Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 13
1. Введение. 13
2. Типы современных противотуберкулезных вакцин, их преимущества и недостатки .
2.1. Вакцина BCG. 14
2.2. Цельноклеточные вакцины. 15
2.3. Субъединичные вакцины . 16
2.4. ДНК-вакцины. 17
3. Дендритные клетки и их роль в иммунитете против туберкулёза . 18
3.1. Фагоцитоз и размножение М. tuberculosis в дендритных клетках. 20
3.2. Распознавание М. tuberculosis Toll-like рецепторами . 22
3.3. Влияние М. tuberculosis на созревание дендритных клеток. 24
3.4. Роль ДК в индукции адаптивного иммунного ответа на М. tuberculosis.
3.5. Изучение роли ДК при туберкулёзе in vivo. ЗО
4. Разработка новых противотуберкулёзных вакцин на основе ДК . 33
Материалы и методы 38
Результаты исследований 50
1. Выращивание дендритных клеток in vitro. 50
2. Способность дендритных клеток, выращенных in vitro, стимулировать пролиферативный ответ Т-клеток .
3. Сравнение функциональной активности дендритных клеток, выращенных в присутствии эмбриональной телячьей сыворотки
(ЭТС) и мышиной сыворотки (МС), in vivo.
4. Сравнительная фенотипическая характеристика дендритных клеток, выращенных в присутствии мышиной (МС) и эмбриональной телячьей (ЭТС) сыворотки.
5. Продукция цитокинов дендритными клетками, выращенными в присутствии мышиной сыворотки (МС) и эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС).
6. Протекция против туберкулёзной инфекции при вакцинации ДК. 66
Обсуждение 74
Выводы 80
Список литературы
- Субъединичные вакцины
- Распознавание М. tuberculosis Toll-like рецепторами
- Способность дендритных клеток, выращенных in vitro, стимулировать пролиферативный ответ Т-клеток
- Продукция цитокинов дендритными клетками, выращенными в присутствии мышиной сыворотки (МС) и эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС).
Субъединичные вакцины
В известном смысле альтернативой субъединичным вакцинам являются ДНК-вакцины, в которых вместо микробного антигена используется кодирующая его полинуклеотидная последовательность. Для генетической или полинуклеотидной вакцинации используют кольцевую двухнитевую ДНК бактериальной плазмиды, в которой экспрессия нужного (встроенного) гена находится под контролем сильного вирусного промотора [Donnelly J. J. et al., 1997]. К преимуществам этого типа вакцин следует отнести их сравнительную безопасность, простоту и дешевизну изготовления и введения (так называемый "генетический пистолет" позволяет обойтись без шприца для вакцинации), а также стабильность в организме. Недостатки же - отчасти общие с субъединичными вакцинами - ограниченное количество антигенных детерминант, слабая иммуногенность, и, как следствие, необходимость включения в ДНК-вакцину адъювантной составляющей, например последовательностей генов провоспалительных цитокинов или костимулирующих молекул [Huygen К. et al., 1996]. Хотя стоит отметить, что бактериальная ДНК сама обладает природными адъювантными свойствами, способствующими продукции ИЛ-12 (стимулирует естественные клетки-киллеры и цитолитические Т-клетки, а также стимулирует развитие иммунного ответа в направлении Т-хелперов типа 1), ИЛ-6 (стимулирует В-клетки и способствует продукции антител), а также ИФН-у и ИФН-а - основных медиаторов ответа по варианту Т-хелперов типа 1 [Klinman D. М. et al., 2006]. Эффективность ДНК-вакцинации можно повысить за счет включения в состав плазмиды последовательности, кодирующей GM-CSF - фактора роста и дифференцировки дендритных клеток [Xiang Z. et al., 1995]. На более или менее продвинутой стадии преклинического тестирования находятся в настоящее время несколько вариантов противотуберкулезных ДНК вакцин, кодирующих различные белковые антигены микобактерий. [Baldwin S. L. et al., 1999; Dillon D. С, 1999; Tanghe A. et al., 1999,2000; Lowrie D. B. et al., 2006].
После открытия дендритных клеток (ДК) более 30 лет тому назад [Steinman R. М. et al., 1973] была показана их центральная роль в запуске и контроле протективного иммунного ответа хозяина против патогенов [Steinman R. М. et al., 2001]. ДК определяют способность организма хозяина отличать патогены от собственных антигенов, индуцировать как первичную, так и вторичную Т-клеточную активацию, контролируя, таким образом, иммунитет к патогену, определять природу ответа Т-хелперов (ТЫ или Th2) [Lanzavecchia А. et al., 2001], устанавливать толерантность к чужеродным антигенам, когда это необходимо. ДК, образующиеся из костно-мозговых предшественников, выходят в кровяное русло и перемещаются к периферическим органам, таким, как лёгкие [Del Hoyo G. М. et al., 2002]. В крови обнаруживаются различные субпопуляции ДК и предшественники ДК, включая CD 11-позитивные миелоидные ДК, CD 123-позитивные плазмоцитоидные ДК и моноцитарные предшественники тканевых ДК. На периферии, где в основном обнаруживаются миелоидные ДК и клетки Лангерганса, они играют центральную роль в индукции и контроле иммунного ответа на микробные антигены. Напротив, плазмоцитоидные ДК, находящиеся в основном в крови, играют важную роль в раннем иммунном ответе на вирусные инфекции, секретируя большое количество а-интерферона (ИФН-а) [Siegal F. P. et al., 1999].
К настоящему времени точно установлено, что ДК вовлечены в индукцию протективного иммунного ответа на микобактерий туберкулёза. После попадания микобактерий при вдохе в лёгкие, они захватываются лёгочными альвеолярными макрофагами. Бактерии заселяют их и размножаются внутри клеточных фагосом, где их способность блокировать закисление и слияние с лизосомами позволяет им выживать в макрофаге [Sturgill-Koszycki S. et al., 1994]. Контроль роста микробов фагоцитами зависит от активации инфицированных макрофагов цитокинами, такими, как ИФН-у, продуцируемыми в основном антиген-специфическими Т-клетками и NK-клетками [Flynn, J. L. et al., 2001]. Лёгочные ДК могут играть центральную роль в организации и управлении протективным иммунным ответом в лёгких, поскольку они располагаются как вдоль поверхности эпителия, так и в соединительной ткани лёгкого [Sertl К. Т. et al., 1986]. Кроме того, во время тканевого воспаления, вызванного проникновением патогенов, наблюдается переход предшественников ДК из кровяного русла в лёгкие [Banchereau J. et al., 2000]. Такие ДК распознают и захватывают антигены, в том числе и М. tuberculosis [Steinman R. М., 2001]. Захват антигена сопровождается морфологическими, фенотипическими и функциональными изменениями ДК, способствующими оптимальному развитию адаптивного иммунного ответа. ДК презентируют Аг лимфоцитам в контексте как молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС) [Banchereau J. et al., 1998], так и неклассических молекул, таких как CD1 [Gumperz J. Е. et al., 2001], и контролируют ответ лимфоцитов через межклеточные контакты и продукцию цитокинов. В ответ лимфоциты дифференцируются, пролиферируют, выполняют различные эффекторные функции (которые могут включать развитие периферической толерантности) и могут превращаться в клетки памяти.
ДК связывают антигены через поверхностные лектины С-типа и Fcy/Fce рецепторы. Фагоцитоз частиц и интактных организмов осуществляется через рецептор-опосредованный эндоцитоз [Reis е Sousa С. et al., 1993; Jiang W. W. et al., 1995; Sallusto F. et al., 1995; Enering A. J. et al., 1997; Fanger N. A. et al, 1996; Tan M. С et al., 1997]. Эти же рецепторы могут быть вовлечены в фагоцитоз клеточного дебриса после апоптоза и некроза [Moll Н., 1993; Rubartelli A. et al., 1997; Albert М. L. et al., 1998], а также и в захват внеклеточных растворённых веществ с помощью микропиноцитоза [Sallusto F. et al, 1995]. Эндоцитоз микобактерий туберкулёза происходит через специализированный лектин С типа, известный как ДК-ассоциированный ICAM-3-незахватывающий интегрин, или DC-SIGN [Geijtenbeek Т. В. Н. et al., 2003; Tailleux L. et al., 2003]. DC-SIGN взаимодействует с комплексом манноза-липоарабидоманнан (Ман-ЛАМ) клеточной стенки М. tuberculosis, специфически связываясь с димерами и тримерами маннозных остатков [Figdor С. G. et al., 2002; Geijtenbeek Т. В. Н. et al., 2003; Tailleux L. et al., 2003]. Непатогенные бактерии окружающей среды, такие, как М. smegmatis, теряют маннозный остаток на ЛАМ и не могут взаимодействовать с DC-SIGN. Поскольку DC-SIGN-опосредованный захват связан со специфической активацией ДК (см. ниже), тип ЛАМ, представленного на поверхности микобактерий, скорее всего определяет природу индуцируемого иммунного ответа. Связывание М. tuberculosis с DC-SIGN сопровождается переносом патогена во внутриклеточные мембранные структуры, содержащие ассоциированный с лизосомой мембранный белок (LAMP-l) [Geijtenbeek Т. В. Н. et al., 2003; Tailleux L. et al., 2003]. ЬАМР-1+-компартменты внутри ДК могут созревать до эндосом/лизосом, способствуя процессингу и презентации антигена, что подтверждается презентацией Ман-ЛАМ Т-клеткам через CD lb [Enering A. J. et al., 1997; Prigozy T. I. et al., 1997]. После взаимодействия DC-SIGN с Ман-ЛАМ, экспрессия рецептора на поверхности ДК понижается [Geijtenbeek Т. В. Н. et al., 2003]. Поглощение М. tuberculosis мышиными и человеческими ДК было показано во многих исследованиях как in vitro [Inaba К. et al, 1993; Henderson R. A. et al., 1997; Stenger S. et al., 1998; Fortsch D. M. et al, 2000; Bodnar K. A. et al., 2001; Giacomini E. et al., 2001; Hanekom W. A. et al., 2002], так и in vivo [Jiao X. et al., 2002]. После захвата мышиными ДК, выращенными из костного мозга, вирулентные микобактерий туберкулёза размножаются внутри клеток. Тем не менее, степень размножения зависит от зрелости ДК [Bodnar К. A. et al., 2001]: когда ДК впервые активируются ИФН-у или липополисахаридами (ЛПС), микобактериальный рост ингибируется, хотя микроорганизмы, возможно, остаются живыми. После внутривенного заражения мышей М. bovis BCG, микобактериальный рост также не наблюдается в ДК селезёнки, подтверждая то, что ДК ингибируют рост этих непатогенных микобактерий [Jiao X. et al., 2002]. Изучение репликации М. tuberculosis в человеческих ДК привело к противоречивым результатам. Tailleux L. и др. показали, что выращенные из моноцитов незрелые ДК блокируют размножение М. tuberculosis [Tailleux L. et al., 2003]. Напротив, Fortsch D. M. и др. обнаружили размножение микобактерий внутри таких клеток [Fortsch D. М. et al., 2000]. Добавление ИЛ-10 к выращенным из моноцитов незрелым ДК приводило к реверсии клеточного фенотипа в сторону макрофагоподобных клеток и ингибировало микобактериальный рост.
Распознавание М. tuberculosis Toll-like рецепторами
Как обсуждалось выше, ДК регулируют адаптивный иммунный ответ на М. tuberculosis, стимулируя активацию и пролиферацию наивных Т-клеток и Т-клеток памяти в регионарных лимфатических узлах. Адаптивный иммунный ответ на М. tuberculosis включает в себя генерацию эффекторных субпопуляций Т-клеток [Flynn J. L. et al., 2001; Boom W. H. et al., 2003], включая CD4+ и CD8+ Т-клетки, у5-Т-клетки и CDl-рестриктированные Т-клетки. Хоминг нагруженных антигеном ДК и переход Т-клеток в Т-клеточные зоны регионарных лимфоузлов в ответ на CCL19 и CCL21 [Forster R. et al., 1999; Robbiani D. F. et al., 2000] располагают клетки оптимально для ДК-Т-клеточного взаимодействия. Т-клеточная дифференцировка и пролиферация происходят в зонах ДК-Т-клеточных кластеров [Yoneyama Н. et al., 2005] и, как было показано, антигенспецифичные Т-клетки могут эффективно связываться с ДК как в культуре, так и in vivo [Inaba К. et al., 1984, 1985; Ingulli E. et al., 1997; Yoneyama H. et al., 2005]. Существует гипотеза о том, что TCR на покоящихся Т-клетках внутри таких кластеров «сканирует» поверхность ДК, чтобы найти связанный с МНС пептид [Steinman R. М. et al., 2004]. Это достигается посредством связывания DC-SIGN с ICAM-3, экспрессируемым на поверхности покоящихся Т-клеток [Geijtenbeek Т. В. Н. et al., 2000]. Примирование усиливается в присутствии костимуляторных молекул, продуцируемых ДК цитокинов, таких как ИЛ-12 и ИЛ-18, и таких низкомолекулярных усиливающих агентов, как цистеин [Angelini G. et al., 2002]. Активированные бласты Т-клеток покидают регионарные лимфоузлы, перемещаясь в зоны воспаления, например в лёгкие. Миграция осуществляется при уменьшении экспрессии как лиганда, так самого CCR7 и L-селектина (CD62L), и увеличении экспрессии CD44 и лиганда гликопротеина Р-селектина [Steinman R. М. et al., 2004]. Таким образом, клетки перенаправляются в воспалённые ткани, где активированные Т-клетки распознают и взаимодействуют с антигенами на клеточной поверхности различных клеток, включая наиболее важные в случае с М. tuberculosis заражённые альвеолярные макрофаги.
Активация макрофагов, ведущая к усилению контроля над репликацией М. tuberculosis, зависит от двух важных цитокиновых сигналов, ИФН-у и TNF-а. ИФН-у продуцируется довольно рано при иммунном ответе на М. tuberculosis NK Т-клетками в ответ на липидные и гликолипидные антигены, презентируемые в контексте CD1 [Emoto М. et al., 1999], и уб-Т-клетками в ответ на пирофосфатные, нуклеотидные и алкиламиновые антигены [Boom W. Н., 1999]. С момента запуска адаптивного иммунного ответа, ИФН-у в основном производится Thl CD4+ и С08+-Т-клетками. ДК индуцируют созревание Thl-клеток в ИФН-у-продуцирующие ТЫ-клетки через секрецию ТЫ-поляризующих цитокинов, включая ИЛ-12, ИЛ-18, ИЛ-23, и, возможно, ИФН-а [Kalinski P. et al., 1999; Kadowaki N. et al., 2000; Ebner S. et al., 2001]. В результате ТЫ-клетки, примированные и размножившиеся в ответ на антигены М. tuberculosis, презентируемые ДК в регионарных лимфоузлах, перемещаются в место инфекции, например в лёгкие, где они высвобождают ИФН-у, активируя заражённые макрофаги для контроля над репликацией бактерий. TNF-a секретируется CD4+ Т-клетками и макрофагами аутокринным способом [Thurnher M. et al., 1997]. Это ключевой цитокин, вовлечённый в поддержание архитектуры гранулёмы [Lukas N. W. et al., 1994], регуляцию секреции хемокинов и экспрессии хемокиновых рецепторов (которые вместе направляют прибывающие клетки в сайты инфекции) и контроль активации макрофагов [Flesch I. Е. et al., 1992]. ИФН-у и TNF-a вместе индуцируют активацию макрофагов, которая сопровождается стимуляцией индуцибельной синтетазы окиси азота, активных форм азота и окисляющих эффекторных молекул [Ulrichs Т. et а!., 2004]
Несмотря на огромное количество исследований взаимодействия между М. tuberculosis и ДК in vitro, относительно немного известно о последовательности событий, происходящих при заражении М. tuberculosis in vivo. Работы на модели с крысами показали, что у новорожденных животных в стенке респираторного тракта присутствует только очень небольшое количество ДК, экспрессирующих МНС II класса на очень низком уровне [Nelson D. J. et al., 1995]. Так как новорождённые и дети младше 1 года особенно подвержены некоторым формам диссеминированного туберкулёза, можно предположить, что сниженная способность контролировать эту инфекцию в этом возрасте частично связана с качественными и количественными отличиями ДК респираторного тракта.
Следует также обратить внимание на значение секреции хемокинов и экспрессии рецепторов к ним, участвующих в привлечении ДК в сайты инфекции во время активного туберкулёза. Хоминг ДК в лёгкие управляется локальной секрецией хемокинов и экспрессией рецепторов к хемокинам на их поверхности. Было показано, что CD 1 -предшественники миелоидных ДК крови экспрессируют CCR2, который направляет ДК в лёгкие в ответ на белок-хемоаттрактант моноцитов (МСР-1) [Sallusto F. et al., 1998]. И действительно, мыши, у которых «нокаутирован» ген CCR2, при заражении М. tuberculosis быстро погибают - 90% животных погибают к 24 дню [Peters W. et al., 2001]. Кроме того, миграция ДК в регионарные лимфатические узлы у таких мышей уменьшается, что указывает на дефект нормального трафика ДК в отсутствии экспрессии CCR2. В отличие от мышей с «нокаутированным» геном CCR2, «выключение» гена МСР-1 лишь незначительно влияло на течение туберкулёзной инфекции. Это говорит о том, что другие лиганды, такие как МСР-2, МСР-3 и МСР-5, могут компенсировать отсутствие МСР-1. Другие исследования на мышах подтвердили, что ДК приходят из крови в сайты инфекции уже через 3 дня после аэрозольного заражения М. tuberculosis [Iyonaga К. et al., 2002; Gonzalez-Juarrero M. et al., 2003; Peters W. et al., 2003]. При хронической инфекции, переход основной массы ДК в лёгкие происходит к 3-ему дню, что было определено при изучении радиационных химер [Holt P. G. et al., 1994; McWillam A. S. et al., 1994]. Тем не менее, при остром воспалении быстрое привлечение предшественников ДК и стимуляция миграции ДК приводят к клеточной реорганизации уже через 36-48 часов. Иммуногистохимическое исследование на мышах, которым ввели внутривенно шарики из сефарозы, покрытые PPD, показало, что уже через 1 день после введения ДК были расположены около таких шариков. Через 3 дня ДК находились по всей гранулёме рядом с лимфоцитами, повышая вероятность межклеточных контактов и локальной стимуляции инфильтрирующих Т-клеток [Iyonaga К. et al., 2002]. Таким образом, привлечение ДК из кровяного русла в гранулёму может усиливать иммунный ответ на М. tuberculosis посредством повышения стимуляции Т-клеток. После формирования хронической фазы туберкулёзной инфекции общее число ДК в лёгких уменьшается, одновременно с увеличением экспрессии костимуляторных молекул на их поверхности [Gonzalez-Juarrero М. et al., 2003].
Изучение человеческих ДК из периферической крови показало снижение числа циркулирующих CD11+ миелоидных ДК в крови пациентов с активным туберкулёзом, по сравнению со здоровыми людьми того же возраста [Uehira К. et al., 2002]. Кроме уменьшения общего числа циркулирующих ДК, клетки, окрашивающиеся на фасцин (связывающий актин белок, характерный для зрелых ДК, клеток Рида-Стернберга при болезни Ходжкина и В-клеток, заражённых вирусом Эпштейна-Барра [Pinkus G. et al., 1997]), обнаруживались в гранулёмах пациентов с активным туберкулёзом. Накопление таких клеток в лимфоцитарных зонах гранулём может быть результатом привлечения их из кровяного русла в ответ на М. tuberculosis. Возможно, тем не менее, что фасцин+-клетки представляют собой моноциты, которые дифференцировались в ДК, созрели и переместились в ткани в ответ на М. tuberculosis и локальное присутствие цитокинов.
Способность дендритных клеток, выращенных in vitro, стимулировать пролиферативный ответ Т-клеток
Для более полной функциональной характеристики ДК мы исследовали продукцию ими ключевых регуляторных и эффекторных цитокинов на различные сроки культивирования. Оказалось, что ДК, выращенные в присутствии МС и ЭТС, отличаются и по цитокиновому спектру. Как показано на рисунке 10, стимуляция микобактериальными антигенами ДК обоих типов приводит к увеличению продукции ими ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-12 и TNF-a по сравнению с нестимулированными контрольными клетками. Выращенные на ЭТС ДК производили значительно большее количество всех четырех цитокинов по сравнению с ДК, выращенными на МС. Тем не менее, последние также отвечали на стимуляцию антигенами и приобретали свойства более зрелых клеток. Хотя эти данные подтверждают, что выращенные в присутствие МС ДК являются менее эффективными АПК, мы предположили, что их способность активировать Т-клетки может возрастать после их дозревания in vivo. Действительно, как показано на Рис. 3, ДК, выращенные в присутствии МС, способны индуцировать специфический Т-клеточный ответ in vivo, но не обладают подобной активностью в системе in vitro (данные не приводятся). Имея в виду способность выращенных на МС ДК индуцировать антиген-специфический Т-клеточный ответ in vivo, во всех экспериментах по вакцинации, описанных ниже, мы использовали только такие клетки. Б: ИЛ-6
При определении наиболее эффективного пути вакцинации для индукции протекции против туберкулёзной инфекции группы мышей В6 были провакцинированы дважды (с интервалом 2 недели между 1-й и 2-й вакцинациями) нагруженными и ненагруженными антигеном ДК (2x106 клеток на мышь) подкожно, внутривенно и внутритрахеально. Через 3 недели после второй вакцинации мыши были заражены вирулентными микобактериями внутривенно, ещё через 5 недель после заражения было подсчитано число КОЕ в лёгких и селезёнках зараженных животных.
Как показано в таблице 1, подкожная вакцинация нагруженными ДК приводит к значительному уменьшению числа микобактерий в обоих органах, с более выраженным протективным эффектом в селезенке (уменьшение в -10 раз) по сравнению с лёгкими (уменьшение в 2,5 раза). Эффект вакцинации был слабее при внутритрахеальном введении ДК и совсем отсутствовал при внутривенном введении. Кроме того, увеличение дозы вакцинации до 5х106 ДК на мышь и числа вакцинаций (до 3), приводило к некоторому усилению эффекта вакцинации, выраженному в уменьшении числа микобактерий в органах (данные не приведены). Одним из общепринятых показателей эффективности противотуберкулезной вакцины является продукция ИФН-у в организме хозяина. Для того, чтобы проверить, сопровождается ли иммунный ответ, индуцируемый in vivo введением ДК, увеличением продукции ИФН-у, мы определили число ИФН-у-продуцирующих клеток в лёгких и лимфоузлах вакцинированных животных перед заражением, используя метод ELISPOT. Для этого мышей В6 трижды иммунизировали подкожно ДК, нагруженными соникатом микобактерий. Через 3 недели после последней инъекции в легких и лимфоузлах подопытных мышей определяли количество ИФН-у-продуцирующих клеток. Как показано на рисунке 11, вакцинация приводит к значительному (Р 0,001; Г-тест Стьюдента) увеличению доли ИФН-у-продуцирующих клеток как в лёгких, так и в лимфатических узлах. Эти результаты подтверждают участие таких клеток в индуцированной вакциной на основе ДК протекции в модели летального туберкулёза.
Количество ИФН-у-продуцирующих клеток в лёгких и лимфоузлах животных после трёхкратной вакцинации нагруженными ДК (по методу ELISPOT). Основываясь на результатах о различном количестве ИФН-у-продуцирующих клеток в лёгких и лимфоузлах животных после трёхкратной вакцинации нагруженными ДК по сравнению с контрольными животными, мы предположили, что контрольные и вакцинированные животные могут также отличаться по содержанию активированных лимфоцитов (CD44+CD62L ) в органах. Для этого мышей В6 провакцинировали трижды подкожно ДК, нагруженными антигеном, а затем, через 3 недели после последней вакцинации, определили процентное содержание таких лимфоцитах в лёгких и лимфоузлах.
Количество активированных клеток с фенотипом CD44+CD62L_ в лёгких и лимфоузлах животных после трёхкратной вакцинации нагруженными ДК (по методу проточной цитофлуориметрии). Оказалось, что иммунизация нагруженными ДК приводит к значительному (Р 0,05) увеличению содержания как общего пула активированных клеток, так и содержания активированных CD4+- и CD8+-лимфоцитов (Рис. 12) в лёгких животных. В лимфоузлах животных эффект вакцинации был выражен слабее, тем не менее, процентное содержание активированных СБ8+-лимфоцитов также оказалось достоверно выше у иммунизированных мышей. В селезёнке вакцинированных животных изменения содержания активированных клеток не происходит (данные не приведены).
Чтобы выяснить, как вакцинация ДК влияет на лёгочную патологию, вызванную заражением М. tuberculosis H37Rv, мы провакцинировали мышей В6 подкожно дозой 2x106 ДК на мышь и сравнили морфологию лёгочной ткани вакцинированных и контрольных животных через 6 недель после внутривенного заражения средней дозой (2x105 КОЕ) М. tuberculosis H37Rv. Как показано на рисунке 13, у вакцинированных ДК мышей (Рис. 13Б) лёгочная патология проявляется в основном в утолщении альвеолярных перегородок из-за умеренной инфильтрации их смесью нейтрофилов, лимфоцитов и макрофагов, по сравнению с лёгкими незаражённых животных (Рис. 13А). В отличие от провакцинированных, у невакцинированных заражённых животных развивается тяжёлая лёгочная патология, выражающаяся в массивной инфильтрации альвеол и формировании многочисленных пневмонических очагов с признаками некроза в зонах слияния этих очагов (Рис 13В). Таким образом, вакцинация ДК, нагруженными микобактериальными антигенами, уменьшает тяжесть лёгочной патологии при заражении вирулентными микобактериями.
Продукция цитокинов дендритными клетками, выращенными в присутствии мышиной сыворотки (МС) и эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС).
Во-первых, выращенные на ЭТС и нагруженные антигенами ДК могут презентировать Т-клеткам не только компоненты микобактериального сониката, но и гетерологичные антигены эмбриональной телячьей сыворотки, постоянно присутствующие во время выращивания ДК in vitro. Многочисленные ЭТС-специфичные Т-клоны могут рестимулироваться in vitro (все тесты проводились в среде с ЭТС), маскируя, таким образом, «соникат-специфический» компонент ответа «неспецифической» пролиферацией. По определению, Т-клетки толерантны к компонентам аутологичной сыворотки, поэтому специфичный к микобактериям ответ чётко наблюдается после иммунизации ДК, выращенных на МС (Рис. ЗБ).
Во-вторых, неспецифическая Т-клеточная активация может возникать из-за «байстендер-эффекта», вызываемого выращенными на ЭТС ДК через сеть цитокиновых взаимодействий. Как показано на рисунке 10, выращенные на среде, содержащей ЭТС, ДК производят in vitro значительно большее количество регуляторных цитокинов, чем ДК, выращенные на МС. Увеличение экспрессии костимуляторных молекул и высокий уровень секреции регуляторных цитокинов, таких как TNF-a, ИЛ-1, ИЛ-6 и ИЛ-12, в ответ на микобактериальную инфекцию, был показан для ДК человека, выращенных из клеток периферической крови [Henderson R. A. et аі., 1997], и ДК, выращенных из клеток костного мозга мышей [Demangel С. et al., 1999]. В нашей системе стимуляция микобактериальным соникатом также была необходима для продукции цитокинов in vitro (Рис. 10). Тем не менее, избыток биологически активных молекул in vivo возможен, особенно у мышей, живущих в нестерильных условиях, и введение ДК может приводить к локальной Т,-клеточной активации даже в отсутствие микобактериальных антигенов (Рис. ЗА). Ясно, что более зрелые и продуцирующие больше цитокинов ДК, выращенные на ЭТС, должны обладать более выраженным «байстендер-эффектом» на Т-клетки, чем ДК, выращенные в присутствии МС. Недавно было показано, что после вакцинации мышей экзогенными ДК, их эндогенные ДК приобретают способность активировать Т-клетки неспецифически вместе с активной ре-презентацией антигенных пептидов [Kleindienst P. et al., 2003].
Другим интересным свойством, обнаруженным при вакцинации с помощью ДК, является способность ДК, выращенных в присутствии МС, вызывать значительную протекцию против последующего заражения микобактериями туберкулёза (Таблица 1, Рис. 14), несмотря на меньшую степень зрелости этих клеток (Рис. 5) и относительно невысокий уровень продукции цитокинов (Рис. 10). Более того, вакцинация ДК, выращенными в среде, содержащей МС, приводит к значительному накоплению в лимфатических узлах и лёгких активированных лимфоцитов (Рис. 12) и ИФН-у-продуцирующих клеток (Рис. 11), считающихся очень важными, активирующими макрофаги, хелперными клетками иммунного ответа при туберкулёзе [Banchereau J. et al., 1998]. He смотря на то, что нам не удалось получить вторичный Т-клеточный ответ in vitro при культивировании Т-клеток с нагруженными антигенами и выращенными на МС ДК, те же самые ДК способны активировать иммунный ответ in vivo. Можно предположить, что in vitro отсутствуют некие факторы, которые присутствуют in vivo и могут способствовать дозреванию ДК в организме. По-видимому, дозревание ДК происходит in vivo в результате взаимодействия с другими клетками и молекулами (природа этого не изучалась нами и остаётся в основном неизвестной), что приводит к увеличению времени жизни введенных ДК в реципиентах. Вместе с тем, ДК приобретают способность презентировать антигены и активировать наивные Т-клетки. В этом случае особенно интересна возможная вспомогательная роль нейтрофилов. Результаты, показанные на рисунках 5, 6 и 9 подтверждают, что ДК, выращенные в присутствии ЭТС, остаются в тесном контакте со множеством нейтрофилов, тогда как в культурах с МС нейтрофилов остаётся немного. Это может сильно влиять на созревание ДК и продукцию ими цитокинов. Недавно было показано для человека и мышей, что как TNF-a, так и клеточные контакты между ДК и нейтрофилами необходимы для созревания ДК [Bennouna S. et al., 2003, 2005; Van Gisbergen К. P J. M. et al., 2005]. Наличие большего количества нейтрофилов и высокий уровень продукции TNF-a в культуре с добавлением ЭТС (Рис. 5, 6, 9, 10) могут быть причиной того, что выращенные на ЭТС ДК обладают более зрелым фенотипом и индуцируют Т-клеточный ответ in vitro. С другой стороны, туберкулёзная инфекция вызывает значительный приток нейтрофилов в место заселения микобактерий [Eruslanov Е. В. et al., 2005], и взаимодействие между такими инфильтрирующими нейтрофилами и примированными in vitro и адоптивно перенесёнными ДК может завершать процесс созревания ДК, приводя к оптимальной активации Т-клеток.
Другим возможным объяснением может служить перенос микобактериальных антигенов или даже фрагментов мембран, содержащих МНС II класса в комплексе с пептидами от экзогенных ДК, которые способны презентировать антиген Т-клеткам, запуская Т-клеточное распознавание [Harshyne L. A. et al., 2001; Kleindienst P. et al., 2003]. Тем не менее, независимо от механизма индукции, главным результатом вакцинации выращенными на МС ДК была их способность индуцировать высоко специфичный Т-клеточный ответ (Рис. ЗБ) и защиту против экспериментальной туберкулезной инфекции (Рис. 14). Тот факт, что защита против туберкулёза, вызванная выращенными в присутствии МС ДК, имеет все признаки антигенной специфичности, указывает на то, что вакцинация скорее индуцирует классический иммунный ответ и образование клеток памяти. Способность плазмоцитоидных ДК вырабатывать большое количество интерферонов 1 типа в ответ на широкий спектр вирусов, или то, что ДК на ранней стадии дифференцировки продуцируют МІР-1, MIP-2 и TNF-a в ответ на бактериальные стимулы [Mansour Haeryfar S. М., 2005], может, конечно, вызывать протективный противотуберкулёзный эффект, но он не является антиген-специфичным. С другой стороны, хорошо известная толерогенная активность незрелых ДК [Finkelman F. D. et al., 1996; Lutz M. В. et al., 2000; Hawiger D. et al., 2004] может также иметь место в нашей системе, уменьшая лёгочное воспаление после заражения туберкулёзом (Рис. 13) и являясь дополнительным неспецифическим механизмом защиты хозяина.
Вопрос о специфичности индуцированного ДК иммунитета особенно важен. ДК обычно выращивают in vitro в присутствии 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), то есть высоких концентраций чужеродных белков. Выращенные таким способом ДК, скорее всего, обладают способностью презентировать эти белки Т-клеткам хозяина после активации in vivo при иммунизации мышей ДК. Такая неспецифическая «байстендерная» реакция может даже обладать неким протективным эффектом благодаря индуцированной Т-клеточной пролиферации и продукции цитокинов; но при этом теряется самое важное свойство истинной вакцины - специфичная иммунологическая память. Поскольку неотъемлемым свойством иммунологических исследований является специфичность, можно считать, что ДК, выращенные в присутствии МС и нагруженные антигеном, представляют собой гораздо более надежный инструмент для изучения иммунного ответа по сравнению с ДК, выращенными традиционными методами.
