Введение к работе
Актуальность проблемы. Традиционным сырьем для приготовления микробиологических питательных сред являются мясо, печень, рыба и другие пищевые продукты с высоким содержанием белка (Меджидов М.М., 2003, Лабинская А.С. и др., 2004). В некоторьк случаях при получении биотехнологической продукции, связанной с культивированием микроорганизмов, необходимы среды на низкобелковой основе. В связи с этим исследователями проводится активный поиск непищевых, экономичных видов сырья для производства питательных сред. В качестве сырья, имеющего более низкую белковую ценность, предложены гидролизаты крови животных и кровезаменители с истекшим сроком годности (Раскин Б.М., Денисова СВ., 1992, Ковтун Ю.Н., 1992, Мельникова В.А. и др., 2003, Грубер И.М. и др., 2006), кормовые дрожжи, виноградная мука (Меджидов М.М, 1987), отходы пушного звероводства, микроводоросли (Блинкова Л.П. и др., 1994,1998)и др.
На наш взгляд, для создания питательных сред целесообразно использование утильного мясного сырья - отходов скотобоен (толстый кишечник крупного рогатого скота и др.). Поскольку вновь разрабатываемые питательные среды представляют интерес для выращивания микроорганизмов разных таксономических групп, в качестве тест-объектов при изучении свойств создаваемой питательной среды выбраны широко распространенные представители энтеробактерий, стафилококков, дрожжевых грибов, а также один токсигенный и два не-токсигенных штамма дифтерийных бактерий. Следует отметить, что последние принадлежат к «требовательным» микроорганизмам, нуждающимся в полноценных белковых субстратах и факторах роста (среда Лингуда, бульон Мартена, среды с кровью, сывороткой) (Фаво-рова Л.А. и др., 1988, Костюкова Н.Н., 1997) и др. Поэтому для более полной оценки новой питательной среды целесообразно было провести выращивание на ней такого прихотливого микроба, как Corynebac-trium diphtheriae, с последующим изучением специфичности антигенного препарата, полученного из его биомассы.
Ранее эксперименты по выделению антигенов методом гидро-ксиламиновой экстракциии после культивирования на питательных средах из другого вида утильного мясного сырья (кишечник кроликов, использованных в сывороточном производстве) проводили со штаммами семейств Enterobacteriaceae, Vibrionaceae, Staphylococcaceae
(Икрамов А.А, 1988, Садритдинова Д.Б., 1995). Авторами показано, что подобные среды с невысоким количеством белка более пригодны для глубинного выращивания бактерий и получения протективных антигенов с помощью гидроксиламина из биомассы испытанных штаммов, чем высокобелковые. На основе выделенных антигенов были созданы диагностические и вакцинные препараты.
Таким образом, разработка и испытание среды из утильного мясного сырья для культивирования как прихотливых, так и неприхотливых микроорганизмов, является актуальной задачей.
Цель работы - разработка микробиологической питательной среды из утильного мясного сырья и изучение ее физико-химических и биологических свойств.
Задачи исследования:
-
Установить оптимальные условия аутолиза сырья и составить схему приготовления питательной среды на основе утильного мясного сырья.
-
Определить физико-химические характеристики экспериментальной среды и изучить влияние выбранного варианта среды на морфологические, тинкториальные, физиолого-биохимические свойства тест-культур разных таксономических групп.
-
Изучить возможность использования новой питательной среды при периодическом культивировании прихотливого штамма C.diphtheriae 279 tox+.
-
Выделить с помощью гидроксиламина из биомассы C.diphtheriae 279 tox+, полученной при периодическом культивировании на экспериментальной среде, антигенный препарат и изучить его физико-химические и биологические свойства.
Научная новизна
Впервые использовано утильное мясное сырье (толстый кишечник крупного рогатого скота) для приготовления питательной среды со сниженным содержанием азотистых веществ для культивирования штаммов различных таксономических групп. Новая питательная среда охарактеризована по основным физико-химическим и биологическим показателям, рекомендованным для питательных сред.
Показана возможность выращивания «требовательных» штаммов дифтерийных бактерий в разработанной жидкой среде со сниженным содержанием азотистых веществ.
Впервые с помощью гидроксиламина гидрохлорида получен антигенный препарат из токсигенного штамма C.diphtheriae, выращенного на созданной среде, и изучены его физико-химические и биологические свойства.
Практическая значимость
Микробиологическая питательная среда на предлагаемой основе со сниженным количеством азотистых веществ может быть использована для культивирования бактерий различных таксономических групп.
Созданная питательная среда из утильного мясного сырья внедрена в производство на Опытном заводе биопрепаратов «Ни-хол» при Республиканском Онкологическом Научном Центре (г. Ташкент) в отделе микробиологии и в отделе бактериальных препаратов (Акт внедрения, приказ №01/1-60 от 20.03.2003), а также в бактериологической лаборатории ОАО «Узбиофарм» при ТашНИ-ИВС (Акт внедрения, приказ №.27 от 15.01.2008) для выращивания энтеробактерий, стафилококков и дифтерийных бактерий.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Разработанная основа может быть использована для приготовления питательной среды из утильного мясного сырья.
-
Созданная питательная среда пригодна для выращивания микроорганизмов разных таксономических групп (энтеробактерий, стафилококки, дифтерийные бактерии, дрожжевые грибы).
-
Препарат, впервые выделенный с помощью метода гидроксилами-новой экстракции из токсигенного штамма С. diphtheriae после периодического культивирования на созданной среде, имеет липидно-полисахаридный состав с примесью белка, и обладает выраженной антигенностью.
Структура диссертации. Диссертация изложена на 133 страницах, состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 175 работ отечественных и зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 17 таблицами и 20 рисунками.
Апробация материалов диссертации. Апробация диссертации состоялась на научной конференции отдела микробиологии ГУ НИ-ИВС им. И.И. Мечникова РАМН 19 мая 2008 г. Материалы диссертации представлены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции «Химическое загрязнение среды обитания», (5-6 февраля 2003 г., г. Пенза), на заседании Научного Совета 03 «Нихол» биопрепаратов РОНЦ МЗ РУ (27.07.2004 г.), представлены на Четвертом Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (29-31 марта 2006г., г.Москва), на Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология-2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», (21-22 ноября 2006г., г. Москва), на Пятом Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (28-30 марта 2007 г., г. Москва), на Международном конгрессе «Пробиотики, пре-биотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты», 15-16 мая 2007 г., г. Санкт-Петербург).
