Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Электрооптические методы
1.1 Основы электрооптического метода 19
1.2 Электрофизические параметры клеток и клеточных структур
1.3 Физиологические параметры клеток 21
1.4 Показатели гетерогенности клеточной популяции 22
1.5 Морфометрические параметры клеток и методы их измерения
1.5.1 Прямые оптические методы измерения размера клеток 24
1.5.2 Прямой электрический метод измерения размеров и концентрации клеток
1.6 Методы измерения поляризационных, электрофизических 27
и электрокинетических параметров суспендированных клеток
1.6.1 Измерение поляризационных и электрофизических параметров суспендированных клеток
1.6.2 Измерение электрокинетических параметров клеток 30
1.7 Электрооптический метод анализа клеток 32
1.7.1 Феноменология электрооптического эффекта 32
1.8 Применение электрооптического метода для исследования 35
клеток, клеточных структур и биомолекул
1.8.1 Методологические аспекты применения метода 35
1.8.2 Направления использования электрооптического метода
ГЛАВА 2 Биосенсоры
2.1 Биосенсорные измерения 41
2.2 Типы биосенсоров 43
2.2.1 Амперометрические биосенсоры 43
2.2.2 Сенсоры, основанные на пьезоэлектрических кристаллах 44
2.2.3 Оптические сенсоры 44
2.2.4 Биосенсоры на основе фагов 46
2.3 Иммунологические методы определения бактерий 50
2.3.1 Получение антител 50
2.3.1.1 Поликлональные антитела 50
2.3.1.2 Моноклональные антитела 51
2.3.1.3 Рекомбинантные антитела 51
2.3.2 Иммуноферментный анализ 52
2.3.3 Иммуносенсоры 53
2.4 Биосенсор для определения антиоксидантнои активности
2.4.1 Супероксид 54
2.4.2 Патофизиологическая роль свободных радикалов 55
2.4.3 Механизмы повреждений
2.4.3.1 Липиды 57
2.4.3.2 Белки 58
2.4.3.3 ДНК
2.4.4 Защитные механизмы против АФК 59
2.4.5 Свободные радикалы в биологических системах 61
2.4.5.1 Повреждения при реперфузии 62
2.4.6 Определение свободных радикалов 64
2.4.6.1 Электрохимический метод определения супероксида 65
ГЛАВА 3 Применение бионанотехнологических подходов изучения и идентификации микроорганизмов
3.1 Бионанотехнология, 68
3.2і Анализ наноорганизации аффинных поверхностей с помощью зондовой микроскопии 68
3.2 .1- Антитела- 68
3.2.2. Аффинность антител 69
3.3 Основные принципы сканирующей зондовой микроскопии 72
3.3.1 Сканирующая туннельная микроскопия 73
3.3.2 Атомно-силовая микроскопия
3.4 Артефакты зондовой микроскопии и способы их учёта.. 77
3.5 АСМ вирусов 78
3.6 АСМ бактерий 81
3.6.1 Нанесение бактериальных клеток на подложку для АСМ- 81
3.7 Изучениевзаимодействия фаг-бактерия с помощью АСМ
микроскопии 89
Методы исследования
ГЛАВА 4 Объекты и методы исследований 92
4.1 Культивирование микроорганизмов и фагов 92
4.2 Электрооптический метод
4.2.1 Подготовка клеток к анализу 94
4.2.2 Измерение ориентационных спектров, к леток 94
4.2.3 Идентификация микроорганизмов с использованием электрооптического метода и магнитных частиц 95
4.3 Биосенсор на основе клеток или мембран 97
4.3.1 Методика криоиммобилизации 97
4.3.1.1 Перекристаллизация поливинилового спирта 97
4.3.1.2 Концентрирование выращенной биомассы 97
4.3.1.3 Приготовление суспензии клеток или мембран в растворе гелеобразователя 97
4.3.1.4 Гранулирование с одновременным замораживанием 97
4.3.1.5 Реактивация и хранение иммобилизованных клеток или бактериальных мембран 98
4.3.1.6. Криоиммобилизация клеток и мембран 98
4.3.2 Приготовление сенсора на основе кислородного датчика 99
4.3.3 Тонкопленочные электроды 100
4.3.4 Биосенсорные измерения антиоксидантных свойств веществ 100
4.3.5 Оптический сенсор 102
4.4 Иммунологические методы
4.4.1 Получение поливалентных сывороток к адено- и ротовирусам 102
4.4.2 Определение титра антител методом реакции диффузной преципитации (РДП) 103
4.4.3 Получение поликлональных антител 104
4.4.4 Получение и характеристика моноклональных антител 105
4.4.5 Характеристика кроличьих специфических антител к S.
typhimurium 106
4.4.5.1 Получение гипериммуннойг кроличьей сыворотки 106
4.4.5.2 Выделение IgG фракций из.гипериммунных кроличьих сывороток
106
4.4.5.3 Дот-блот анализ 107
4.4.5.4 Тестирование сыворотки
4.4.6 Подготовка латексных частиц для АСМ микроскопии 108
4.4.7 АСМ микроскопия 110
4.4.8 Получение макрофагов ПО
Результаты исследований
Глава 5 Электеооптические методы исследования 112
Глава 6 Биосенсоры 125
6.1 Бесконтактное определение микроорганизмов 125
6.2 Биосенсор для определения глюкозы
6.2.1 Глюкозный биосенсор для контроля синтеза авермиктина 133
6.2.2 Применение глюкозного биосенсора для определения фенольных соединений 1 6.3 Разработка бисенсорной системы узнавания на основе бактериальных клеток и их фрагментов с помощью криоиммобилизации 137
6.4 Биосенсоры на основе ЦПМ 141
6.5 Дормантные клетки как узнающий элемент биосенсора 146
6.6 Оптоволоконный биосенсор для определения лактата на основе ЦПМ 160
6.7 Амперометрический биосенсор для определения антиоксидантной активности 163
ГЛАВА 7 Бионанотехнологические подходы исследования в микробиологии 164
7.1 Визуализация латексных частиц, сенсибилизированных антителами, в присутствии антигена методом атомно-силовой микроскопии 164
7.2 АСМ микроскопия вирусов 171
7.3 АСМ микроскопия бактерий 1 7.4 Аффинные подложки 180
7.5 Изучения взаимодействия фаг-бактерия 185
7.6 Изучение фрагментов бактериальных клеток 193
7.7 Изучение токсичности нанообъектов 199
Заключение 207
Выводы 212
Список использованной литературы
- Измерение поляризационных и электрофизических параметров суспендированных клеток
- Сенсоры, основанные на пьезоэлектрических кристаллах
- Анализ наноорганизации аффинных поверхностей с помощью зондовой микроскопии
- Идентификация микроорганизмов с использованием электрооптического метода и магнитных частиц
Введение к работе
Актуальность темы
Разработка новых методов анализа в микробиологии имеет большое значение для развития науки и применения ее результатов в различных отраслях народного хозяйства. Одним из наиболее востребованных направлений в микробиологии является разработка быстрых и чувствительных методов изучения и идентификации бактерий на основе бионанотехнологий.
В настоящее время разнообразный анализ бактериальных клеток имеет большое значение в биотехнологии и медицине при создании биопрепаратов, оптимизации микробиологического синтеза продуктов и других биотехнологических процессов, а также при разработке новых методов контроля и диагностики. Наличие между клетками и измерительным прибором промежуточного звена в виде поддерживающей среды обуславливает ряд недостатков этих методов: инерционность процесса измерений и усреднение измеряемых параметров. Поэтому электрооптический метод анализа, основанный на исследовании клеток как электрофизических объектов со слоистой структурой и измерении поляризационных характеристик клеточных структур, представляет собой новый подход к оценке прижизненных физиологических параметров клеток и их гетерогенности (Guliy et al., 2007). Различие электрических свойств среды культивирования (поддерживающей среды) и бактериальных клеток приводит к появлению индуцибельных зарядов при наличии поля. Взаимодействие индуцированных зарядов с электрическим полем является причиной возникновения вращательного момента, задающим ориентацию клеткам. Изменение ориентации бактериальных клеток приводит к изменению оптических свойств суспензии. Оптическая плотность суспензии может изменяться на 1-2%, однако этого достаточно для электрооптического анализа бактериальных клеток (Bunin and Angersbach, 2008). Этот метод измерений является прижизненным, он не использует дополнительных меток и не вызывает изменений в исследуемом объекте. Преимуществом данного метода является то, что влияние среды на точность измерения поляризационных параметров является незначительным и предсказуемым. Воздействие на бактериальные клетки измерительной процедуры также незначительно, и при этом микроорганизмы сохраняют свою жизнеспособность. С помощью электрооптического метода возможно определить количество и жизнеспособность бактерий. Метод является оперативным, причем процесс измерений может быть полностью автоматизирован.
Применение электрооптического метода для оценки состояния микроорганизмов в ходе технологического процесса и для анализа взаимодействия бактерий со специфическими антителами и фагами является актуальной и будет раскрыта в данной работе
Классические методы определения бактерий, основанные на культивировании микроорганизмов с последующим микробиологическим и биохимическим анализом, являются трудоемкой и длительной процедурой с использованием дорогостоящего оборудования. Биосенсоры - аналитически чувствительная и недорогая альтернатива стандартным методам, применяемым сегодня для идентификации бактерий (Deisingh and Thompson, 2002). Они представляют собой аналитические приборы для селективного определения веществ и организмов, в которых используется комбинация биологической системы узнавания и физического преобразователя. Увеличение числа анализируемых образцов, требующих проверки и контроля, и потребность в высокой чувствительности, скорости и точности аналитических измерений стимулировали значительный интерес к развитию биосенсоров в качестве мощной и недорогой альтернативы по отношению к стандартным химическим и энзимологическим методам, используемым на сегодняшний день. Вместе с тем, несмотря на применение биосенсоров на основе бактериальных клеток (Buchinger et al., 2010), практически нет данных по использованию клеточных фрагментов или субклеточных структур для повышения чувствительности и специфичности измерений субстратов. Отсутствуют также литературные данные и по использованию простых систем «искусственного носа» и систем на основе оптоволоконных пучков для идентификации бактерий. Перспективным направлением является разработка биосенсора для анализа антиоксидантной активности веществ с последующим изучением их влияния на защитные функции макроорганизма.
Бионанотехнология – современная биологическая наука, оперирующая наноразмерными объектами. Возможности получения нанообъектов и способность анализировать их качественно изменяют уже существующие подходы в исследованиях. Сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ) получила такое название благодаря ключевому элементу, обязательно присутствующему во всех её модификациях – зонду (Cuenat, 2010). Микроскопический зонд двигается, как правило, построчно вдоль поверхности исследуемого образца, взаимодействуя с ним таким образом, что становится возможным детектировать количественную характеристику этого взаимодействия, которая, в конечном счёте, и несёт информацию о свойствах объекта. Атомно-силовая микроскопия (АСМ) принадлежит к семейству проксимальной зондовой микроскопии для анализа поверхности и ее свойств на атомно-молекулярном уровне. В течение последних десятилетий достигнут большой прогресс в развитии АСМ как инструмента изучения нанообъектов в микробиологии (Dufrene 2002, Dufrene et al., 2009). С помощью АСМ можно получить трехмерное изображение поверхностных ультраструктур на молекулярном уровне в реальном времени и при физиологических условиях путем анализа взаимодействия между анализируемой поверхностью и специальным наконечником – кантилевером. Однако все исследования с применением АСМ в основном сводились лишь к наноразмерному анализу бактериальной поверхности. До проведения настоящей работы не была осуществлена специфическая иммобилизация вирусов и бактериальных клеток и/или их нанофрагментов для анализа и идентификации бактерий.
Важным аспектом бионанотехнологии является определение бактерицидной активности наносоединений (Nel et al., 2006). Следует учитывать, что наряду с этим, важна также их роль в функционировании макрофагов при фагоцитозе патогенов.
Бионатехнологии открывают новые перспективы для значительного увеличения чувствительности анализа и идентификации микроорганизмов. Результаты работы очень важны для микробиологии, поскольку существенно расширяют и дополняют представления о методах идентификации прокариот и вносят существенный вклад в понимание процессов анализа бактериального мира.
Цель исследования
Основной целью работы является разработка и применение новых высокоэффективных методов изучения и идентификации бактерий на основе элетрооптических, биосенсорных и бионанотехнологических подходов.
Задачи исследования
-
Разработка электрооптического метода для анализа и контроля физиологического состояния бактерий и их выживаемости в ходе биотехнологических процессов.
2. Выявление электрооптических изменений микробиологических систем, которые могут служить удобным инструментом идентификации микроорганизмов при анализе взаимодействия бактерий со специфическими антигенами и фагами.
3. Разработка биосенсоров с применением системы искусственного носа на основе высокоплотных оптоволоконных пучков для бесконтактной идентификации микроорганизмов.
4. Изучение возможности использования глюкозного биосенсора для контроля синтеза авермиктина.
5. Разработка биосенсоров на основе бактериальных клеток или их фрагментов для определения глюкозы, лактата и определения концентрации бактерий.
6. Разработка биосенсора для определения антиоксидантной активности веществ.
7. Определение наличия микроорганизмов по анализу летучих компонентов бактериальной культуры. Изучение возможности использования простой модификации метода спектрофотометрического анализа для быстрого выявления присутствия микроорганизмов либо по выделению ими летучих компонентов, либо по их поглощению из окружающей среды.
8. Получение аффинных поверхностей и их анализ для использования бионанотехнологического подхода на основе атомно-силовой микроскопии для высокоспецифичной идентификации микроорганизмов.
9. Изучение токсического действия наносоединений на микроорганизмы.
Научная новизна
Разработан электрооптический метод диагностики физиологического состояния бактериальных клеток в процессе производства биологических препаратов и идентификации бактерий.
Впервые предложено использовать цитоплазматические мембраны бактерий для конструирования новых биосенсоров для определения лактата и оценки бактериальной обсемененности свежего коровьего молока. Использованы новые подходы для определения антиоксидантной активности веществ и их роли в ходе инфекционного процесса. Разработан новый простой метод определения бактерий по анализу органических летучих компонентов.
Впервые разработана система специфической визуализации прокариот с помощью АСМ. Предложены методы оценки бактерицидной активности наносоединений.
Практическая значимость
Разработан электрооптический метод анализа выживаемости бактериальных клеток и оценки целостности клеточной оболочки в биотехнологических процессах, а также идентификации микроорганизмов (подана заявка на патент). Создана новая система биологического узнавания биосенсора на основе цитоплазматической мембраны бактерий, увеличивающая чувствительность определения лактата по сравнению с биосенсорами на основе бактериальных клеток. Реализована методология специфической визуализации прокариотических клеток и их фрагментов для сверхчувствительной идентификации микроорганизмов с помощью АСМ на основе аффинных поверхностей (Патент России RU 2261279 C1). Разработанные методические рекомендации широко используется Институтом теоретической и экспериментальной физики (г. Москва) в вопросе исследования микроорганизмов с помощью атомно-силовой микроскопии. Разработан метод оценки бактерицидной активности наносоединеий для микроорганизмов и фагоцитарной активности макрофагов (готовится заявка на патент). Результаты работы применяются Национальным исследовательским технологическим университетом «МИСиС» при разработке новых видов нанопокрытий с учетом их бактерицидных свойств и функциональной активности фагоцитов.
Личный вклад соискателя
Соискателю принадлежит решающая роль в выборе направлений исследований, в формулировании проблемы, постановке целей и задач, разработке экспериментальных подходов и обобщении результатов. Соискатель принимал участие во всех этапах исследований. В работах, выполненных в соавторстве, соискатель принимал участие в проведении экспериментальной работы, в обобщении и интерпретации научных результатов, в подготовке научных публикаций, а также выступал с научными докладами.
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы были представлены: на Всесоюзной конференции «Липиды биологических мембран» (Ташкент, 1980 г.), на XI научной конференции по итогам НИР ВНИИ ПМ (Оболенск, 1986 г.), на Всесоюзной конференции «Теория и практика электрооптических исследований коллоидных систем» (Велегож, 1990 г.), на международной конференции «Развитие медицинского оборудования» (Подольск 1996 г.), на международном симпозиуме «Стресс и азотный обмен» (Москва, 1996 г.), на международном рабочем совещании НАТО «Быстрые методы анализа биологических материалов в окружающей среде» (Варшава, 1997 г.), на международном рабочем совещании НАТО «Новые направления в развитии биосенсоров» (Киев, 1998 г.), на международной конференции «Биокатализ-98» (Пущино, 1998 г.), на международной конференции «Биокатализ-2000» (Москва, 2000 г.), на Всероссийской конференции «Проблемы медицинской и экологической биотехнологии», (Оболенск, 1999 г.), на международной конференции «Современные проблемы биохимии и биотехнологии бактерий» (Пущино, 2000 г.), на международной конференции «Биосенсоры 2000» (Сан-Диего, США, 2000 г.), на международной конференции «Окись азота: фундаментальные исследования и применение в клинике» (Эриче, Италия, 2001 г.), на международных конференциях «IT + ME» (Гурзуф, 2003 г., 2007 г.), на международной конференции «Канадский биологический коллоквиум» (Москва, 2004 г.), на 5 международном совещании МНТЦ/Корея (Сеул, Корея, 2004 г.), на 37 международном совещании МНТЦ-Япония по наноматериалам (Цукуба, Япония, 2004 г.), на международной конференции «Нанотех» (Бостон, США, 2006 г.), на VII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ "Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территории государств-участников СНГ" (Оболенск, 2006 г.), на IX ежегодном зимнем совещании «Успехи в исследованиях на молекулярном уровне для биологии и нанонауки» (Линц, Австрия, 2007 г.), на Первой Всероссийской Школе-семинаре «Современные достижения бионаноскопии» (Москва, 2007 г.), на Международной конференции «Сенсоры для окружающей среды, здравоохранения и безопасности (Виши, Франция, 2007 г.), на IV международной конференции «НаноБио и другие новые перспективные биотехнологии» (Пущино, 2007 г.), на VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2007» (Москва, 2007 г.), на Международном совещании экспертов по разработке лекарств (Москва, 2007 г.), на Международном форуме по нанотехнологиям (Москва, 2008 г), на Международной научно-практической конференции «Нанотехнологии в сельском хозяйстве» (Москва, 2008 г.), на Международной конференции «Евромат-2009» (Глазго, Великобритания, 2009 г.) и на Семинаре «Производство и применение наноматериалов в России: токсикологическое воздействие и нормативные вопросы” (Москва, 2009 г.).
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы. Диссертация изложена на 229 страницах, содержит 11 таблиц, 88 рисунков. Список литературы включает 223 работы.
Публикации
Измерение поляризационных и электрофизических параметров суспендированных клеток
Удельная электропроводность вещества клеточной структуры определяется концентрацией и подвижностью свободных ионов (Asami et al. 1980). При наличии некомпенсированных связанных зарядов электропроводность вещества может возрасти за счет подвижных противоионов, которые образуют вокруг них ионную атмосферу. Необходимым, условием появления этой компоненты является наличие источника подвижных противоионов (Asami etal. 1980).
Для определения диэлектрической проницаемости цитоплазмы єс можно привлечь результаты независимых измерений этой величины для внутриклеточной воды, полученные с помощью ЯМР спектроскопии (Фомченков и др. 1982). Необходимые для расчета значения диэлектрической проницаемости белка могут быть получены с помощью диэлькометрических ис к следований изолированной белковой фракции. Однако к полученным результатам следует относиться очень осторожно. Количество связанной воды в объеме белковой глобулы в нативном и изолированном состоянии различно, что прямым образом влияет на измеряемую величину их диэлектрической проницаемости. Типовые значения величины sc клеток различных типов колеблются в пределах 20 - 50 (Фомченков и др. 1982).
Цитоплазматическая мембрана различных клеток, за исключением фо-тотрофов, метанотрофов и иных клеток со сложным метаболизмом, представлена практически гомогенной липидной фракцией с примесью полисахаридов и белков, имеющей неизменную толщину 8/н=7,5 нм и постоянное значение диэлектрической проницаемости єт=30-40. Поэтому измерения корректно выполняются прямым способом на выделенной из лизата липидной фракции. Подобный подход приемлем и для измерения диэлектрической проницаемости клеточной стенки ew. Характерные значения. EW равны 20 (Ду-хин, 1977). Больший разброс измеряемого параметра обусловлен различиями в строении клеточной стенки и композиционном соотношении фракций.
Физиологические параметры бактерий характеризуют основные процессы развития клетки и клеточной популяции в целом. Интегральными физиологическими характеристиками развития клеток являются показатели роста: концентрация клеток, способность клеток к размножению, распределение их размеров, скорость удвоения, средний возраст культуры, распределение возрастов и т.д. (Бирюков и Кантере, 1985).
Прямым измерениям в этой группе параметров доступны оптическое или электрическое определение концентрации и размеров клеток. Косвенное измерение концентрации клеток может быть проведено по концентрации в образце некоторых соединений, например НАДН (Леви и Сикевиц, 1971) или лактата (Ignatov et al., 2009). Вторая группа физиологических показателей характеризует параметры, связанные с процессами внутриклеточного метаболизма и различными потоками обмена клетки с внешней средой: энергетическими, химическими и информационными. Для анализа параметров этой группы, как правило, используются косвенные методы оценки концентрации субстратов и метаболитов в среде с клетками. В качестве интегральных параметров для этой цели используются результаты измерения рН, еН среды и определение парциальных концентраций кислорода, углекислого газа, продуцируемых бактериальными структурами (Гузев и Звягинцев, 1979; Pommerening-Roser and Koops, 2005).
Следует отметить, что параметры являются взаимосвязанными как между собой, так и внутри группы. Например, снижение концентрации питательных веществ в поддерживающей клетки среде уменьшает интенсивность процессов метаболизма, изменяет форму распределения размеров.и увеличивает средний возраст культуры. Данная многозначность в значительной- степени усложняет интерпретацию и использование получаемых инструментальных данных в связи с тем, что она может привести к взаимоисключающим результатам.
Не менее важной особенностью физиологических параметров клеток является их гетерогенность, которая органично присуща клеточной» популяции. К сожалению, инструментальные методы анализа, пожалуй, за исключением измерения размеров клеток, не дают ответа: насколько популяция гетерогенна по тому или иному физиологическому параметру. Электрофизический метод анализа позволяет в определенных пределах решить эту задачу.
Сенсоры, основанные на пьезоэлектрических кристаллах
Биосенсоры, основанные на специфическом взаимодействии антигена с антителом, называются иммуносенсорами и- широко применяются в диагностике и при определении различных веществ (Conroy et al., 2009). Большинство иммуносенсоров использует сэндвич-иммунокомплексы,, содержащие иммобилизованные антитела на патогены, патогены и меченные антитела, дающие сигнал. Первичные антитела иммобилизируются на магнитных частицах (Liu et al., 2003), мембранных фильтрах (Tu et al., 2000), внутри капиллярных колонок (Liu and Li, 2001) или прямо на вторичных преобразователях (Ruan et al. 2002). Вторичные антитела метятся ферментами. Количество связанных меченых антител определяется по результатам ферментативной реакции, фиксируемой по изменению поглощения (Demarko and Lim, 2002), изменению хемилюминесценции (Liu et al., 2003), изменению поверхностного плазмонного резонанса (Su and Li 2004), амперометрически (Abdel-Hamid et al., 1999), потенциометрически (Ти et al., 2000), ИЛИ по изменению электрохимического импеданса (Ruan et al., 2002). Все эти иммуносенсорные системы можно рассматривать как модификацию ферментативного иммуносорбентного анализа (ELISA). Развитие иммунологических методов идет как по пути их упрощения и миниатюризации, так и по пути повышения чувствительности с применением масс спектрометрии или атомно-силовой микроскопии. 2.4 Биосенсор для определения антиоксидантной активности
Кислород является уникальной химической молекулой, поскольку после восстановления органическими соединениями образует нетоксичный конечный продукт - воду. Тем не менее, необходимый для существования всего живого, кислород может образовывать активные, свободно радикальные формы в ходе нормального метаболизма (Van Lente, 1993). Свободный радикал - это молекула или атом, имеющий неспаренный электрон на внешней орбите, что обуславливает его химическую агрессивность.
При нормальных условиях эти активные формы кислорода. (АФК) утилизируются, в ходе многочисленных метаболических процессов. Избыточный уровень, АФК служит причиной многочисленных заболеваний; таких, как рак, паралич, неиродегенеративные- процессы и. многие другие (Halliwell and Gutteridge, 1986). Было подсчитано, что на каждые 100 тонн поглощенного кислорода образуется — 2 тонны АФК. Образование АФК приводит к повреждению белков, ДНК и липидов, что является основной причиной патофизиологических процессов, особенно в случае нарушения защитных систем в биологических системах (Halliwell and Gutteridge, 1986).
Существует несколько видов .активных форм кислорода. Двухатомная молекула кислорода (СЬ) в результате различных реакций способна образовывать частично восстановленные формы, в основном короткоживущие и с высокой реакционной способностью, таких как супероксид (CV ), перекись водорода (Н2О2) и гидроксильный радикал (ОН ) (Halliwell and Gutteridge, 1986). Другие активные формы кислорода, такие как окись азота (NO), хиноновая половина ряда ксенобиотиков (Nohl and Jordan, 1984), нейротоксин №метил-4-фенил-1,2,5,6-тетрагидропиридин и гербицид паракват также обладают значительным патологическим воздействием на клетки (Slater, 1984).
Супероксид может образовываться как интермедиатор в различных химических реакциях, например, в митохондриальной электрон транспортной цепи (Loschen et al, 1974). В ходе превращения ксантина в мочевую кислоту, образуется 02 с участием фермента ксантиноксидазы. Схожим образом, другие флавопротеиновые оксидазы, такие как альдегид-оксидаза, образуют 02" как промежуточный продукт реакции. Супероксид также образуется в результате авто-окисления гидрохинонов (например, убихинона), катехоламинов и тиолов. Генерация 02" фагоцитирующими клетками играет ключевую роль в защите макроорганизма против микроорганизмов в ходе инфекционного процесса (Babior, 1984). Данный факт объясняет высокую чувствительность пациентов с хроническим грануломатозом (неспособность фагоцитирующих клеток продуцировать 02") к бактериальным инфекциям (Cross et al, 1987).
В нормальных условиях супероксид является коротко живущим радикалом и превращается в перекись водорода либо в ходе спонтанной реакции диспропорции, либо в результате воздействия супероксиддисмутазы (СОД). Повреждение энзиматического комплекса СОД приводит к ряду патофизиологических процессов (Ookawara et al, 1992). Одним из источников супероксида является НАДФН оксидаза. Этот фермент, первоначально охарактеризованный у нейтрофилов, встречается в различных типах клеток, включая фибробласты (Meier et al, 1991) и клетки эпителия (Rosen and Freeman, 1984).
Наличие свободных радикалов - нормальное физиологическое состояние макроорганизма для выполнения защитных и регуляторных функций организма. Однако нарушение стационарного уровня свободных радикалов приводит к различным патологиям. Так, отсутствие НАДФН оксидазы у хронических грануломатозных больных приводит к уменьшению продукции фагоцитарного супероксида, что приводит к высокой чувствительности организма к возбудителям грибковых и бактериальных инфекций (Parkos et al, 1989). НАДФН оксидаза также была обнаружена у нефагоцитирующих клеток, где разрегулировка ее активности может привести к ряду дегенеративных процессов. Та,к избыточная продукция супероксида в мезангиальных клетках приводит к некрозу почек (Pabasyuk et al, 1994). В результате работы ряда систем транспорта электронов образуются кислород-содержащие радикалы. Это - митохондриальная система переноса электронов, цитохромная система Р450 и NO синтаза (Рои, et al, 1992). Некоторые нарушения комплекса I митохондриальной электрон транспортной системы (ЭТЦ) приводят к увеличению продукции супероксида. Это ведёт к увеличению повреждения комплекса и дальнейшему повышению продукции свободного радикала. Данный процесс считается главной причиной болезни Паркинсона (Shapira et al, 1992). Предполагается, что подобную негативную роль играют свободные радикалы при заболевании Альцгеймера, ряде нейронных нарушений и в процессе старения организма (Jener, 1996).
Анализ наноорганизации аффинных поверхностей с помощью зондовой микроскопии
Кроме того, возможно сделать так, что в режиме постоянной высоты контактной моды АСМ кантилевер будет передвигаться в горизонтальной плоскости. При этом осуществляется регистрирация его отклонения в каждой точке. Однако данный режим используется не так часто по сравнению с предыдущим.
Из-за наличия латеральных сил, действующих на кантилевер, например силы трения между поверхностью и зондом, вызывает интерес разностный сигнал левых и правых сегментов фотодиода Friction=A+C-(B+D), который, в частности, несёт информацию о шероховатости поверхности. Записывая сразу два изображения одного и того же участка в режиме Friction при противоположных направлениях сканирования кантилевера, можно выявлять участки различной природы (различного состава): в этом случае изображения будут негативами друг друга (Shi et al. 2001).
Анализ силовых кривых позволяет получать информацию о поверхностных свойствах образца, например, величину локального модуля Юнга или степень адгезионного контакта между зондом и поверхностью (Zlatanova et al., 2000). Необходимо помнить, что измерения с помощью силовых кривых имеют некоторые ограничения. Во-первых, АСМ не позволяет напрямую измерять расстояние между образцом и зондом и не несёт информации об этом расстоянии. Во-вторых, при исследовании мягких материалов возникает трудность определения относительного вклада в отклонение кантилевера со стороны поверхностных сил и деформации образца.
Как правило, при сканировании стремятся уменьшить воздействие на образец, для чего выбирают минимальную величину прямого изгиба кантилевера, или, по мере возможности, максимальную величину обратного изгиба кантилевера, при которой еще сохраняется механический контакт. Сканирование при обратном изгибе может быть нестабильным. Если силы притяжения (капиллярные, дисперсионные) действуют на зонд неодинаково на всем участке сканирования, то в тех местах, где они меньше, зонд может «оторваться» от поверхности (выйти из контакта), если величина упругих сил обратного изгиба превысит силы притяжения. Это обстоятельство является основным препятствием при минимизации силы воздействия зонда.
Ещё один часто используемый режим - режим прерывистого контакта или tapping mode - во многих случаях (в основном, при исследовании мягких материалов, таких как биополимеры) позволяет повысить качество получаемого изображения. При таком способе сканирования.с помощью ещё одного пьезоэлектрического манипулятора осуществляются- вынужденные механические колебания кантилевера с частотой, близкой к резонансной (обычно это десятки и сотни килогерц) и с амплитудой порядка 100 нм. В нижней точке колебаний остриё "касается" образца. В этом режиме, как и в любом контактном режиме, возможно проминание образца иглой. Записанное изображение представляет собой двумерный набор1 чисел, с которыми можно производить различные математические операции. Существует множество алгоритмов обработки изображений (Филонов и Яминский 1997), необходимость использования которых зависит от целей экспериментатора и от конкретной1 ситуации. Вся вычислительная часть. работы обычно выполняется на компьютере.
Интерпретация изображений является ключевой задачей в АСМ: зарегистрированные объекты никак не помечены, и поэтому их форма и размеры являются основными критериями для их идентификации. При интерпретации необходимо принимать во внимание основные артефакты s СЗМ. Наиболее важными и требующими постоянного учёта являются:эффект уширения; двоение изображения, уменьшение высоты объекта на изображении или разрушение образца вследствие его проминання кантилевером (для мягких образцов).
Возникновение эффекта уширения связано с конечной величиной радиуса зонда. Как правило, остриё зонда не имеет идеальную сферическую форму, при этом его размеры точно неизвестны и отличаются от зонда к зонду. Кроме; того, реальные объекты не всегда сферические и могут деформироваться, что делает изложенные формулы весьма, приблизительными. Подобная, модель для; образца; эллиптической формы изложена віработахРалямоваи.Яминского (Gallyamov andYaminskii 2001).,
Двоение изображения- возникает, когда рабочий зонд имеет двойное остриё. Кроме1 того, встречаются; артефакты связанные: с: наличием; различного вида дефектов на подложке, на которую наносится образец, что может привести? к возникновению ошибочных представлений об изучаемом объекте. Наиболее яркой; иллюстрацией этому является; «визуализация» с помощью СТМ структуры, двойной; спирали ДНК, иммобилизованной на графите (Arscott et al., 1989). Оказывается что некоторые структурные дефекты на поверхности графита выглядят на СТМ-изображениях как правозакрученная двойная спираль с размерами, близкими к размерам спирали ДНК (Clemmer et al., 1991). Для того, чтобы уменьшить влияние таких артефактов на результаты, необходимо следить за воспроизводимостью эксперимента, а также ставить контрольные опыты в требуемом количестве.
Идентификация микроорганизмов с использованием электрооптического метода и магнитных частиц
IgG фракцию кроличьей сыворотки выделяли из гипериммунной сыворотки, которую разводили в отношении 1:2 трис-НС1 буфером (рН 8,6), фильтровали и пропускали через колонку с белок-А сефарозой. Элюцию проводили 0,2 М глициновым буфером (рН 2,3). Элюат обрабатывали 40% сульфатом аммония и переводили в фосфатный буферные раствор (ФБР) (рН 7,4) на колонке с сефадексом G-25. Специфическую, активность IgG определяли методом иммуноферментного анализа с препаратом ультразвукового дезинтеграта S.typhimurium. Титр специфической реакции антител составил 1:64 000.
Методом дот-блот анализировали специфическое взаимодействие IgG фракции кроличьей гипериммунной сыворотки с клетками сальмонелл группы D - S. entritidis 4833(1); группы С - S. meunchen 06; группы В - S. typhimurium 04. Дот-блот проводили по стандартному протоколу на фильтре Gelman Sciences (США). Концентрацию микробных клеток во всех образцах выровняли по стандарту мутности до 109 кл/мл. Использовали разведения микробной суспензии 10 кл/мл, 10 кл/мл, 10 кл/мл, 10 кл/мл. Объем каждого разведения микробной суспензии на пятно составил 0,1 мл. Нанесение микробной супензии на фильтр проводили с помощью прибора Manifold (Schleicher & Schuel) (США). Взаимодействие со всеми группами сальмонелл в блоте носит общий вид, что, связано с наличием общего корового (О-антиген) антигена. Проверка неспецифической реакции с препаратом липополисахаридов (ЛПС) Е.соИ показала отсутствие перекрестной активности исследуемых антител.
Сыворотку, полученную от животных, тестировали непрямым иммуноферментным анализом (ИФА) с использованием клеток S. typhimurhim или их ультразвукового дезинтеграта (УЗД) в качестве антигенов. ИФА проводили в 96-лу ночных планшетах (Labsy stems, Финляндия). В случае использования УЗД измеряли белок по методу Лоури. В каждую лунку помещали 1 мкг белка в 0,01 М бйкарбонатном буфере (рН 9;5), сорбировали при комнатной температуре в- течение ночи, отмывали ФБР, содержащим 0,1% твина-20 (ФБР-Т). Сорбцию клеток на планшет осуществляли с использованием планшетного ротора. 50 мкл (5x106 клеток на лунку) суспензии-помещали;в лунку, высушивали при температуре 4С в. течение ночи,, добавляли 50 мкл изопропанола и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Далее производили, отбор несвязавшегося материала и отмывали раствором ФБР-Т. К связавшимся-; клеткам или УЗД добавляли 5%-ное обезжиренное молоко в фосфатном- буфере и инкубировали 30 мин при5 37 С для блокировки неспецифических сайтов связывания. Далее лунки дважды промывали 0,05%-ным раствором ФБР-Т, а затем добавляли 100 мкл разведенной сыворотки с двухкратным шагом титрования в каждую лунку. После инкубации в течение 1 часа лунки промывали фосфатным буфером и добавляли 100 мкл антикроличьих антител, конъюгированных с пероксидазой. Инкубировали;в. течение 1 часа, пятикратно промывали фосфатным буфером и измеряли пероксидазную активность калориметрически при добавлении 0,04% о-фенилендиамина в 0,05 М цитрат-фосфатном буфере (рН 5,0) с 0,006% Н202. Реакцию проводили в- темноте в течение 10 мин при комнатной температуре и останавливали добавлением 50 мкл 4 н H0SO4. Учет результатов проводили с помощью планшетного фотометра "Униплан" при длине волны 492 нм.
В работе использовали латексные полиметилметакрилатные (ПММА) микросферы размером 440 нм производства "Диафарм" г. Санкт-Петербург (концентрация карбоксильных групп 2 мкг-экв/м ), а также размером 1 мкм и 800 нм производства США, покрытые антителами против S. typhimurium. В качестве антигена выступали клетки S. typhimurium. Контролем служили клетки Е. coli, не имеющие сродства к данным антителам. Активацию карбоксильных групп на поверхности латекса проводили следующим образом. В полиэтиленовые пробирки помещали 200 мкл 10%-ной суспензии латекса и раствор гидроксибензотриазола в сотношении 1:1 из расчета на мольное количество СООН-грушг латекса, затем, добавляли раствор карбодиимида1. Пробирки охлаждали при 0 С и-перемешиваншгв течение 15 мин. Чтобы обеспечить связывание антител с активными группами латекса, к осадку латекса после центрифугирования добавляли раствор JgG с концентрацией 300 мкг/мл в морфолиноэтансульфоновой кислоте (MES). Смесь оставляли при перемешивании в течение ночи. Для блокировки не связавшихся с JgG активных групп латекса осажденный на центрифуге препарат р есуспендировали в растворе бычьег о сывороточного альбумина (БСА) и перемешивали в течение 15-20 мин, после чего смесь вновь центрифугировали, осадок промывали в 50 мМ ФБР рН 7,5 и добавляли 0,01% азида натрия.
Активацию карбоксильных групп на поверхности латекса (размер микросфер 1мкм) проводили следующим образом. Латекс промывали в 0,1 М NaCl в 50 мМ ФБР рН 7 ,5, затем 50 мМ ФБР, после чего прогревали в водяной бане при е 56 С в течение 15 мин. Затем добавляли последовательно карбодиимид и иммуноглобулины при постоянном перемешивании. Оставляли смесь на 4 часа на шейкере при 37 С, после чего раствор центрифугировали 10 мин при 7000 об/мин и ресуспендировали в БСА для блокировки лишних активных групп.
Иммобилизацию иммуноглобулинов к латексу с активными аминогруппами (размер частиц 800 нм) проводили хорошо очищенным мономерным 8%-ным раствором глутарового альдегида (ГА). Для этого сначала латекс дважды промывали 50 мМ ФБР, центрифугировали 10 мин при 7000 об/мин, к осадку добавляли ГА и перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Затем суспензию центрифугировали, промывали 50 мМ ФБР и добавляли к ней раствор иммуноглобулинов. После последующего 10 мин центрифугирования при 7000 об/мин собирали супернатант и определяли в нем свободный белок по методу Лоури. Далее рассчитывали количество белка, связавшегося с латексом (емкость латекса).
