Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1.Этиология заболевания 11
1.1.1 . Характеристика возбудителя 12
1.1.2, Факторы вирулентности 15
1.1.2.1. Адгезивные свойства 15
1.1.2.2. Токсигенные свойства 17
1.1.2.3. Гемолитические и колициногенные свойства 20
1.1.3. Этиологическая структура заболевания 22
1.1.4. Патогенез заболевания 24
1.2. Диагностика заболевания 25
1.3. Лечение колибактериоза поросят 31
1.4. Профилактика заболевания 40
1.4.1. Неспецифическая профилактика колибактериоза 42
1.4.2. Специфическая профилактика колибактериоза 44
1.4.2.1. Профилактика с использованием инактивированных вакцин 46
1.4.2.2. Профилактика с использованием живых вакцин... 54
2. Собственные исследования 61
2.1. Материалы и методы исследований 61
2.1.1. Объекты исследований 61
2.1.2. Методы исследований 61
2.1.2.1. Изучение культуральных, морфологических, серологических, биохимических и вирулентных свойств эшерихий 61
2.1.2.2. Изучение энтеротокси генных свойств эшерихий 63
2.1.2.3. Изучение генетических особенностей токсин-продуцирующих штаммов эшерихий и молекулярной массы термолабильного токсина 65
2.1.2.4. Методы определения фагоцитарной активности нейтрофилов в отношении токсинпродуциругощих штаммов эшерихий 66
2,1.2.5. Определение эффективности экспериментальной вакцины из штамма Е. coli Б-5
2.2. Результаты исследований и их обсуждение 71
2.2.1. Морфологические, культуральные, биохимические, серологические и биологические свойства эшерихий, выделенных от больных колибактериозом поросят 71
2.2.2. Определение способности к продукции токсинов авиру-лентных культур Е. coli, выделенных от больных колибактериозом поросят 75
2.2.2.1. Биохимические свойства токсшшродуцирующих штаммов Е. coli А-5 и Е, coli Б-5
2.2.2.2. Скрининг внехромосомных репликонов у токсин продуцирующих штаммов Е. coli А-5 и. соИЪ-5 78
2.2.2.3.Изучение чувствительности токсинпродуцирующих штаммов Е. coli А-5 и Е. coli Б-5 к антибиотикам...82
2.2.3. Изучение фагоцитарной активности нейтрофилов в отношении бактериальных клеток токсинпродуцирующих штаммов Е. coli А-5 и Е. coli Б-5 83
2.2.4. Изучение основных свойств штамма Е. coli Б-5 - продуцента термолабильного токсина
2.2.5. Результаты исследований эффективности экспериментальной вакцины из штамма Е. coli Б-5 на лабораторных животных, свиноматках и поросятах 97
2.2.6. Результаты производственных испытаний экспериментальной вакцины из штамма Е. coli Б-5 103
Заключение 109
Выводы 116
Практические предложения 117
Список использованных литературных источников 118
Приложения 148
- Характеристика возбудителя
- Профилактика с использованием инактивированных вакцин
- Методы определения фагоцитарной активности нейтрофилов в отношении токсинпродуциругощих штаммов эшерихий
- Изучение фагоцитарной активности нейтрофилов в отношении бактериальных клеток токсинпродуцирующих штаммов Е. coli А-5 и Е. coli Б-5
Введение к работе
Актуальность темы. Колибактериоз - остро протекающая инфекционная болезнь молодняка сельскохозяйственных животных, вызываемая патогенными серогруппами Escherichia coll
Заболевание в нашей стране представляет серьёзную эпизоотологическую проблему, что обусловлено финансовыми трудностями хозяйств, низким уровнем проведения ветеринарно-санитарных мероприятий, а также отсутствием эффективных профилактических препаратов. Кроме того, быстрый рост антибиотикорезистентности возбудителя приводит к трудностям при лечении инфекции (Бурдейный, 1995). В связи с этим создание новых эффективных способов вакцинопрофилактики колибактериоза является перспективным направлением в ветеринарной науке и практике.
Исследования по разработке иммуногенных препаратов против эшерихиоза ведутся во многих странах. Широкое распространение получила вакцина, запатентованная в США, Англии и Франции, против колибактериоза свиней (Dobrescu, Huygelen, 1976). Существуют разработки по созданию вакцин с токсинами и анатоксинами E.coli для получения иммуногенных препаратов с широким спектром действия. К ним относятся поливалентные инактивированные вакцины, созданные американскими и бельгийскими учеными (Dobrescu, Descamps, Brown, 1984).
В нашей стране М.К. Пирожковым и О.А. Тугариновым (1994) разработана формол-тиомерсаловая вакцина против колибактериоза поросят, которая создает напряженный колостральныи иммунитет и позволяет сократить заболеваемость поросят от эшерихиоза. Группой ученых Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Коваленко предложена вакцина, которая, по мнению авторов (Соколова с соавт., 1993), обладает высокими иммуногенными и протективными свойствами и найдет широкое применение в хозяйствах не благополучных по колибактериозу.
7 В ряде случаев инактивированные вакцины, наряду с положительным
действием могут вызывать аллергические реакции при добавлении к ним
адъювантов, нарушать естественные процессы пищеварения за счёт
изменения количественного и качественного состава микрофлоры, а также
требуют дополнительных трудозатрат из-за многократного введения
(Русалеев, Гневашев, Прунтова, 2001).
Кроме инактивированных вакцин существуют некоторые варианты изготовления живых вакцин. Препараты этого вида имеют ряд преимуществ, так как создают иммунитет высокой напряженности и длительности, приближающийся к постинфекционному, а также полностью сохраняют антигенный набор возбудителя (Радчук, 1991). Так, например, чешскими исследователями разработана вакцина для перорапьного введения (Zadnikova, Sourek, 1987). Известна также живая пероральная вакцина для профилактики коли бактериоза поросят, содержащая бульонную культуру двух штаммов Е. coli, выделенных от поросят при энтеритной форме болезни (Kohler, Gross, ВоЫ, 1975).
Анализ литературы показал, что известные живые пероральные вакцины не нашли широкого применения в свиноводстве, и для профилактики колибактериоза используют, как правило, инактивированные вакцины. Поэтому, разработка и применение живых вакцин против колибактериоза, которые обеспечат нейтрализацию энтеротоксинов эшерихий, как основного фактора вирулентности в патогенезе колиинфекции, будет являться наиболее эффективным воздействием, направленным на предупреждение и ликвидацию заболевания.
Цель и задачи исследований - разработка экспериментальной живой высокоэффективной вакцины против колибактериоза поросят из иммуногенного штамма Escherichia coli Б-5.
Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи:
1. Изучить морфологические, культуральные, биохимические, серологические и биологические свойства 21 культур Е. coli, выделенных от
8 поросят с клиническими признаками колибактериоза; отобрать
перспективные для дальнейшей работы авирулентные штаммы эшерихий.
2. Определить способность к продукции термостабильного и
термолабильного токсинов выделенных авирулентных штаммов эшерихий.
3. Провести исследования генетических особенностей штаммов E.coli,
продуцирующих термостабильный и термолабильный токсины. .
4. Изучить особенности иммунологической реакции организма
экспериментальных животных, иммунизированных культурой штамма
Е. coli, продуцирующего термолабильный экзотоксин; определить
возможность использования данного штамма для изготовления живой
вакцины против колибактериоза.
5. Приготовить опытную серию экспериментальной живой вакцины и
испытать её в свиноводческом хозяйстве, неблагополучном по
коли бактериозу поросят.
Научная новизна. Проведено детальное исследование свойств 21 культуры Escherichia coli, выделенных от поросят с клиническими признаками колибактериоза. Отобран штамм Е. coli Б-5, авирулентный, не типирующийся сыворотками из стандартного набора для диагностики патогенных эшерихий.
Установлено, что штамм Е. coli Б-5 стабильно продуцирует термолабильный экзотоксин с молекулярной массой 82 kDa (патент РФ № 2248393). Показано наличие дополнительного внехромосомного репликона размером 0,3 kb в структуре клеток штамма Е. coli Б-5.
Впервые разработана экспериментальная живая вакцина против колибактериоза поросят с использованием штамма Е. coli Б-5 (патент РФ № 2248806). Показано, что данная вакцина апирогенна, не вызывает аллергических реакций, обладает антитоксической активностью, введение экспериментальным животным усиливает фагоцитарную реакцию нейтрофилов крови и повышает уровень специфических антител в сыворотках крови.
9
Практическая значимость. Разработана эффективная
экспериментальная колибактериозная вакцина на основе штамма Е. coli Б-5
для применения в свиноводческих хозяйствах. Иммунизация свиноматок за
7-14 дней до опороса путём однократного введения предложенной вакциной
обеспечивает эффективную защиту новорождённых поросят от
колибактериоза.
Получены патенты на изобретения: патент РФ № 2248393 « Штамм Е. coli Б-5, используемый для получения термолабильного токсина»; патент РФ № 2248806 « Живая вакцина против колибактериоза свиней».
По результатам исследований опубликованы при содействии Ассоциации «Аграрное образование и наука» (протокол № 5 от 13.09.05 г.) «Рекомендации по специфической профилактике колибактериоза поросят» в соавторстве с В.Н. Ласкавым. Рекомендации предназначены для областных и районных ветеринарных лабораторий и практических ветеринарных врачей.
Материалы диссертации используются в учебном процессе по курсу «Ветеринарная микробиология и иммунология» в ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова».
Основные положения, выносимые на защиту:
Штамм Escherichia coli Б-5, продуцирующий термолабильный токсин, является авирулентным и обладает иммуногенными свойствами.
Разработана экспериментальная живая вакцина на основе штамма Е. coli Б-5 против колибактериоза поросят.
Применение живой вакцины в условиях промышленного комплекса дает положительный профилактический эффект - обеспечивает защиту поросят-сосунов от колибактериоза и повышает сохранность животных на 11,9% по сравнению с контролем.
Работа выполнена на кафедре микробиологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова».
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Межрегиональной научной конференции молодых учёных и специалистов
10 системы АПК Приволжского федерального округа «Вавиловские чтения»
(Саратов, 2003), на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 117-й годовщине со дня рождения Н.И. Вавилова (Саратов, 2004), на Первом Саратовском Салоне изобретений, инноваций и инвестиций, проводимом в рамках 4 специализированной промышленной выставки «ТЕХНОЭКСПО.2005», где были удостоены Диплома 1 степени и награждены золотой медалью (Саратов, 2005), в отчёте НИР СГАУ им. Н.И. Вавилова за 2005 год, научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов по итогам научно-исследовательской и учебно-методической работы за 2005 год (Саратов, 2006).
Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 4 работы, получено 2 патента РФ на изобретения.
Структура и объём диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, состоящих из материалов и методов, результатов исследований, обсуждения, выводов, списка использованных литературных источников и приложений. Материалы диссертации изложены на 154 страницах машинописного текста, включают 15 рисунков, 16 таблиц. Список использованных литературных источников включает 290 наименования, в том числе 164 зарубежных.
Характеристика возбудителя
Впервые бактерии рода Escherichia выделил Т. Эшерих в 1886 году от детей, больных белым поносом. Затем последовали информации о болезнях, вызванных кишечной палочкой у куропаток, у телят, у домашних птиц. В 1899 году Iensen высказал предположение о наличии колибактериоза у поросят и указал, что диареи у новорождённых поросят обусловлены E.coli (Притулин, 1975). В 1937 году род Escherichia включён в состав семейства Enterobacteriaceae, а с 1985 года решением Международного комитета по номенклатуре бактерий признан типовым родом семейства, который в свою очередь, содержит огромное число сероферментативных типов. В настоящее время кишечную палочку считают наиболее распространённым возбудителем инфекций среди прочих бактерий семейства Enterobacteriaceae (Покровский, 1999).
Возбудитель E.coli - энтеропатогенные полиморфные палочки с закруглёнными концами длиной 1-3 мкм и шириной 0,3-0,6 мкм. Клетки располагаются одиночно, реже попарно. По Граму красятся отрицательно, спор не образуют, отдельные серовары ( 08, 09, О101) образуют капсулы. Бактерии имеют жгутики (перетрихи), но нередко встречаются и неподвижные варианты (Радчук, 1991). Например, известен штамм Е.соїі ВГНКИ № 453-37/17, продуцирующий адгезивные антигены ОП5:К88 и обладающий следующими морфологическими свойствами; полиморфные палочки размером 0,8-1,5x2,0 6,0 мм, не образует спор, перетрихи, грамотрицательны (Воронин с соавт., 2004). Кишечная палочка является аэробом и факультативным анаэробом, хорошо растёт на всех простых питательных средах. Рост отмечается при температуре 15-16 С, но оптимальная температура роста 37-38 С, рН среды близок к нейтральной (7,2-7,4), однако кишечная палочка может размножаться как в кислой, так и в щелочной средах. На мясопептонном агаре (МПА) формируются слабовыпуклые, полупрозрачные сероватые колонии в диаметре 2-3 мм с ровными краями, сочные, с блестящей поверхностью. В мясопептонном бульоне (МПБ) образуют равномерное помутнение и небольшой осадок (Емельяненко с соавт., 1982). При росте на дифференциальной среде - агаре Эндо образует малиново-красные колонии с металлическим блеском. На среде Левина (агаре с эозином и метиленовой синькой) кишечная палочка растёт в виде тёмно-фиолетовых или чёрных колоний (Коляков, Гительсон, Каврук, 1970). Е.соїі обладает высокой ферментативной активностью - ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, лактозу, маннит; сахарозу и дульцит ферментирует непостоянно, не изменяет адонит и инозит, образует индол, не образует сероводород, желатин не разжижает, на среде Симмонса - не растёт, даёт положительную реакцию с метиловым красным (ярко-розового цвета), отрицательную реакцию Фогеса-Проскауэра (среда жёлтого цвета), мочевину не расщепляет (Радчук, 1991). Как отмечают О.А.Полякова и Н.И. Евглевская. (1983), ферментативные свойства могут быть использованы для идентификации эшерихий с помощью тестов ферментации лактозы, выделения сероводорода. Данные тесты могут значительно сократить набор Сахаров в «пёстром ряду» до 5 пробирок. Способность кишечной палочки ферментировать лактозу используется для дифференциации ее от тифозно-паратифозных и дизентерийных бактерий, для чего применяют среды Эндо и Левина (Синюшина, Самсонова, 1981). У E.coli сложная антигенная структура. Кишечная палочка содержит три типа антигенов: О - соматический, К - поверхностный, Н - жгутиковый. F.Kauffman в 1947 году предложил первую схему классификации Е. coli по принципу антигенного строения возбудителя, которая включала 25 О -серогрупп, 55 К - серогрупп и 20 Н - антигенов. В настоящее время по данным Ю.А Малахова с соавт. (1993), среди E.coli описано 170 О-антигенов, 103 - К-антигенов и 56 Н-антигенов. Число новых серотипов E.coli увеличивается с каждым годом. О-антиген является термостабильным, выдерживает нагревание при 100 С в течение 2,5 часов, сохраняя агглютинин связывающую и антигенную способности (Коляков, Гительсон, Каврук, 1970). По химической структуре О-антиген относится к углеводным соединениям (полисахаридно-протеино-липидный комплекс) и соответствует «полному антигену». Белковый компонент О-антигена обуславливает иммуногенные свойства, липоидный -токсичность (эндотоксин), полисахаридный - серологическую специфичность. Соматический О-антиген локализуется в клеточной стенке (Радчук, 1991). У поросят наиболее часто выделяют серогруппы - 08, 09, 0137, 0138, 0139, 0141, 0142, 0147, 0149, 0157 (Зароза,1984). К-антиген полисахаридной природы, состоит из группы поверхностных антигенов трёх видов: L, В и A (Kauffman, 1944). L-антиген термолабильный, инактивируется при 60 С в течение часа, при этом теряются его агглютининсвязывающая и антигенная способности. L-антигены содержатся в оболочке бактерий. В-антиген также термолабильный, но инактивируется при 100 С в течение 30 минут. А-антиген - капсульный, термостабильный, инактивируется при 120 С в течение 2,5 часов. По мнению Т.К. Курашвили (1976), культуры E.coli, содержащие К-антиген, более токсичны, обладают некротизирующими свойствами, часто вызывают гемолиз эритроцитов. Н-антигены относятся к типоспецифическим антигенам, по своей природе принадлежат к протеинам, инактивируются при 100 С (Gaastra, Graaf, 1982). Таким образом, на сегодняшний день Escherichia coli считается, с одной стороны, одним из основных представителей нормальной аэробной микрофлоры кишечника животных, с другой - самым распространенным возбудителем инфекции среди семейства бактерий Enterobacteriaceae. Несмотря на то, что в природе существует большое количество серовариантов кишечной палочки, но лишь небольшая их часть имеет возможность вызывать массовые желудочно-кишечные и септические заболевания у животных и человека. Для возникновения инфекционного процесса микроорганизм должен обладать вирулентностью, которая основана у эшерихий на выработке адгезивных антигенов, эндо-и энтеротоксинов, гемолизинов и колицинов.
Бактерии E.coli на своей поверхности имеют структуры в виде нежгутиковых нитчатых отростков, называемых фимбриями или пили-антигенами, которые представляют собой белковый компонент клеточной стенки и обуславливают адгезивные свойства кишечной палочки. (Денисенко, Емельяненко, 1980). Благодаря наличию фимбрий, осуществляется прикрепление эшерихий к эпителиальным клеткам кишечника. Наиболее распространёнными адгезивными антигенами являются К88, К99, 987Р, F41 (Зароза, 1984). Изучению роли пилей в патогенезе колибактериоза посвящена работа учёных В. Nagy и H.W. Moon (1978), которые доказали, что штаммы, не образующие пилей, не прикрепляются in vivo к слизистой кишечника поросят и не вызывают диарею, несмотря на способность синтезировать энтеротоксин.
Профилактика с использованием инактивированных вакцин
Вакцины, изготовленные только на основе соматических антигенов или вакцины по О-антигену, в настоящее время уже не используются, поскольку они, как показали исследования многих авторов и отмечалось в данном обзоре, не представляют практического интереса в связи с недостаточной иммуногенностыо (Малахов с соавт., 1993). Наиболее характерными примерами таких вакцин являются разработки английских учёных. В частности, L.Nagy (1979) предложил вакцину, состоящую из целых микробных клеток E.coli 0149, инактивированную нагреванием и содержащую 15 % алгидрогеля. Вакцину вводили подкожно супоросным свиноматкам за 6 и 3 недели до опороса в дозе 2 мл с концентрацией 1010 м.к. Признаков диареи у поросят, получивших молоко от иммунизированных животных, не отмечали.
Английскими исследователями (Robbins, Di, 1974) предложено с целью повышения стойкости поросят к желудочно-кишечным расстройствам перорально вводить эндотоксины из одного или более серотипов E.coli 08, 045, 0138, 0139, 0141, 0149, не содержащих живых микроорганизмов E.coli. Вакцину вводили с кормом или водой поросятам в возрасте 4-10 дней. В Румынии для профилактики колибактериоза 1-3-дневных поросят применяли вакцину из штаммов 3 серогрупп 0149, 045, OS, инактивированных различными фитопрепаратами (Michle, Caraivan, Nedeleu, 1983). Немецкий исследователь (Wittkowski, 1980) сравнивал эффективность двух вакцин против Е. coli - ЭКОПИГ и ПОРКОВАК. ЭКОПИГ - гидроокись алюминиевая вакцина, содержащая 26 мг токсина E.coli серотипа 08 в 1 дозе, вакцину вводили подкожно свиноматкам за 6 недель до опороса и в молочную железу на 4 день после опороса. ПОРКОВАК - гидроокись алюминиевая вакцина содержащая 2,5х108 инактивированных бактерий Е. coli 12 серотипов в одной дозе. Ее вводили в дозе 5 мл за 3 - 8 недель до опороса. В результате вакцинации снизилась заболеваемость маток метрит - мастит - агалактией, поросят — диареей в течении первых 27 дней после рождения. Значительных различий в эффективности вакцин не было. Американские авторы разработали и запатентовали вакцину против инфекции E.coli 0157, применяемую для получения иммунного ответа у млекопитающих. (Konadu et al., 2000). W. Whtig в 1965 году сообщил об этиологическом значении адгезивного антигена К88, что послужило толчком к созданию средств специфической профилактики нового поколения. Английские учёные ( Nagy, Moon, Ysaacson, 1978; Avilla F., A villa S., 1986 ) испытали в экспериментальных и полевых условиях ряд инактивированных вакцин с содержанием антигена К88 и обнаружили, что вакцины с данным антигеном обеспечивали более достоверный эффект по снижению заболеваемости и летальности при энтеритных и энтеротоксемических формах колибактериоза поросят, чем аналогичные вакцины без антигена К88. Вакцина с содержанием очищенного и концентрированного антигена К88 была предложена J. Reno (1980), которая обладала свойством тормозить размножение бактерий и в результате снижала заболеваемость и смертность поросят. Вакцину применяли супоросным маткам двукратно при 1 вакцинации и затем однократно. М. Cieslicki (1989) разработана вакцина, содержащая 4 штамма К88, К99, 987Р и F41. В результате применения такой вакцины процент больных поросят был снижен с 70-90 % до 6 %. Вакцины против заболевания, вызываемого образующими пили бактериями, предложены F. Lindberg с соавт. (1998). Вакцина содержит в качестве основного иммуногенного компонента эффективное количество антигена, представленного полипептидом адгезина или выделенный полипептид, содержащий антигенную детерминанту полипептида адгезина, который вызывает образование антител против данного полипептида. М.К. Пирожковым и О.А. Тугариновым (1994) разработана формол-тиомерсаловая вакцина против коли бактериоза поросят, обогащенная адгезивным антигеном К88. Она при пероральном заражении поросят от иммунизированной свиноматки защищала 90,9 % животных, против 66,7% животных от вакцинированной базовой поливалентной гидроокись-алюминиевой формол-тиомерсаловой вакцины и при 100 % гибели поросят в контроле. В Венгрии проведены исследования по разработке вакцины, содержащей термолабильный и термостабильный энтеротоксины кишечной палочки (Pesti, Semjen, 1980) и её бактериальные клетки, способной обеспечивать специфическую пассивную защиту поросят через молозиво посредством иммунизации свиноматок. При этом энтеротоксины обрабатывали формалином, трансформируя таким образом компоненты вакцины в анатоксин. Полученная формолвакцина приводила к снижению количества случаев заболевания колибактериозом у поросят в 5-6 раз. В США изобретена вакцина на основе термолабильного (ТЛ) энтеротоксина, полученного при культивировании штамма Е. coli АТСС 21972 (Dobrescu, Huygelen, 1976). Вакцину вводят внутримышечно или подкожно свиноматкам за 3-6 недель до опороса в дозе от 100 до 150 мг в пересчёте на лиофилизированный экстракт ТЛ-токсина. Дальнейшими исследованиями авторы доказали, что введение ТЛ-токсина обеспечивает защиту поросят от действия и термостабильного энтеротоксина. P.Garcia с соавт. (1998) проводили исследования по использованию у свиней коммерческих Е.соїі вакцин, в которых бактерии были убиты формальдегидом при сохранённых эндотоксинах. Изучали эндотоксин-вызванные эффекты при использовании этих вакцин у свиней. Авторы заключили, что поглощение эндотоксинов из подкожного депо медленное, поэтому они не могут создать отрицательных эффектов, как при внутривенной вакцинации.
Наибольшую группу составляют широко используемые в ветеринарной практике многокомпонентные вакцины, содержащие соматические, капсульные, адгезивные антигены, а также и энтеротоксины. К данному направлению относится 38 % источников от числа отобранных по инактивированным вакцинам.
Примером могут служить разработки Всесоюзного государственного научно-контрольного института ветеринарных препаратов (Малахов с соавт., 1995), в соответствии с которыми предложены вакцины, содержащие штаммы эшерихий 8 серогрупп (08, 09, 078, 0138, 0139, 0141, 0147 и 0149), наиболее часто поражающие поросят. Штаммы содержат капсульные антигены КЗО, К80, К43, К81, К85, К88, К91, способны продуцировать гемолизин, термостабильные и термолабильные токсины. Вакцину инактивируют гидроокисью алюминия. Вводят внутримышечно двукратно супоросным свиноматкам за 1,5-2 месяца до опороса, а также поросятам перед отъёмом не ранее, чем в 21-дневном возрасте.
Методы определения фагоцитарной активности нейтрофилов в отношении токсинпродуциругощих штаммов эшерихий
В работе использовали нейтрофилы крови двух групп кроликов. Первая группа была контрольной (10 животных), второй группе (5 животных) вводили двухмиллиардную взвесь Е.соїі из штамма Б-5 по 0,1 мл внутримышечно, трёхкратно, с интервалом 20 дней. Исследования проводили через 2 месяца после начала иммунизации. Кровь брали из вен уха, стабилизировали гепарином по общепринятой методике, затем разливали в пробирки Флоринского по 0,4 мл. Фагоцитарную активность нейтрофилов изучали путем моделирования процесса фагоцитоза in vitro. В качестве объекта фагоцитоза использовали 24-часовую культуру Escherichia coli штамма А-5 (продуцирующего термостабильный токсин) и штамма Б-5 (продуцирующего термолабильный токсин). Четырёхмиллиардную взвесь культуры вносили в пробирки с кровью по 0,1 мл и выдерживали в термостате 30 минут при 37 С.
Делали мазки крови, которые окрашивали по Циль-Нильсену (Биргер, 1982). Готовые препараты просматривали под микроскопом.
Уровень фагоцитарной активности нейтрофилов оценивали на основании подсчёта процента фагоцитоза (% ФАГ), фагоцитарного числа (ФЧ) и фагоцитарного индекса (ФИ) по общепринятой методике. Процент фагоцитоза - процент участвующих в фагоцитозе нейтрофилов из 100 учтённых. Фагоцитарное число - количество поглощённого возбудителя на 1 из 100 учтённых нейтрофилов. Фагоцитарный индекс или поглотительная способность нейтрофилов -количество поглощённого возбудителя на 1 из 100 участвующих в фагоцитозе нейтрофилов (Кузнецов, Обернебесова, 1996). из штамма Е.соїі Б-5 Оценку превентивных свойств экспериментальной вакцины проводили на белых мышах. Для этого экспериментальную вакцину вводили 10 белым мышам внутримышечно однократно в область бедра в объёме 0,2 мл. Через 14 дней проводили внутрибрюшинное заражение вирулентными культурами эшерихий. Использовали 5 культур: Е. coli 2(5); Е. coli 4(6); Е. coli 6(3); Е. coli 8(1); Е. coli 9(2) выделенных от больных колибактериозом поросят из неблагополучных хозяйств. Для доказательства вирулентных свойств каждой из этих культур их вводили не иммунизированным мышам внутрибрюшинно в концентрации 5x10 м.к./см объёме 0,5 мл. Наблюдения проводили в течение 5 дней. После этого отобранные вирулентные культуры смешивали в равных долях и полученной смесью заражали иммунизированных экспериментальной вакциной мышей. За животными вели клинические наблюдения в течение 10 суток.
Аналогичным образом определяли антитоксический эффект экспериментальной вакцины, используя для заражения иммунизированных мышей ТСМ штаммов Е. coli А-5 и Е. coli Б-5. ТСМ вводили в равных долях внутрибрюшинно в объёме 0,5 мл.
Иммуногеиные свойства вакцины оценивали путём определения титра специфических антител в сыворотке крови иммунизированных предложенной вакциной и контрольных (не иммунизированных) кроликов. Для этого ставили реакцию агглютинации (РА) (Биргер, 1982). Приготовление сывороток проводили по общепринятой методике (Лабинская, 1968). Разведение сывороток начинали с 1:25 до 1:6400 в объеме 1 мл. В каждое разведение вносили по 2 капли антигена, в качестве которого использовали 10 млрд. взвесь микробных клеток E.coli (живой и инактивированной). Инактивацию бактериальных клеток проводили автоклавированием при 1,5 Атм. в течение 20 минут. Учет реакции осуществляли по степени просветления сывороток и образованию конгломерата (осадка в виде «зонтика») на дне каждой пробирки.
Аналогичным способом провели исследования крови от свиноматок после опороса и полученных от них поросят в возрасте 5 дней. Для этого брали кровь от 9 свиноматок, иммунизированных вакциной из штамма E.coli Б-5 и 9 поросят, а также от 6 свиноматок, вакцинированных поливалентной гидроокись-алюминиевой (ГОА) формол-тиомерсаловой вакциной и 6 поросят. Реакцию агглютинации ставили с живой культурой из штамма E.coli Б-5 в разведении сывороток от 1:10 до 1:81920 по общепринятой методике.
Определение безвредности вакцины проводили на лабораторных животных. Для этого вакцину вводили 10 мышам в концентрации 5x108 м.к./см3 в объёме 0,5 мл внутрибрюшинно. Наблюдения за животными вели в течение 5 дней, после чего животных подвергали диагностическому убою. Проводили посевы из органов (сердца, печени, селезёнки) на мясопептонный бульон с глюкозой.
Подсчёт лейкоцитарной формулы крови кроликов проводили по общепринятой методике (Кост, 1975). Исследовали кровь одних и тех же животных до и после иммунизации экспериментальной вакциной (спустя две недели). При этом кровь не иммунизированных кроликов использовалась в качестве контроля.
Определяли оптимальный объём вакцины для сельскохозяйственных животных. Для этого супоросным свиноматкам с живой массой 180 - 200 кг за 7-14 дней до опороса вводили вакцину внутримышечно однократно в область шеи с концентрацией 1,2x10 м.к./см физиологического раствора. Одной группе свиноматок в количестве 7 голов вакцину вводили внутримышечно в объёме 2 мл, а другой группе в количестве 6 голов — в объёме 3 мл. Перед введением вакцины кожу обрабатывали 70 спиртом или 0,5% раствором кристаллической карболовой кислоты. Для введения вакцины использовали шприцы емкостью 2-5 мл. Для каждого животного использовали отдельную иглу. Шприцы и иглы после их использования подвергали стерилизации путём кипячения в воде в течение 30 минут.
Были проведены опыты и на поросятах 2-7-дневного возраста, которым вакцину вводили внутримышечно однократно в область бедра в объёме 2 мл с концентрацией 1,2x10 м.к./см3. За животными вели клинические наблюдения, регистрировали заболеваемость и падёж. Обращали особое внимание на проявление воспалительных реакций на месте введения вакцины и повышение температуры тела.
Изучение фагоцитарной активности нейтрофилов в отношении бактериальных клеток токсинпродуцирующих штаммов Е. coli А-5 и Е. coli Б-5
Принимая во внимание, что исследования экспериментальной вакцины на лабораторных животных и в ограниченном опыте на свиноматках и поросятах показали положительный результат, возникла необходимость провести широкие производственные испытания.
Изучение эффективности вакцины проводили в двух отделениях (свиноводческих комплексе и ферме) ОАО «Большевик» Сердобского района Пензенской области. Это хозяйство является одним из наиболее крупных, рентабельных, имеющим возможность вести расширенное воспроизводство. ОАО «Большевик» занимается выращиванием крупной белой породы свиней, общее поголовье составляет 17 тысяч голов.
Оба отделения рассчитаны на получение 25 30 тыс. поросят в год. Опоросы проходят непрерывно в течение года. Животные содержатся в помещениях в соответствии с возрастом. Сохраняется принцип «все пусто -все занято». Корпуса - маточники рассчитаны на 35 голов свиноматок каждый. Температура воздуха в помещениях поддерживается в пределах 20 - 22 С. Станки для подсосных маток оборудуются средствами локального обогрева поросят, где создается температура 25 - 30 С. Для этого используются инфракрасные лампы. В качестве подстилки для поросят применяются опилки. Проходы между станками посыпаются известью - пушонкой. Рационы кормления свиней всех половозрастных групп осуществляются в соответствии с нормами ГНУ ВИЖа. Поение животных индивидуальное из сосковых поилок, поросят - сосунов первых дней жизни - из корытец. Отъем поросят от свиноматок проводится в 45-дневном возрасте и поросята в течение двух недель находятся в тех же станках. В возрасте двух месяцев они поступают в группу отъема, где содержатся до четырёх месяцев, а затем их направляют в корпуса откорма.
Диагноз на колибактериоз в хозяйстве устанавливали на основании эпизоотологических данных (возраст заболевших животных, массовость поражения, стационарность и пр.), клинических признаков, патолого-анатомических изменений и выделения патогенных штаммов эшерихий от больных поросят, в соответствии с методическими указаниями, утверждёнными Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ в 2000 году.
Как показали клинические наблюдения, у больных животных температура тела повышалась на 0,5-1 С, а затем снижалась до нормы. У поросят наблюдалось выделение жидкого серовато-белого кала с пузырьками газами. Животные были вялые, большее время лежали, сбивались в кучу, щетина была взъерошена, кожа покрыта желтоватым налетом, аппетит отсутствовал. Отмечалась синюшность в области живота, паха и ушных раковин. Поросята погибали в течении двух - трех дней в результате истощения и обезвоживания организма.
При вскрытии павших животных отмечали характерную патолого-анатомическую картину: слизистая оболочка желудка была гиперемирована, набухшая, покрыта слизью; в желудке имелись сгустки молозива и содержимое серо — белого цвета с неприятным гнилостным запахом; содержимое кишечника было сероватого цвета с пузырьками газа, под слизистой оболочкой наблюдались точечные кровоизлияния; брыжеечные лимфатические узлы набухшие, на разрезе с множественными кровоизлияниями, сочные; печень глинистого цвета, набухшая; селезенка не увеличена, темно вишневого цвета; сосуды головного мозга гиперемированы.
Лечение заболевших поросят проводили комплексно принятыми в хозяйстве методами. В частности, использовали раствор гентамицина и поливалентную антитоксическую сыворотку, которые оказывали положительное действие. В тоже время заболевание отмечалось во многих пометах.
В соответствии с планом противоэпизоотических мероприятий на 2002 год в хозяйстве проводили вакцинацию свиноматок поливалентной гидроокись-алюминиевой (ГОА) формол - тиомерсаловой вакциной против колибактериоза поросят. Однако, это заболевание регистрировалось у поросят в течение года. Наибольшая заболеваемость и падеж приходились на зимне -весенний периоды. Колибактериоз отмечался у поросят в первые дни после рождения, а также в послеотъемный период. Заболевание характеризовалось стационарностью, большим охватом поголовья и высокой смертностью поросят - сосунов.
В связи с этим в 2003 - 2004 годах провели иммунизацию животных вакциной из штамма E.coli Б-5. Её готовили в лабораторных условиях на базе ГНУ Саратовской НИВС Россельхозакадемии и использовали в течение б месяцев со дня изготовления. Вакцину вводили супоросным свиноматкам независимо от живой массы за 7 - 14 дней до опороса внутримышечно однократно в область шеи в объёме 2 мл/ гол. в концентрации 1,2x10і0 м.к./см3 Эффективность вакцины оценивали по клиническим признакам и сохранности поросят к отъемному возрасту (таб. 16)
Как следует из данных таблицы 16, за первый год производственных испытаний вакцины, от 3462 голов опоросившихся свиноматок получено 24697 поросят, что составляет 7,13 на 1 свиноматку. В период второго года испытаний вакцины от 2142 голов опоросившихся свиноматок получено 16772 поросёнка (7,8 на 1 свиноматку). Таким образом, всего за два года испытаний от 5604 опоросившихся свиноматок получено 41469 поросят, т.е. 7,4 на каждую свиноматку, тогда как в контрольной группе от 3749 свиноматок -26122 поросёнка (6, 97 на 1 свиноматку).
От вакцинированных свиноматок, по сравнению с контрольными животными, получено больше на 0,43 поросёнка (на каждую опоросившуюся свиноматку) и дополнительно сохранено за период производственных испытаний 2410 поросят (акт о проведении комиссионных производственных испытаний от 24 декабря 2004 года).
В результате проведённых испытаний установлено, что от вакцинированных свиноматок поросята-сосуны колибактериозом не болели (рис. 15). У контрольных животных, полученных от невакцинированных данной экспериментальной вакциной свиноматок, проявлялись клинические признаки заболевания, что подтверждалось бактериологическими исследованиями.
