Введение к работе
Актуальность проблемы. Геносистематика (или молекулярная систематика) в отличие от традиционной систематики (феносистематики) оценивает родство организмов, исходя из сходства или различия их геномов, т.е. ее можно назвать наукой о разнообразии генотипов организмов. Развитие геносистематики происходило параллельно с развитием биохимии, а затем молекулярной биологии и было связано с прогрессом в понимании процессов изменчивости информационных макромолекул (семантид) и влияния этих процессов на фенотипические признаки организмов. Основы молекулярной систематики были заложены в конце 50-х годов прошлого века независимо двумя группами ученых под руководством А.Н.Белозерского и К.Ли, обнаружившими корреляцию нуклеотидного состава ДНК с положением организмов в системе, - сначала у бактерий, а затем и у эукариот. В начале 60-х годов Э. Цукеркандлем и Л. Полингом было впервые заявлено о возможности использования анализа последовательностей, т. е. первичной структуры клеточных макромолекул - носителей информации, для филогенетической классификации живых организмов. Значительную роль в развитии теоретических основ молекулярной филогенетики сыграла концепция «молекулярных часов», выдвинутая этими же авторами в 1965 г., и теория нейтральности молекулярной эволюции, разработанная в конце 60-х годов М.Кимурой, а также Дж. Кингом и Т.Джуксом. В конце 70х - начале 80-х годов работы ученых группы К.Везе дали начало направлению, которое впоследствии получило название «рибосомной» филогенетики и сыграло особую роль в систематике микроорганизмов.
Применение молекулярно-биологического подхода для изучения эволюции живых организмов выявило его принципиальное преимущество по сравнению с традиционным фенотипическим подходом: оно открыло возможность сравнения отдаленных организмов, которые могут совсем не иметь общих фенотипических признаков. Таким образом, появилась возможность с помощью единой методологии осуществлять построение всеобъемлющих филогенетических схем, что, несомненно, приближает исследователей к созданию наиболее естественной системы живых организмов, т.е. опирающейся на их филогенетические взаимоотношения, возникшие в процессе их эволюции.
Развитие молекулярной систематики в микробиологии оказалось особенно успешным в силу ряда особенностей прокариотных организмов. С одной стороны, по сравнению с систематикой эукариот, успехи микробиологов в филогенетике нельзя было назвать значительными. Последовательное введение в систематику эукариот эволюционных принципов позволило создать
стройные непротиворечивые системы, опирающиеся на реальные филогенетические взаимоотношения организмов, и в этом смысле являющиеся естественными. Вместе с тем, все попытки конструирования сколько-нибудь детализованной эволюционной схемы прокариот, исходя из которой можно было бы приблизиться к созданию их естественной системы, в рамках традиционной фенотипической систематики оставались безуспешными, в результате чего даже была поставлена под сомнение сама такая возможность. Это заставляло микробиологов стремиться воспользоваться теми принципиально новыми возможностями решения таксономических проблем, которые предоставляла молекулярная систематика. С другой стороны, менее сложная по сравнению с эукариотами организация генома прокариот позволяла использовать их в качестве преимущественных объектов геносистематики.
Уже первые попытки использования молекулярно-биологических методов позволили решить многие спорные вопросы систематики конкретных групп микроорганизмов. С развитием геносистематики, расширением круга используемых ею методов и накоплением экспериментальных данных, касающихся различных таксономических групп бактерий, вклад ее в решение общих кардинальных проблем систематики прокариот начал быстро возрастать. Вместе с тем появились и новые проблемы, связанные главным образом с противоречиями, иногда весьма значительными, между данными молекулярной систематики и традиционными представлениями, основанными на анализе фенотипа. В некоторых случаях эти противоречия объяснялись несовершенством знаний, как в отношении фенотипа, так и в отношении генотипа, поэтому в результате более тщательных исследований удавалось устранить их причины. Однако, по-видимому, существуют не только случайные, но и объективные противоречия, обусловленные естественными закономерностями эволюционных взаимоотношений микроорганизмов. Изучение этих закономерностей, а также степени их влияния на построение естественной системы прокариот является ключевой проблемой современной молекулярной систематики.
Целью работы являлось проведение сравнительного анализа генетических структур различных групп прокариот с помощью комплекса молекулярно-биологических методов и использование результатов этого анализа для решения частных и общих проблем таксономии, филогении и экологии прокариот.
Задачи работы.
1) Определить сходство тотальных геномов бактерий с использованием метода ДНК-ДНК гибридизации, а также провести статистический анализ полученных результатов и литературных данных;
-
Оценить возможность создания универсальной системы формальных (количественных) критериев родства бактерий и ее использования в таксономии прокариот;
-
Провести сравнительный анализ первичной и вторичной структуры генов 16S рибосомных РНК представителей различных таксономических групп прокариот и определение филогенетического положения изучаемых микроорганизмов на общем дереве прокариот;
-
Применить результаты филогенетического анализа генов 16S рРНК для решения конкретных проблем идентификации вновь выделенных штаммов бактерий, описания новых таксонов бактерий, а также изучения биоразнообразия прокариотных сообществ различного происхождения;
5) Определить нуклеотидные и транслированные белковые
последовательности некоторых структурных функциональных генов,
детерминирующих различные процессы метаболизма прокариот, и изучить
возможность использования сравнительного анализа полученных данных для
решения проблем таксономии, эволюции и экологии прокариот;
Научная новизна и теоретическая значимость работы. В данной работе на основании обобщения обширного экспериментального материала, касающегося изучения сходства генетических структур представителей различных групп прокариот, осуществлен анализ возможностей, предоставляемых молекулярной систематикой для решения кардинальных проблем таксономии и эволюции прокариот. Для этого в рамках работы:
проведен анализ распределения уровней сходства геномов (определенных с помощью метода ДНК-ДНК гибридизации) бактерий, представляющих практически весь таксономический спектр, что позволило установить бимодальный характер соответствующих графиков распределения. Обсуждено значение результатов анализа для создания концепции вида у бактерий.
предложено использование порядка Haloanaerobiales в качестве эталонного таксона при проведении таксономических исследований бактерий. На основании изучения филогенетического положения всего порядка и родственных взаимоотношений внутри него представлены ориентировочные количественные критерии определения рангов таксонов бактерий от вида до семейства.
разработаны новые системы олигонуклеотидных праймеров для избирательной амплификации генов 16S рРНК архей, а также новые системы специфических праймеров для амплификации структурных генов нитрогеназы (nifH) и генов больших субъединиц (cbbL и сЪЪМ) рибулезо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы (РБФК).
- с использованием сиквенс-анализа генов 16S рРНК проведено описание
новых таксонов бактерий и архей, в том числе, 3 порядков, 4 семейств, 35 родов и 96 видов.
- в геноме сульфатвосстанавливающей бактерии Desulfotomaculum
kuznetsovii впервые у бактерий выявлено существование двух копий генов 16S
рРНК, значительно (более 8% дивергенции) различающихся между собой за
счет сверхдлинных вставок в концевых вариабельных участках
последовательностей, и обсуждена возможность влияния обнаруженного
феномена на проведение исследований по «рибосомной» филогенетике.
в геномах ряда бактерий выявлены, отсеквенированы и проанализированы структурные гены, детерминирующие различные особенности метаболизма. Обсуждена возможность использования результатов этого анализа для решения проблем таксономии и эволюции исследованных физиологических групп бактерий.
- с применением сиквенс-анализа как рибосомных, так и функциональных
генов осуществлены молекулярно-экологические исследования
филогенетического разнообразия прокариот в ряде природных мест обитания.
Практическая значимость работы.
Разработан и применен в конкретных исследованиях метод ускоренной идентификации бактерий с помощью молекулярной гибридизации ДНК, защищенный авторским свидетельством № 649751 (1979 год).
Для выявления генов 16S рРНК у архебактерий, структурных нитрогеназных генов у архебактерий и бактерий, а также генов рибулозо-бисфосфаткарбоксилазы у бактерий разработаны новые системы олигонуклеотидных праймеров, пригодных для использования в экспериментальных филогенетических исследованиях;
С помощью комплекса методов геносистематики проведена идентификация ряда новых штаммов бактерий, относящихся к различным таксономическим группам, в том числе, возбудителей заболеваний человека и животных, имеющих большое значение для медицинской микробиологии, а также штаммов, перспективных для использования в промышленности и сельском хозяйстве.
Личный вклад соискателя.
В цикле исследований, составляющих диссертационную работу, соискателю принадлежит решающая роль в формировании тематики и направления конкретных молекулярно-биологических исследований; в выборе конкретных объектов и планировании экспериментальных подходов по их изучению; в поиске и разработке необходимых для проведения исследований методологических приемов; в получении экспериментальных данных с использованием метода ДНК-ДНК гибридизации; в проведении компьютерного анализа результатов секвенирования последовательностей различных генов; в
анализе, обсуждении и обобщении результатов. В работах, выполненных в соавторстве, личный вклад соискателя заключался в непосредственном участии в молекулярно-биологической части исследования - постановке задачи, проведении анализа полученных экспериментальных результатов, их обсуждении и окончательном литературном оформлении. Основные положения, выносимые на защиту.
-
На основании использования комплекса молекулярно-биологических методов возможно создание системы объективных количественных критериев родства прокариотных микроорганизмов.
-
Порядок Haloanaerobiales может быть использован в систематике бактерий в качестве эталонного таксона.
-
Несоответствие результатов фенотипического и филогенетического анализов может быть обусловлено особенностями эволюции прокариот.
-
Мультикопийность рибосомных генов в геноме одного прокариотного микроорганизма может влиять на результаты «рибосомной» филогенетики.
-
Филогенетический анализ последовательностей структурных генов, детерминирующих процессы метаболизма прокариот, может быть успешно использован в качестве дополнительного подхода к изучению таксономии и эволюции прокариот, уточняющего результаты «рибосомной» филогенетики.
Публикация материалов работы. По теме диссертации опубликовано 173 статьи в реферируемых российских и международных журналах, в том числе, 166 экспериментальных работ и 7 научных обзоров, а также получено авторское свидетельство.
Апробация работы. Материалы работы были доложены на следующих научных мероприятиях:
FEMS Symposium "Evolution of Prokaryotes", Munich, Germany, 1984; VII Съезд Всесоюзного микробиологического общества, Алма-Ата, 1985; International Conference "Thermophiles'98" Le Quartz -Brest, France, 1998; IXth International Congress of bacteriology, 1999, Sydney, Australia; III Internacional Congress "Extremophiles -2000", Hamburg, Germany 2000; Halophiles 2001, Sevilla, Spain, 2001; Конференция «Биотехнологии - 2001». Пущино, Россия, 2001; Всероссийская конференция «Сельскохозяйственная микробиология в XIX-XXI веках». Санкт-Петербург, Россия, 2001; 9th International Symposium on Nitrogen Fixation with Non-Legumes. Leuven, Belgium, 2002; 1-я Международная научно-практическая конференция «Биоразнообразие и сохранение генофонда флоры, фауны и народонаселения Центрально-Азиатского региона, Кызыл,
Россия, 2002; 1st FEMS Congress of European microbiologist, Ljubljana, Slovenia, 2003; International Conference Thermophiles 2003. Exeter, UK, 2003; 8th International Symposium on Biogeochemistry of Wetlands. Gent, Belgium, 2003; Всероссийский симпозиум «Автотрофные микроорганизмы». Москва, Россия, 2005; 1st International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology (BioMicroWorld-2005), Badajoz, Spain, 2005; 3-й Московский Международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития". Москва, Россия, 2005; 11th International Symposium on Microbial Ecology (ISME-11), Vienna, Austria, 2006; 11th IWA World Congress jn Anaerobic Digestion, Queensland, Australia, 2007, 7th International. Symposium for Subsurface Microbiology. Shizuoka, Japan, 2008.
Объем и структура диссертации.
Диссертационная работа в форме научного доклада изложена на
страницах и включает общую характеристику работы и экспериментальную
часть, состоящую из описания основных результатов в трех частях, заключения
и выводов. Работа содержит рисунков и таблиц.
