Введение к работе
Актуальность темы исследования. Туберкулез остается одной из самых распространенных инфекций в мире, представляя собой угрозу для населения большинства стран, включая экономически развитые. Примерно одна треть населения Земли инфицирована микобактериями туберкулеза. Как причина смерти туберкулез по-прежнему занимает одно из первых мест среди инфекционных заболеваний.
Положение усугубляется распространением туберкулеза, вызванного микобактериями с множественной лекарственной устойчивостью (т.е. устойчивыми одновременно к изониазиду и рифампицину - двум самым мощным противотуберкулезным препаратам) - МЛУ-ТБ, а также туберкулеза, вызванного микобактериями с широкой лекарственной устойчивостью (устойчивыми наряду к изониазиду и рифампицину к одному из фторхинолонов и любому из противотуберкулезных инъекционных препаратов второй линии - капреомицину, кана-мицину или амикацину) - ШЛУ-ТБ. По данным ВОЗ, только за один год (с 2008 по 2009 год) заболеваемость ШЛУ-ТБ выросла вдвое (WHO, 2010).
Во многих лабораториях, как в России, так и за рубежом огромное внимание уделяется поиску и разработке новых лекарственных препаратов, обладающих активностью против Mycobacterium tuberculosis. Для оценки их активности в условиях лаборатории используют биохимические, молекулярно-биологические и микробиологические методы. Наиболее информативными являются микробиологические методы. Их также применяют при определении минимальных подавляющих концентраций при расчете критических концентраций как «резервных» так и вновь разрабатываемых противотуберкулезных препаратов.
Как правило, при определении активности новых препаратов используют лабораторные референс-штаммы М. tuberculosis, однако они отличаются по своим свойствам от клинических, лекарственно устойчивых штаммов микобак-терий. Поэтому активность препаратов необходимо исследовать также и по отношению к клиническим штаммам М. tuberculosis.
Цель исследования
Разработать алгоритм определения противотуберкулезной активности химических соединений - потенциальных кандидатов в новые лекарственные препараты, основанный на использовании клинических штаммов М. tuberculosis, обладающих лекарственной устойчивостью.
Задачи исследования
-
Создать панель современных клинических штаммов М. tuberculosis, обладающих разной лекарственной чувствительностью и относящихся к разным генетическим семействам.
-
Определить основные параметры экспресс-микрометода для выявления противотуберкулезной активности новых химических соединений в отношении клинических штаммов М. tuberculosis, основанного на использовании флюоресцентного красителя Alamar Blue.
-
Изучить минимальные подавляющие (МПК) и минимальные бактерицидные концентрации (МБК) экспериментальных химических соединений в от-
ношении клинических штаммов М. tuberculosis в условиях макрообъемов, используя микробиологические пробирки.
4. Разработать алгоритм определения противотуберкулезной активности новых химических соединений с использованием клинических штаммов М. tuberculosis и оценить его эффективность при тестировании коллекций химических соединений - потенциальных лекарственных препаратов.
Научная новизна
Модифицирован экспресс-микрометод, основанный на использовании флюоресцентного красителя AlamarBlue, позволяющий выявлять противотуберкулезную активность у новых химических соединений.
Показана возможность использования модифицированного микрометода для ускоренного выявления бактериостатической или бактерицидной активности экспериментальных химических соединений, что позволяет сократить срок исследования почти в два раза.
Усовершенствованы микробиологические макрометоды определения минимальных подавляющих и минимальных бактерицидных концентраций химических соединений с использованием клинических штаммов М. tuberculosis, за счет изменения посевной концентрации, использования визуального учета при определении МПК и применения чашек со средой Middlebrook 7Н10 при определении МБК.
Теоретическая и практическая значимость работы
Модифицированные микро- и макрометоды определения противотуберкулезной активности новых химических соединений позволяют значительно снизить трудоемкость метода, сократить срок учета результатов и повысить их воспроизводимость.
Alamar Blue-метод позволяет осуществлять скрининг большого количества химических соединений с минимальными материальными и трудовыми затратами. С помощью метода протестировали более двух тысяч экспериментальных химических соединений.
Результаты экспериментальных исследований оформлены в виде двух методических рекомендаций «Определение противотуберкулезной активности фармакологических препаратов микробиологическими методами» и «Определение критических концентраций канамицина, капреомицина и офлоксацина, используемых для оценки лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis методом абсолютных концентраций на питательной среде Левен-штейна-Йенсена».
Методология и методы исследования
Работа основана на использовании экспериментальных методов исследования: микробиологических (культивирование микобактерий, определение лекарственной чувствительности), биохимических (биохимические тесты для идентификации М. tuberculosis), молекулярно-биологических (сполиготипиро-вание, Ю^ЬР-Ш/УО-типирование, MIRU-VNTR-типирование), а также культу-ральных (применение клеток линии НЕК 293) и биологических с использованием белых мышей.
Положения, выносимые на защиту
-
Подобранные параметры экспресс-микрометода AlamarBlue (длительность культивирования М. tuberculosis, время инкубации микобактерий с красителем, посевная концентрация клеток) позволяют выявлять противотуберкулезную активность новых химических соединений, исследуя большое количество соединений за короткий срок (3-5 суток).
-
Модифицированный Alamar Blue-метод может быть использован в качестве экспресс-метода для выявления бактериостатической или бактерицидной активностей химических соединений, что позволяет сократить срок эксперимента почти в два раза (с 56 до 33 дней).
-
Усовершенствованные макрометоды определения минимальных подавляющих и минимальных бактерицидных концентраций экспериментальных химических соединений с использованием клинических штаммов М. tuberculosis позволяют сократить срок учета результатов, снизить трудоемкость метода и повысить воспроизводимость результатов.
-
Разработанный алгоритм определения противотуберкулезной активности новых химических соединений позволяет в короткие сроки протестировать многочисленные библиотеки химических соединений с помощью микрометода AlamarBlue и выявить основные характеристики активных соединений с помощью макрометодов, а также оценить противотуберкулезную активность химических соединений по отношению к клиническим штаммам М. tuberculosis.
Степень достоверности и апробация результатов
Результаты диссертационной работы представлены и доложены на семи конференциях: VII межгосударственной научно-практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств» (Оболенск, 3-5 октября 2006 г.); 6-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2007» (Москва, 28-30 ноября 2007 г.); Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития и научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 6-7 декабря 2007 г.); Научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Биологическая безопасность в современном мире» (Оболенск, 21-22 апреля 2009 г.); Научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 25-27 мая 2010 г.); VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика-2010» (Москва, 24-26 ноября 2010 г.); III научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 31 мая-2 июня 2011 г.).
План и аннотация диссертации обсуждены и одобрены на заседании Ученого совета ГНЦ ПМБ 18 февраля 2011г. (протокол №2, приказ №46 от
25.02.2011 г.), с изменениями, утвержденными на заседании Ученого совета ГНЦ ПМБ от 29 января 2013 г. (протокол №2). Результаты исследований доложены на заседании межлабораторного семинара ГНЦ ПМБ 21 февраля 2013 г. (протокол № 27).
Публикации. Основное содержание работы отражено в 18 научных публикациях, в том числе в шести статьях, опубликованных в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждения, заключение, выводы, список сокращений и список литературы. Работа иллюстрирована 22 рисунками и 21 таблицей.
Похожие диссертации на Разработка комплексного подхода для выявления противотуберкулезной активности низкомолекулярных химических соединений
