Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Почва как среда обитания микроорганизмов 8
ГЛАВА 2. Методы исследования сообществ почвенных микроорганизмов 10
2.1. Традиционные микробиологические методы исследования 10
2.1.1. Методы иммунодиагностики 10
2.2. Молекулярные методы исследования сообществ. .11
2.2.1. Определение ГЦ состава молекул ДНК 12
2.2.2. ДНК реассоциация 12
2.2.3. Методы на основе секвенирования нуклеиновых кислот 13
2.2.4. Методы молекулярного мониторинга сообществ на основе ПЦР-анализа 15
2.2.4.1. ГГЕ-анализ. 15
2.2.4.2. Молекулярный фингерпринтинг на основе рестриктазной обработки фрагментов. 17
2.2.4.3. Модификации ПЦР-анализа со специфичными зондами и праймерами. 17
2.2.4.4. ПЦР со случайными праймерами 18
2.2.5. Методы, основанные на гибридизации нуклеиновых кислот 19
2.3 Факторы, влияющие на точность молекулярных исследований. .20
2.3.1. Выделение ДНК 20
2.3.2. Ограничения ПЦР анализа 22
2.3.3. Ограничения использования ДГЕ-анализа 23
2.3.4. Ограничения рестрикционного анализа 23
2.3.5. Ограничения методов In situ гибридизации 24
2.4. Системный подход в исследованиях микробных сообществ. 24
2.4.1. Анализ состава жирных кислот 26
2.4.2. Определение физиологического профиля сообщества (Biolog) 26
2.4.3. Анализ проб со стабильными изотопами 27
2.4.4. Методы клонирования тотального генома сообщества 28
2.4.5. Анализ функциональных генов 28
ГЛАВА 3. Разнообразие азотфиксирующих микроорганизмов 30
3.1. Значение биологической фиксации атмосферного азота . 30
3.2. Строение и регуляция нитрогеназного комплекса 31
3.3. Гены нитрогеназного комплекса. 34
3.4. Разнообразие азотфиксирующих микроорганизмов в природных экосистемах. 37
3.5. Краткая характеристика аноксигенных фотосинтезирующих микроорганизмов. 43
3.6. Некоторые аспекты проблемы фиксации азота в болотных экосистемах.. 46
Заключение 48
Объекты и методы исследования 50
1. Объекты исследования 50
2. Получение препаратов ДНК 54
2.1. Получение препаратов ДНК из биомассы микроорганизмов. 54
2.2 Получение препаратов ДНК из почвенных образцов. 54
2.2.1. Прямая экстракция нуклеиновых кислот из почвенных образцов 54
2.2.2. Получение препаратов ДНК из почвенных образцов через стадию выделения бактериальных клеток 57
3. ПЦР-амплификация 59
3.1. Амплификация генов 16S рРНК. 59
3.2. ПЦР со специфичными праймерами к гену nifH. 59
4. Очистка фрагментов пцр в агарозе 60
5. Клонирование пцр-фрагментов 60
5.1. Приготовление компетентных клеток . 60
5.2. Лигирование. 61
5.3. Трансформация клеток плазмидной ДНК. 62
5.4. Селекция трансформированных колоний и выделение плазмидной ДНК. 63
5.5. Рестрикционный анализ плазмидной ДНК. 63
6. Секвенирование 63
6.1. Мечение праймеров. 63
6.2. Постановка реакции секвенирования и форез. 64
7. Анализ полученных последовательностей 64
Результаты и обсуждение 66
1 Разработка экспресс-метода выделения днк из почвенных образцов 66
1.1. Метод прямой экстракции нуклеиновых кислот из почвенного образца 66
1.2. Получение препаратов ДНК через стадию выделения фракции бактериальных клеток . . 70
2. Изучение последовательностей генов /v/fh различных представителей аноксигенных фототрофов и близких к ним микроорганизмов 80
2.1. Выявление и анализ последовательностей фрагментов генов nifH у аноксигенных фототрофных микроорганизмов. 81
2.2. BLAST-анализ полученных последовательностей генов nifH. 82
3. Сравнение молекулярных, серологических и микроскопических методов для характеристики микробных сообществ 103
3.1. Микроскопический и серологический анализ. 104
3.2. Молекулярный анализ 106
4. Анализ диазотрофного сообщества кислой торфяной почвы сфагнового
Верхового болота 112
Выводы: 127
Список литературы
- Традиционные микробиологические методы исследования
- Методы молекулярного мониторинга сообществ на основе ПЦР-анализа
- Значение биологической фиксации атмосферного азота
- Приготовление компетентных клеток
Введение к работе
Актуальность темы. Микробные сообщества являются важнейшими компонентами различных экосистем и играют решающую роль в метаболизме органической материи и в биогеохимической трансформации элементов, включая процесс фиксации атмосферного азота. Азотфиксация - главное звено в цикле азота, так как именно этот процесс лимитирует все остальные этапы превращения азота в биогеохимическом цикле. Способность к биологическому связыванию атмосферного азота присуща только представителям мира прокариот. Азотфиксирующие микроорганизмы присутствуют практически во всех экосистемах и способствуют их обогащению связанными формами азота. При этом распределение таких прокариот по различным экоценозам неоднородно и до сих пор еще мало изучено.
Одной из преобладающих наземных экосистем в бореальной зоне Евразии и Северной Америки являются кислые торфяные болота. Они занимают свыше 3% общей земной поверхности, а в России болота и заболоченные бореальные почвы распространены более чем на 20% территории (Dedysh et al., 2006). При этом данные экосистемы играют значительную биосферную и средообразующую роль, являясь, в частности, резервуарами связанных форм углерода и азота. Хотя в последние десятилетия интерес исследователей к проблеме фиксации азота в болотных экосистемах возрос, микробиология этого процесса еще очень мало изучена. Известно только, что азотфиксирующие микроорганизмы в торфяных почвах содержатся в значительном количестве, а исследований, посвященных определению биоразнообразия диазотрофов в болотных почвах и выявлению их азотфиксирующего потенциала, до настоящего времени не проводилось.
Для анализа природных микробных популяций в последнее время широко применяют методы молекулярной экологии. При этом выявление микроорганизмов, выполняющих определенную функциональную роль в экосистеме, проводят с помощью детектирования генов-маркеров. Метод, основанный на сравнительном анализе последовательностей генов nifH, стал наиболее популярным для исследования биоразнообразия азотфиксирующих сообществ. Ген nifH кодирует один из компонентов нитрогеназы, являющейся ключевым ферментом азотфиксации. Этот подход, в отличие от метода, основанного на анализе нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК, позволяет достаточно полно определить видовой состав сообщества, обладающего
азотфиксирующим потенциалом. Использование гена nifii для анализа диазотрофных микробных сообществ имеет ряд преимуществ, основным из которых является достаточно большая база данных, содержащая уже более 9000 последовательностей.
Таким образом, изучение биоразнообразия азотфиксирующих прокариот в различных природных экосистемах относится к важнейшим задачам микробной экологии. При этом именно современные молекулярно-биологические подходы, обладающие высокой разрешающей способностью, позволяют проводить наиболее полный анализ разнообразия микроорганизмов в природных сообществах.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось проведение анализа биоразнообразия азотфиксирующих прокариот микробных консорциумов болотных почв с помощью методов молекулярной экологии.
Задачи исследования состояли в следующем:
Разработка эффективного и быстрого метода выделения пригодной для ПЦР-анализа тотальной ДНК из различных почвенных сообществ.
Определение первичных последовательностей генов nifH фототрофных микроорганизмов, не представленных в базе данных.
Сравнение эффективности анализа последовательностей генов nifH и других методов для изучения биоразнообразия микробных сообществ.
Применение анализа последовательностей генов nifH для изучения состава азотфиксирующего сообщества торфяной болотной почвы.
Научная новизна работы. Разработан универсальный экспресс-метод выделения ПЦР-пригодной ДНК, позволяющий получать препараты из почв, существенно различающихся по своим физико-химическим характеристикам, в том числе с низкими значениями рН и богатых органическими веществами.
Впервые проведено исследование разнообразия азотфиксирующих микроорганизмов кислой торфяной болотной почвы с помощью анализа генов nifH. Показано наличие микроорганизмов, относящихся к а-, у- и 5-Протеобактериям, группе аноксигенных нитчатых фототрофных бактерий (АНФБ), зеленых серных бактерий. Впервые в кислых торфяных почвах выявлены микроорганизмы, близкие к родам Azospirillum и Oscillochloris, что расширяет список мест их обитания.
По результатам работы в базу GenBank депонированы 25 последовательностей генов nifH, принадлежащих различным микроорганизмам, и проведен их сравнительный анализ. Показано, что некоторые последовательности генов nijH неидентифицированных микроорганизмов, представленные в базе данных GenBank, относятся к фотосинтезирующим бактериям.
Практическая значимость работы. Разработанный метод в силу своей универсальности может применяться при проведении сравнительного анализа биоразнообразия микроорганизмов, обитающих в различных типах почв.
Расширение базы данных последовательностей генов ntfH позволит создавать более специфичные зонды для выявления и мониторинга конкретных групп микроорганизмов, их количественной оценки. Депонированные последовательности описанных микроорганизмов позволят проводить более точный анализ состава микробных сообществ.
Полученные результаты расширяют представление о таксономическом разнообразии азотфиксирующих бактерий в кислых торфяных почвах.
Апробация работы. Материалы диссертации бьши доложены на 9 Международном симпозиуме по азотфиксации (Левен, Бельгия, 2002), 8 Международном симпозиуме по биогеохимии болотных почв (Гент, Бельгия, 2003), представлены на 6 Европейской конференции по азотфиксации (Тулуза, Франция, 2004) и Международной конференции «Экологические проблемы северных регионов и пути их решения» (Апатиты, Россия, 2004).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи и 5 тезисов в сборниках работ российских и зарубежных конференций.
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 150 страницах машинописного текста и включают 15 рисунков, 16 таблиц, 1 диаграмму. Диссертация состоит из разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Экспериментальная часть" (включающая главы "Объекты и методы исследования", "Результаты и обсуждение"), "Выводы" и "Список литературы", который содержит 26 отечественных и 253 иностранных наименования.
Традиционные микробиологические методы исследования
Классическим подходом для изучения разнообразия микроорганизмов в природных сообществах являются культуральные методы, основанные на выделении изолятов, с последующим изучением их физиологических или биохимических свойств. При этом суспензия клеток, полученная из природного образца, после серии разведений высевается на твердую среду. После инкубации в течение определенного времени, проводится подсчет образовавшихся колоний. Однако этот метод имеет значительные ограничения и не позволяет в полной мере оценить состав и разнообразие микроорганизмов в природном сообществе, так как очень малая часть прокариот (от 0,1 до 10% от общего количества) может быть культивирована (Ward et al., 1992). Большинство жизнеспособных клеток микроорганизмов, наблюдаемые при микроскопировании, не формируют колоний на культуральной среде (Eilers et al., 2000). Данные методы могут использоваться только для исследования культивируемой фракции природного микробного сообщества, что, однако, по мнению некоторых исследователей, является очень важным экологическим признаком (Hattori et al., 1997). В последнее время были разработаны и успешно применены новые культуральные методы (Button et al., 1993; Brims et al., 2002; Connon & Giovannoni, 2002), позволившие выделить в чистые культуры представителей таких групп как Acidobacteria, Actinobacteria, Verrucomicrobia, и других микроорганизмов, ранее детектированных молекулярными методами (Janssen et al., 2002; Sait et al., 2002).
Использование флуоресцентной микроскопии для определения количества клеток микроорганизмов дает во много раз больше информации, чем подсчет колоний (Johnsen et al., 2001). Однако данный подход не позволяет оценить видовой состав сообщества, а также некоторые красители не дифференцируют жизнеспособные и мертвые клетки.
Методы серодиагностики (иммунодиагностики) широко применяются для дифференциации и идентификации микроорганизмов, в первую очередь в эпидемиологии. Перспективны они и в экологических исследованиях природных микробных сообществ. Однако, информация о специфичности иммунных сывороток к различным группам микроорганизмов обширна, но зачастую весьма противоречива. В некоторых группах и штаммах выделены четкие серовары, каждый из которых характеризуется наличием одного общего антигена. Такие группы легко идентифицируются с помощью моноклональных антител. Другие, казалось бы, родственные штаммы не обладают одним общим антигеном и потому диагностируются только при использовании целого набора моноклональных антител, т.е. поликлональными антителами (иммуносыворотками) (Гальченко, 2001).
В использовании данного метода при определении видового состава сообщества основным недостатком является ограниченное количество видоспецифичных антител. Однако, для выявления разнообразия какой-либо определенной группы микроорганизмов, в частности метанокисляющих бактерий, метод иммунодиагностики был разработан (Кондратенко и др., 1981) и успешно применен как для анализа водных природных метанотрофных сообществ (Galchenko, 1995), так и наземных экосистем (Vecherskaya et al., 1993). Прямое микроскопическое определение количества МОБ с помощью иммунологической процедуры дает важную информацию о составе сообщества in situ, однако, получение антител ограничивается необходимостью иметь чистые культуры метанотрофов. В результате не представляется возможным анализировать те МОБ, сыворотки к которым отсутствуют, что также ограничивает разрешающую способность данного метода.
Молекулярные методы исследования сообществ.
Появление и развитие молекулярных методов позволило изучать микробиологические сообщества без культивирования организмов. Данный подход выявил огромное количество новых, не описанных ранее традиционными методами прокариот в окружающей среде (Расе, 1997). В последнее время было разработано много методов, обладающих высокой разрешающей способностью и позволяющих выявлять не только активные живые клетки, но и микроорганизмы, находящиеся в покоящихся формах.
Наиболее популярные методы, используемые при исследовании микробных сообществ, можно разделить на три основных группы: 1. подходы, основанные на секвенировании нуклеиновых кислот 2. подходы, основанные на ПЦР-диагностике 3. подходы, основанные на гибридизации ДНК.
Методы молекулярного мониторинга сообществ на основе ПЦР-анализа
Некоторые модификации ПЦР-анализа (nested-ПЦР) позволяют в некоторой степени увеличить чувствительность и специфичность метода. При таком подходе первоначально проводится амплификация с универсальными праймерами, а затем - с видо- или группоспецифичными внутренними праймерами на амплификате из предыдущего раунда. Данный подход позволяет выявить минорные компоненты сообщества, которые часто не обнаруживаются при обычном ПЦР (Burgmann et al., 2001).
Использование ПЦР в реальном времени позволяет провести количественную оценку определенных микроорганизмов в природном сообществе (Kolb et al., 2003). В отличие от других модификаций количественного ПЦР анализа, данный подход дает возможность избежать неточности, возникающие при конечном анализе результатов, когда в ходе ПЦР может получиться различное количество продукта при равном количестве в начале реакции (Becker et al., 2000).
Полимеразно-цепная реакция с обратной транскриптазой позволяет выявить метаболически активную часть микробного сообщества. Данный подход был использован для оценки экспрессии конкретных генов в различных природных сообществах (Noda et al., 1999; Zani et al., 2000). Использование РНК вместо ДНК имеет свои преимущества, так как меньший размер молекулы РНК позволяет применять более грубые методы обработки образцов при выделении.
Кроме того, совсем недавно был разработан метод, основанный на интегрон-нацеленной ПЦР оценке, позволяющий выявлять новые гены из тотальной ДНК сообщества (Stokes et al., 2001). При этом нет необходимости в предварительном знании нуклеотидной последовательности данных генов, так как ПЦР осуществляется с праймерами, комплементарными рекомбинационному сайту, фланкирующему конкретный ген интегрона.
В последнее время в молекулярной экологии используют также методы молекулярного фингерпринтинга, основанные на амплификации со случайными праймерами (RAPD-ПЦР, DAF-n4P)(Hadrys et al., 1992; Breen et al., 1995). При этом генерируется набор ПЦР-фрагментов различной длины (фингерпринт), который затем разделяется в процессе гель-электрофореза. Хотя эти методы и могут использоваться для выявления структуры сообщества и детекции изменений в его составе, они дают очень мало информации о видовом разнообразии сообщества. Кроме того, есть еще ограничения техническими условиями проведения экспериментов: результат амплификации сильно зависит от качества (чистоты и среднего размера) ДНК и от особенностей условий проведения ПЦР (тип амплификатора, состав реакционной смеси, тип ДНК полимеразы).
Методы гибридизации нуклеиновых кислот также получили широкое распространение в молекулярно-экологических исследованиях микробных сообществ. В основе этих методов лежит возможность использования отдельных участков нуклеотидных последовательностей генов в качестве генетических маркеров (зондов). Длина такой последовательности варьирует в диапазоне от 20 до 1000 нуклеотидов, причем зонды до 50 нуклеотидов синтезируются искусственным путем, а зонды большего размера получают клонированием требуемого фрагмента. Гибридизация таких маркеров с исследуемой ДНК свидетельствует о наличии гомологичных участков у исследуемых объектов и позволяет с большой достоверностью идентифицировать исследуемые микроорганизмы, либо предсказывать функции исследуемых белков (Amann et al., 1995). Данные подходы позволяют детектировать и подсчитывать относительное преобладание отдельных видов или родов микроорганизмов в различных микробных сообществах. К настоящему моменту уже разработаны зонды как для высших таксонов микроорганизмов (царство, подцарство, класс, подкласс) (Manz et.al., 1992), так и для целого ряда родов и видов, что позволяет одновременно проводить "иерархический" анализ популяций, т.е. определять принадлежность членов изучаемого сообщества к различным филогенетическим группам на различных таксономических уровнях.
Кроме указанных выше преимуществ, в последнее время усовершенствовалась сама техника проведения гибридизации нуклеиновых кислот. Радиоактивные метки теперь заменяются хемолюминисцентными или афинными, что значительно продлевает срок службы самих зондов. Развитие методов гибгидизации in situ (Poulsen et.al., 1993) упрощает использование зондов, так как в этом случае нет необходимости выделять нуклеиновые кислоты, что существенно сокращает трудоемкость, время проведения и стоимость такого анализа. А также позволяет избежать некоторого искажения результатов, возникающего после выделения ДНК. С помощью данного подхода можно определять не только морфологию и численность клеток некультивируемых организмов, но и их пространственное распределение. Таким образом, были исследованы бактериальные популяции, составляющие активные илы (Sekiguchi et al., 1999) и биопленки (Kalmbach et al., 1997). А также определена филогенетическая принадлежность эндосимбионтов простейших (Embley et al., 1992) и магнетотаксических бактерий (Spring et al., 1993).
В последнее время развивается технология использования ДНК микрочипов, позволяющая проводить одновременную гибридизацию с десятками и даже сотнями зондов, что существенно ускоряет процесс исследования (Yershov et. al., 1996). Эти подходы с успехом используются как для изучения микробных сообществ (Guschin et al., 1997; Bonch-Osmolovskaya et al., 2003), так и для детекции определенных генов и даже точечных мутаций (Dubiley et. al., 1999).
В целом методы гибридизации достаточно эффективны, менее трудоемкие и значительно дешевле по сравнению с прямым секвенированием. Однако использование этих методов требует аккуратного выбора зондов, тщательного подбора условий гибридизации и проверки перекрестной гибридизации с близкородственными микроорганизмами во избежание появления ложных сигналов. Постоянное пополнение базы нуклеотидных последовательностей генов способствует развитию методов гибридизации, так как позволяет использовать участки этих последовательностей в качестве зондов. Таким образом, определение in situ микроорганизмов, составляющих природное сообщество, наряду с методами прямого секвенирования генов, являются основными при анализе микробных сообществ. Однако именно методы молекулярной гибридизации позволяют дать количественную оценку состава популяций и являются мощным вспомогательным инструментом.
Значение биологической фиксации атмосферного азота
Связывание азота — это восстановительный процесс, и первым его продуктом, который можно обнаружить, является аммиак. В 1960 году Карнахан с сотрудниками провёл первый удачный опыт по восстановлению азота до аммиака экстрактом клеток Clostridium pasteurianum (Готтшалк, 1982). Ферментная система, катализирующая эту реакцию, была названа нитрогеназной. Несмотря на то, что представители азотфиксаторов из разных родов используют широкий спектр метаболических стратегий, наличие нитрогеназного комплекса, ответственного за редукцию N2, является для них общей чертой.
В настоящее время у бактерии и архей обнаружено 4 типа нитрогеназной системы (Siemann et al., 2002). Первые три системы имеют много общего и различаются по содержанию металла в активном сайте связывания N2. Наиболее изученной из них является молибденовая нитрогеназная система, содержащая Мо в активном центре, и являющаяся продуктом генов nif. У других систем молибден не обнаружен. Это — ванадий зависимая нитрогеназа (уи/"тены), содержащая ванадий вместо молибдена в качестве ко-фактора, и альтернативная нитрогеназная система (anf-гены), которая не содержит ни молибдена, ни ванадия, и является только железосодержащей нитрогеназой. До недавнего времени считалось, что только в отсутствие молибдена начинается экспрессия ванадиевой нитрогеназы, и только при отсутствии и молибдена и ванадия включается альтернативная нитрогеназная система (Lyons & Thiel, 1995). Однако дальнейшие исследования показали, что в ряде случаев экспрессия альтернативной нитрогеназы происходит независимо от присутствия молибдена (Jacobitz & Bishop, 1992).
Четвертым типом нитрогеназы является не так давно описанная еще одна нитрогеназная система (Ribbe et al., 1997), обнаруженная у Streptomyces thermoautotrophicm. Эта нитрогеназная система состоит из двух белковых компонентов. Один компонент, СО-дегидрогеназа, окисляет СО до СОг и редуцирует Ог до супероксидного радикала (Ог ). Второй компонент — марганец-зависимая оксидоредуктаза окисляет радикал 0{ , обеспечивая перенос электрона на N2 . Этот организм был выделен из необычного СО-богатого источника, и поэтому распространение в природе такой кислород - устойчивой нитрогеназы пока не известно.
Первые три нитрогеназных системы состоят из двух обратимо диссоциирующих компонентов: динитрогеназного компонента, содержащего сайты субстратной редукции (компонент 1) и нитрогеназно-редуктазного компонента (компонент 2), являющегося облигатным донором электронов для компонента 1. Компонент 1 молибденовой нитрогеназы является продуктом генов ni/D и mJK и состоит из четырех субъединиц, формирующих ci2p2 тетрамер. У альтернативной нитрогеназы в состав компонента 1 входит еще небольшая добавочная субъединица, формирующая гексамерную структуру. Каждый тетрамер состоит из двух пар кластеров: железо-молибденового кофактора (FeMo-co), содержащего 7 атомов железа, 9 атомов серы, один атом молибдена и Р кластера, содержащего 8 атомов железа и 7 атомов серы [8Fe7S]. Нитрогеназа-редуктаза (компонент 2) является продуктом гена niJR и представляет собой димер, состоящий из двух идентичных субъединиц, между которыми находится [4Fe4S] кластер. Также компонент 2 содержит два сайта связывания MgATO, по одному на каждой субъединице (Igarashi & Seefeldt, 2003).
Реакция фиксации молекулярного азота, катализируемая нитроіеназой имеет следующий вид: N2 + 8е_ + 16АТФ + 8Н+ -» 2NH3 + 16АДФ + 16Pi + Н2
Компонент 2 нитрогеназы, являясь облигатным донором электронов для компонента 1 (Mo-Fe-комплекса), поддерживает субстратную редукцию, которая осуществляется во время кратковременной ассоциации между двумя компонентами и сопряжена с гидролизом MgATO в компоненте 2 (Fe-белке). Необходимость в MgATO при нитрогеназной реакции была отмечена еще в 1960-х годах (Mortenson L.E., 1964), а дальнейшие работы показали, что компонент 2 нитрогеназы образует две связи с MgATO, по одной с каждой субъединицей. Образование этих связей вызывает конформационные изменения в Fe-белке: две субъединицы поворачиваются по направлению друг к другу, вытесняя [4Fe4S] кластер к поверхности белка. Затем происходит ассоциация двух компонентов нитрогеназы, предположительно через Р-кластер компонента 1 и [4Fe4S] кластер компонента 2. Эта ассоциация инициирует целую цепь событий: активируется гидролиз MgATO и происходит передача электрона от Fe-белка к компоненту 1 нитрогеназы (Igarashi & Seefeldt, 2003). Вопрос о том, как связывание или гидролиз MgATO обеспечивают транспорт электрона, является одним из главных вопросов в механизме работы нитрогеназной системы. Несмотря на взаимосвязь между гидролизом MgATO и передачей электрона, эти два события могут происходить и вне зависимости друг от друга (Lanzilotta et al., 1996). Однако, скорость передачи электрона значительно возрастает, когда происходит гидролиз MgATO, что свидетельствует о взаимовлиянии этих двух событий. Очевидно, что гидролиз MgATO осуществляется для увеличения скорости переноса электронов от компонента 2 к компоненту 1 нитрогеназы. Детали как гидролиз MgATO влияет на скорость транспорта электрона до конца пока не ясны. Предполагают, что это может происходить через конформационные изменения, индуцируемые в нитрогеназном комплексе (Igarashi & Seefeldt, 2003).
После передачи электрона происходит диссоциация двух компонентов нитрогеназы. Существует предположение, что прежде чем осуществиться диссоциация, может произойти несколько раундов передачи электрона (Duyvis et al., 1997). Однако многочисленные работы отмечают необходимость диссоциации компонентов нитрогеназного комплекса после каждого события передачи электрона (Hageman and Burris, 1978; Lanzilotta et al., 1996). Предположительно диссоциация происходит после гидролиза АТФ в конце каталитического цикла Fe-белка, из-за уменьшения афинности к компоненту 1. Также есть предположение, что энергия, освобождающаяся при гидролизе АТФ, непосредственно обеспечивает диссоциацию нитрогеназного комплекса (Kurnikov etal.,2001).
Согласно общепринятой модели акцептором электрона, переданного от Fe-белка компонента 2, служит Р кластер, который передает электрон на Fe-Mo-кофактор компонента 1. При наличии Fe-белка, К АТФ, редуцируемого субстрата и компонента 1 начинается субстратная редукция. Однако при отсутствии подходящего субстрата, протоны редуцируются с образованием Нг.
Наиболее часто используемые субстраты, редуцируемые нитрогеназой: N2, Н+, N2H4, Ыз", Н2С=С=СН2, метил изоцианид, цианид, ацетилен, этилен, N2O, CS2 (Burgess & Lowe, 1996). Оксид углерода (СО) сильный ингибитор реакций субстратной редукции нитрогеназы, однако протон редукция при этом не прекращается (Hardy et al, 1965).
Для редукции N2 и других субстратов на MoFe-белке компонента 1 необходимо два или более раундов гидролиза МдАТФ, передачи электрона, диссоциации компонентов нитрогеназы. Это свидетельствует о том, что MoFe-белок должен обладать способностью аккумулировать электроны. Где и как происходит накопление электронов также еще пока не совсем ясно.
Приготовление компетентных клеток
Лигирование проводили в 20 мкл лигазной смеси следующего состава: Т4 -ДНК лигазный буфер (30 мМ трис-HCl, рН 7.8; 10 мМ MgCh; 10 мМ дитиотриэтола (ДТТ)); 1 мМ аденозинтрифосфата (АТФ); 5% полиэтиленгликоля (ПЭГ6000); 50 нг вектора pGEM, 3 ед. Т4-ДНК лигазы, 20 мкг ПЦР-продукта. Смесь тщательно перемешивали и инкубировали в течение двух часов при 25С.
К 100 мкл компетентных клеток, находящихся на ледяной бане, добавляли 20 мкл лигазной смеси и инкубировали смесь в течение 1 часа во льду. Далее клетки подвергали тепловому шоку при температуре 42С в течение 1,5 мин и охлаждали до комнатной температуры. Затем добавляли 800 мкл жидкой среды LB и помещали в термостат на 45 минут при t 37С. По окончании инкубации суспензию клеток рассевали на чашки с агаризованной средой LB, содержащей 50 ед/мл ампициллина, 50 мкг/мл изопропил P-D тиогалактопиранозида (IPTG) и 40 мкг/мл х-галактозы (X-GAL) для цветной селекции клонов. Клетки выращивали при 137С в течение 12 часов.
Для контроля компетентности клеток проводили трансформацию с интактной плазмидой pGEM-SZf , имеющей ген устойчивости к ампициллину, по методике, описанной выше. В качестве контроля чистоты эксперимента осуществляли посев нетрансформированных клеток на ту же среду.
Колонии, содержащие вставку (белого цвета) пересевали на агаризованную среду LB и инкубировали при t 37С в течение 12 часов. После инкубации небольшое количество биомассы отбирали и ресуспендировали в 100 мкл буфера I (50 мМ трис-НС1, рН 8.0; 10 мМ EDTA; 50 мкг/мл панкреатической РНКазы). Далее добавляли буфер II (0,2М NaOH; 1% SDS) и аккуратно перемешивали. Затем добавляли буфер III (2.5 мМ ацетата калия, рН 4.5), вновь перемешивали и центрифугировали 8 мин при 10000 g. Супернатант переносили в чистую пробирку и проводили очистку на смоле Wizard MaxiPrep как описано выше. Полученные препараты плазмидной ДНК хранили при -18С.
Для выявления химерных клонов, содержащих вставку отличающегося от ожидаемого размера амплификационного фрагмента, проводили рестрикционный анализ, с помощью рестриктазы Pvu И. Рестрикцию проводили в 10 мкл смеси следующего состава: буфер (1 мМ трис-HCl, рН 7.5; 1 мМ MgCh; 5 мМ NaCl; 10 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА)); 10 мкг плазмидной ДНК; 5 ед. рестриктазы Pvu II. Смесь инкубировали в течение 1 часа при 37С и затем результаты анализировали при помощи электрофореза в 0,8% агарозном геле. В качестве маркера использовали плазмиду pGEM-3Zf(+), также обработанную рестриктазой Pvu II.
Секвенирование проводили по методу Сенгера (Sanger et.al., 1977). Плазмиды со вставкой секвенировали с универсальных плазмидных праймеров SP6 и Т7.
Мечение праймеров осуществляли кинированием по 5 -концу с помощью фермента полинуклеотидкиназы (ПНК). Для реакции брали 0,1 пкМ праймера, 1 ед. ПНК, 0,3 МБк аденозин-5 (у-ЗЗР) трифосфата и ПНК-буфер следующего состава: 0,05 М имидазол-НСІ, pH 4,0; 0,018М MgCl2; 5 мМ ДТТ; 0,1 мМ спермидин; 0,1 мМ EDTA; 0,1 мМ аденозинтрифосфат (АДФ). Смесь инкубировали 20 мин при t 37С, затем фермент инактивировали нагреванием 5 мин при 165С.
К 0,1 пМ меченого праймера добавляли буфер, следующего состава: 50 мМ трис-НС1 (рН 9.0); 2 мМ MgCh; 2,5 ед. Taq ДНК-полимеразы (Sequencing Grade, Promega, США); 1-2 пкМ плазмидной ДНК и соответствующие терминирующие нуклеотидные смеси (Silver Sequence d/ddNTP Mixes, Promega, США). Сверху наслаивали по 15 мкл минерального масла. При однобуквенном сиквенсе в реакционную смесь добавляли только один вид терминирующей нуклеотидной смеси. Сиквенсную реакцию проводили в ДНК-амплификаторе (Perkin-Elmer Cetus DNA Thermal Cycler, США) со следующим температурно-временным профилем амплификации: 94С - 9 мин, 55С - 30 с, 72С -1 мин - первый цикл, 94С - 30 с, 55С - 30 с, 72С -1 мин - последующие 30 циклов, 7 мин при 72 С - заключительный цикл.
По окончании реакции добавляли стоп-раствор следующего состава: ЮмМ NaOH; 95% формамид; 0,05% бромфеноловый синий; 0,05% ксилен цианол. Продукты реакции отбирали из-под масла и хранили в морозильной камере при -18С.
Электрофорез проводили на приборе SQ3 Sequencer (Hoefer, США) в 7%-ном полиакриламидном геле (ПААГ) толщиной 0,19 мм в денатурирующих условиях (в присутствии 7М мочевины). Последовательность нуклеотидов ДНК считывали непосредственно с радиоавтографов гелей (Чемерис и др., 1999).
