - XXI век" (Саратов, 2004), 11-th International Congress on molecular plant-microbe interactions (С-Петербург, 2003), V Международном Симпозиуме "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования" (Пущино, 2003).
Работа удостоена звания лауреата конкурса Правительства Москвы "Гранты Москвы" в области наук и технологий в сфере образования, в номинации - "Аспирант-2004".
Объем работы. Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста и включает в себя следующие разделы: введение, обзор литературы, описание объектов и методов исследования, результаты и обсуждение, выводы и список литературы, включающий 217 наименования, в том числе 96 зарубежных авторов, приложения. Диссертация иллюстрирована 20 таблицами и 9 рисунками.
Работа выполнена в 2001-2005 году на кафедре микробиологии РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева.
Автор выражает признательность и благодарность научному руководителю, профессору, д.б.н. В.Т.Емцеву, сотрудникам кафедры микробиологии РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, за помощь при проведении исследований. Автор благодарит д.б.н. Г.А.Осипова за помощь при проведении хроматографических исследований. Особую благодарность автор хотел бы выразить д.м.н. Е.А.Курбатовой, заведующей лаборатории терапевтических вакцин НИИ вакцин и сывороток имени И.И.Мечникова, за предоставленную возможность проведения опытов по иммунологии и методические рекомендации. Автор сердечно благодарит д.б.н. Н.А.Голубкину за помощь в проведение биохимических исследований. Также автор выражает огромную благодарность д.б.н. В.Ю.Полякову и к.б.н. Н.В.Кононенко за поддержку при проведении цитофотометрицеского анализа и определения митотического индекса. Автор выражает глубокую признательность сотрудникам кафедры агрохимии, цветоводства, селекции и почвоведения за помощь в проведении вегетационного опыта. Автор хотел бы выразить свою благодарность профессору Н.П.Панову за ценные рекомендации при проведении вегетационного опыта. Также автор благодарит А. А. Ломоносова за помощь в проведении атомно-силовой микроскопии.
