Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 12
1.1. Распространение и выживаемость сальмонелл в водных объектах 12
1.1.1. Загрязнение сальмонеллами сточных вод 13
1.1.2. Загрязнение сальмонеллами открытых водоемов 14
1.2. Некультивируемые формы бактерий (НФ) 20
1.2.1. Факторы, способствующие переходу микроорганизмов
в некультивируемое состояние (НС) 21
1.2.2. Методы определения НФ 24
1.2.3. Факторы реверсии НФ 27
1.3. Характеристика сред накопления для выделения сальмонелл из объектов окружающей среды 30
Часть и. собственные исследования
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 33
2.1. Штаммы 33
2.2. Реактивы и питательные среды 34
2.3. Биологические методы 34
2.3.1. Чувствительность среды 35
2.3.2. Определение показателя эффективности и скорости роста сальмонелл 35
2.3.3. Показатель ингабирования роста возможной сопутствующей микробиоты...36
2.3.4. Определение стабильности основных свойств тест-штаммов
сальмонелл, выращенных на предлагаемой среде и средах сравнения 37
2.4. Некультивируемые формы сальмонелл 37
2.4.1. Получение некультивируемых форм сальмонелл 38
2.4.2. Проведение ПЦР 39
2.5. Методика реверсии некультивируемых форм сальмонелл 40
2.5.1. Определение вирулентности культур сальмонелл, находящихся в НФ, на белых мышах 40
2.5.2. Методика определения влияния различных сред накопления на восстановление биологических свойств сальмонелл, находящихся в НС 41
2.6. Физико-химические методы 41
2.6.1. Определение рН 41
2.6.2. Аминный азот 42
2.7. Исследования, проведенные в полевых условиях 42
2.7.1. Объекты изучения в полевых условиях 42
2.7. Методика исследования воды поверхностных водоемов 45
2.8. Исследование хозяйственно-бытовых сточных вод 45
2.9. Статистические методы 46
ГЛАВА 3. Характеристика среды накопления для выделения сальмонелл из водных объектов
3.1. Подбор оптимального соотношения ингредиентов в составе предлагаемой среды 47
3.2. Физико-химические показатели среды 53
3.3. Технология приготовления среды накопления для сальмонелл 53
3.4. Биологические свойства среды 54
3.4.1. Чувствительность среды 54
3.4.2. Определение показателя эффективности и скорости роста сальмонелл 56
3.4.3. Показатель ингибирования роста сопутствующей микробиоты 59
ГЛАВА 4. Некультивируемые формы сальмонелл
4.1. Переход сальмонелл в некультивируемое состояние
под действием повышенной температуры 65
4.2. Переход сальмонелл в некультивируемое состояние под действием пониженной температуры в условиях отсутствия питательных веществ 73
4.3. Реверсия НФ сальмонелл в организме теплокровных животных 78
ГЛАВА 5. Испытание предлагаемой среды накопления и сред сравнения в полевых условиях
5.1. Распространение, количественная и видовая характеристика сальмонелл, выделенных из воды горканализации городов Ростова-на-Дону и Азова с применением различных сред накопления 81
5.2. Распространение, количественная и видовая характеристика сальмонелл, выделенных из воды Нижнего Дона с применением различных сред накопления 85
Обсуждение результатов исследований 92
Выводы 100
Список литературы 101
Приложение 126
- Распространение и выживаемость сальмонелл в водных объектах
- Определение показателя эффективности и скорости роста сальмонелл
- Подбор оптимального соотношения ингредиентов в составе предлагаемой среды
- Распространение, количественная и видовая характеристика сальмонелл, выделенных из воды горканализации городов Ростова-на-Дону и Азова с применением различных сред накопления
Введение к работе
Вопрос обеспечения рационального использования и охраны природных ресурсов страны постоянно находится в центре внимания правительства РФ. Важным шагом в этом направлении явилось принятие в 1999 г. закона «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» (№ 52 - ФЗ от 30.03.1999). Настоящий Федеральный закон направлен на обеспечение санитарно-эпидемиологического благополучия населения как одного из основных условий реализации конституционных прав граждан на охрану здоровья (Онищенко, 2004). В данном законе также предусмотрены санитарно-эпидемиологические требования к охране окружающей среды, несоблюдение которых может создать угрозу возникновения и распространение заболеваний, в том числе инфекционных.
Несмотря на все меры, направленные на борьбу с инфекционными болезнями, уровни заболеваемости ими в мире остаются высокими (Ерман и др., 1992; Parker et al., 2001; Гуменюк и др., 2002; Ковалев и др., 2002; Charkowski et al., 2002; Anis Shobirin et al., 2003). По расчетным данным ВОЗ ежегодно в мире острые кишечные инфекции (ОКИ) переносят 2 млрд. человек. В последние годы намечается неблагоприятная тенденция к росту заболеваемости ОКИ, передаваемых водным путем: в 1998 г. по России зарегистрировано 122 вспышки кишечных инфекций водного происхождения, к 2006 г. показатель увеличился в 1,5 раз (Онищенко, 2002; Онищенко, 2006). Среди многочисленных возбудителей острых кишечных заболеваний (ОКЗ), связанных с водным путем передачи, следует выделить сальмонеллы, поскольку они являются безусловными патогенами для человека и животных, и наиболее часто среди патогенных микроорганизмов встречаются в воде (Бекназов, 1975; Зарицкий, 1988; Graver, Thakur, 2001; Махнев, 2002; Махнев, 2006; Лобзин и др., 2006). Известны многочисленные примеры заболеваний сальмонеллезами, связанные с водным фактором: вспышка в Мексике в 1972 г. (Гипп, 1975), в г. Риверсайд (США) в 1989 г. (Покровский и др., 1989), в Кине (Англия) в 1986 г. (Колпаков, Козырева, 1989), в 1997 г. в
Казахстане (Табаева и др., 2001), в 2000 г. в Чеченской Республике, а в 2003 г. в Республике Дагестан зарегистрированы вспышки брюшного тифа (Онищенко, 2000; Грижебовский и др., 2001; Онищенко, 2006).
Поскольку поверхностные водоемы являются конечным пунктом поступления недостаточно очищенных промышленных и хозяйственно-бытовых сточных вод, создаются условия для накопления и развития болезнетворных микробов, и водоемы, в этом случае, могут служить резервуаром и путем передачи инфекционного агента (Юрко, 1971; Круглова и др., 1983; Martin-Bauyer, 1983; Кулов и др., 1987; Макарова и др., 1990; Далечин и др., 1998; Khanh, Pruss et al., 2002).
В условиях интенсивной антропогенной нагрузки на водоемы изменяются микробиологические процессы, протекающие в водных объектах и соотношение циркулирующих в воде микроорганизмов. Это приводит к нарушению локальных экологических микросистем. Происходит естественный отбор бактерий, биологически устойчивых и обладающих большой жизнеспособностью. Данные изменения способствуют длительному сохранению патогенных бактерий в объектах внешней среды и переходу в некультивируемое состояние, повышая риск обострения эпидемиологической ситуации. В этом случае характер изменения биоценоза бактерий приобретает важное значение при оценке санитарного режима водоема (Абрамсон и др., 1983; Чернышева и др., 1990; Бойцов, 1991; Bakhrouf-Ben et al., 1992; Mahasneh, 1992; Kolsky, 1993; Усманов, 2004).
Очевидно, что установление степени эпидемического риска заражения сальмонеллами через воду, как и проведение в целом надзора за их циркуляцией в окружающей среде, теснейшим образом связано с эффективностью соответствующих методов вьщеления этих возбудителей и их идентификации (Султанов, Раджиева, 1989; Лысов, 1991). Результаты лабораторных исследований являются важным и объективным мерилом степени распространения инфекции и создают основу не только для планирования анализа и оценки результатов профилактических и противоэпидемических мероприятий, но и помогают
7 выявлению изменений в характере развития эпидемического процесса различных
заболеваний. Чем выше уровень лабораторных исследований, используемых при
определении параметров эпидемиологического надзора, тем обоснованней заключение о
причинах возникновения эпидемиологической ситуации и, следовательно, более
целенаправленными и обоснованными будут планируемые противоэпидемические
мероприятия (Седова, 1975; Покровский и др., 1995).
Используемые среды первичного накопления для выделения сальмонелл из водной среды не достаточно эффективны в отношении бактерий находящихся в состоянии «сублетального стресса», что препятствует объективной санитарно-эпидемической оценке водоисточника. При этом среды имеют сложный состав, в который входят дорогостоящие компоненты, что влечет за собой повышение стоимости анализов, требует увеличения количества лабораторной посуды, затрат времени и труда персонала. С учетом выше сказанного, одной из наиболее актуальных задач современной санитарной микробиологии является создание и разработка эффективных, экономичных и легко воспроизводимых в условиях практических бактериологических лабораторий питательных сред, позволяющих получать объективную информацию о степени бактериологического загрязнения водных объектов (Головина и др., 1997; Трухина, 2002; Онищенко, 2002; Онищенко, 2006).
Учитывая вышеизложенное, целью нашего исследования явилась разработка и обоснование возможности использования новой среды накопления для повышения эффективности выделения сальмонелл, в том числе и некультивируемых форм, из водных объектов различной степени бактериального загрязнения.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. В экспериментальных условиях подобрать минеральный состав новой среды, факторы роста, ингибирующие вещества для конкурирующих видов микроорганизмов, рН.
2. В экспериментальных условиях проверить способность новой питательной
среды к возможности размножения в ней сальмонелл и торможению роста сопутствующей микробиоты. Сравнить новую среду с наиболее используемыми в настоящее время средами.
Показать возможность применения новой среды накопления для выделения некультивируемых форм сальмонелл из водных объектов.
Разработать методические приемы, позволяющие проводить исследования на наличие сальмонелл с высокой степенью достоверности результата.
В полевых условиях с использованием новой питательной среды и разработанными методическими приемами провести исследования проб воды взятых, в биотопах с различной степенью биологического загрязнения, в сравнении со средами общепринятыми в практике здравоохранения.
' Научная новизна
Разработана новая жидкая среда накопления для выделения сальмонелл из водных объектов, превосходящая по чувствительности и эффективности накопления аналоги, используемые в настоящее время в практике здравоохранения РФ. Защищена патентом № 2006115322/13 от 11. 04.2007 г.
Показана эффективность применения новой среды для реверсии некультивируемых форм сальмонелл, что позволяет повысить достоверность оценки загрязнения сальмонеллами водных объектов.
Научно-практическая значимость
Материалы диссертации использованы при подготовке аналитической справки «Об экологическом мониторинге за санитарно-показательными, потенциально патогенными и патогенными микроорганизмами в водных объектах Юга Российской Федерации» (письмо
9 Федеральной службы Роспотребнадзора № 0100/2723.05-26 от 14.04,2005 г о возможности
использования документа Федеральной службой в практической работе).
Материалы диссертации использованы при подготовке аналитической справки «О степени загрязнения водных объектов Юга России патогенными, потенциально-патогенными и санитарно-показательными микроорганизмами» (письмо Управления Федеральной службы Роспотребнадзора по Ростовской области № 07-64/12357 от 10.11.2006 г об использовании документа для формирования Федерального информационного фонда социально-гигиенического мониторинга).
Разработан проект нормативно-технической документации (Технические условия, Пусковой регламент производства, инструкция по применению, этикетка на флакон и др.) для промышленного производства «Питательной среды накопления для вьщеления сальмонелл из водных объектов». В настоящее время разработанная нормативно-техническая документация находится на согласовании в ФГУН «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» Роспотребнадзора.
Внедрение новой среды накопления для сальмонелл в практику здравоохранения позволит осуществлять более объективный мониторинг за санитарным состоянием водных объектов с целью своевременного проведения оперативных мероприятий против распространения сальмонеллезов водным путем.
Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:
преимущество предложенной среды накопления перед используемыми в настоящее время средами накопления для определения сальмонелл в водных объектах;
возможность применения предлагаемой среды для реверсии некультивируемых форм сальмонелл;
10 - обоснование использования разработанной среды при проведении мониторинга за
качеством воды различной степени бактериологического загрязнения на наличие
сальмонелл, в том числе некультивируемых форм.
Апробация работы
Результаты и основные положения работы представлены на научно-практической конференции «Региональные проблемы окружающей среды, здоровья населения и санитарно-эпидемиологического благополучия» (Ростов-на-Дону, 2004), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Суздаль, 2005), на заседании Ученого совета ФГУН «Ростовский НИИ микробиологии и паразитологии» Роспотребнадзора (Ростов-на-Дону, 2007), на межлабораторной конференции сотрудников лаборатории санитарно-микробиологических методов исследования и экологической экспертизы и лаборатории микробиологии и разработки иммуно-биологических препаратов ФГУН «Ростовский НИИ микробиологии и паразитологии» Роспотребнадзора (Ростов-на-Дону, 2007).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 9 работ, из них 2 в реферируемых журналах из списка ВАК Минобразования РФ.
Объем и структура работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы описания материалов и методов исследования, изложения собственных экспериментальных результатов и их
обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Объем рукописи составляет 125 страниц. Работа иллюстрирована 24 таблицами и 17 рисунками. Список литературы содержит 203 источника, из них 164 отечественных авторов.
12 ЧАСТЬ I
Распространение и выживаемость сальмонелл в водных объектах
В течение длительного времени в вопросах изучения гигиены воды внимание микробиологов было преимущественно сосредоточено на индикации фекального загрязнения, косвенно указывающего на присутствие возбудителей кишечных инфекций. Однако характер эпидемий, связанных с водой, и накопленный к настоящему времени опыт, показывают, что одного только определение индикаторных микроорганизмов оказывается совсем недостаточно (Талаева и др., 1979). Различные отходы химических, фармацевтических, и других предприятий, постоянно поступающие в воду, не только препятствуют биологическому равновесию в водной среде, но и существенным образом влияют на микробиоту воды, изменяя морфологические и физиологические особенности патогенных микробов (жизнеспособность, биохимические реакции и т.д.). Вследствие этого значительно затрудняется идентификация бактерий и тем самым снижается ценность индикации (Ковалев, 1982; Гинсбург и др., 1999). В связи с этим внимание специалистов микробиологов больше концентрируется на прямом определении патогенных микроорганизмов, наиболее полно информирующих о степени инфицированности воды и связанном с этим возможного обострения эпидемиологической ситуации (Шахназарова, 1981; Карчава, 1983; Колпаков, Козырева, 1989; Пушкарева, 1994; Ковальчук и др., 1997).
Зараженность хозяйственно-бытовых и навозосодержащих сточных вод условно-патогенными и патогенными микроорганизмами имеет значение как фактор загрязнения поверхностных вод и почвы, поскольку с ними поступает большое количество различной микробиоты, во много раз превышающей ее содержание в водоеме, что создает потенциальную эпидемиологическую опасность для населения и существенно влияет на процессы самоочищения водоемов и состояния равновесия в водных биоценозах (Головина и др., 1985; Брызгало и др., 2000; Puyment et al., 2000).
Бактериологическое исследование сточных вод, поступающих на станции аэрации, показало их значительную обсемененность сальмонеллами. По данным ряда авторов, в 70-100 % проб воды взятых из приемной камеры были обнаружены бактерии рода Salmonella (Edel et al., 1972; Хамидов и др., 1984; Талаева и др., 1985; Айзен и др., 1985; Морцев и др., 1988). Зачастую в пробах сточной воды до очистки зафиксированы одновременно несколько сероваров. Индекс сальмонелл составил от 9000 до 50000 КОЕ/л (Гризонев и др., 1975; Кальюлайд, 1983; Головина и др., 1985; Иванов, 1985; Григорьева и др., 1991). Наиболее часто, по данным Головиной и др., были обнаружены сальмонеллы группы В - 39,6%, группы С - 35,8%). Среди серотипов группы В преобладали S .typhimurium (20,8%) и S. derby (11,4%), из группы С- S. virchow (13,2%), S. tennesse (11,3%), из группы Е - S. meleagridis и S. anatum (по 9,4%) (Головина и др., 1980). Согласно другим исследованиям, чаще встречались S. typhimurium, S. derby, S. anatum, S. heidelberg, S infantis, S. virchow (Гречаная, Ситков, 1975).
Стоит отметить, что биологическая очистка и хлорирование хозяйственно-бытовых сточных вод на станциях аэрации не уничтожают сальмонеллы полностью, и количество «положительных» на сальмонеллы проб, в водах, прошедших обработку, колеблется от 30 % до 70 % (Шур, 1970; Борисова и др., 1973; Сидоренко и др., 1975; Артыков, Франдетти, 1975;
Алешня, 1979; Бирк, 1982; Ковалев, 1982;Эргашева, Усманов, 1982; Яровой, 1983).
Важное место в распространении сальмонелл принадлежит отходам боен, птицефабрик и других предприятий по производству пищевых продуктов (Ковалев, 1982; Авазов, Рахимов, 1984; Карагулова, 1985; Комзолова, 1990). В сильно загрязненных сточных водах, где концентрация растворенных белков может достигать 100 мг/л, а так же в сточных жидкостях сахарных заводов сальмонеллы способны не только выживать, но и размножаться (Покровский и др., 1989; Комзолова, 1990; Дзюбан и др., 2001). В воде, содержащей сточные воды целлюлозно-бумажного комбината, сальмонеллы выживали 25 суток, тогда как в контроле погибали на 15-е сутки (Hedrey, 1982).
Поступление сальмонелл в сточные воды может происходить за счет бактерионосителей, вьщеляющих значительное количество патогенов во внешнюю среду, а также лиц со «стертым» течением острых кишечных инфекций. Большой процент сальмонелл поступает в городскую канализацию вместе с неочищенными стоками инфекционных больниц (Борисова и др., 1973; Воронова, Бердников, 1973).
Подводя итог вышесказанному нужно отметить, что сточные жидкости являются массивным источником загрязнения водных объектов патогенными микроорганизмами, что может повлечь за собой обострение эпидемиологической обстановки. В связи с этим необходима разработка более эффективных методов выделения сальмонелл из водной среды и усиление мониторинга за водными объектами.
Определение показателя эффективности и скорости роста сальмонелл
Исследования проводили с использованием: калий фосфорнокислый однозамещенный (ГОСТ 4198 - 75; ЧДА); едкий натр (ГОСТ 4328 - 77; ХЧ); экстракт кормовых дрожжей (ЭКД) (ФГУП НПО «Микроген», г. Махачкала); 0,1 % водного раствора бриллиантового зеленого (ТУ 6-09-4278-76); 0,01 % водного раствора кристаллического фиолетового (ТУ 6-09-4119-75); мясо-пептонный бульон (МПБ; ГОСТ 20730-75), мясо-пептонный агар (МПА; ТУ 46-12-252-78), среда Клодницкого (МУК 4.2.1884-04), агар Эндо (ФС 42-3504-98), висмут-сульфит-агар (ФС 42-3588-98), сыворотки диагностические адсорбированные сухие для сальмонелл (для реакции агглютинации).
В качестве сред сравнения были взяты магниевая среда (MP «Применение магниевой среды для выделения сальмонелл из испражнений больных и носителей, пищевых продуктов, сточных жидкостей и воды открытых водоемов», 1973) и селенитовый бульон Лейфсона (ФС 42-3589-98).
Оценку качества сравниваемых накопительных сред проводили согласно «Методическим рекомендациям к контролю питательных сред по биологическим показателям» (1981). При этом изучали чувствительность среды, показатель эффективности, показатель ингибирования, скорость роста, показатель стабильности основных свойств микроорганизмов.
Чувствительность среды определяли по максимальному разведению культуры, при котором во всех засеянных пробирках был зарегистрирован рост. Для этого культуры тест-штаммов высевали на скошенный МПА, инкубировали в течение 24 ч при температуре 37 С. Из суточной культуры готовили микробную взвесь эквивалентную 10 ед. по стандартному образцу мутности ОСО, с использованием 0,9 % раствора хлорида натрия. Полученную взвесь десятикратными разведениями (9 мл физиологического раствора с 1 мл микробной взвеси) доводили до разведения 10"8 (10 КОЕ/мл). Затем по 1 мл взвеси из разведений 10"5, 10", 10", 10" засевали в 9 мл каждой среды накопления (предлагаемой, магниевой и селенитовой). После инкубации посевов в течение 24 ч при температуре 37 С из пробирок, в которых отмечено помутнение, производили высев 0,1 мл взвеси на 3 чашки Петри со средой МПА (для каждой из сред). Посевы инкубировали в течение 24 ч при температуре 37 С. Учет результатов проводили визуально, путем подсчета выросших колоний. Исследования были проведены в трех повторностях. Контроль посевных доз осуществляли высевом микроорганизмов на чашки Петри с МПА.
Показатель эффективности оценивали по увеличению микробной массы в среде через соответствующий срок инкубации посевов.
Скорость роста оценивали по минимальному времени инкубации посевов, достаточному для выявления роста культур.
Из суточной культуры тест-штаммов сальмонелл, полученной путем высева на скошенный МПА, готовили микробную взвесь эквивалентную 10 ед. по стандартному образцу мутности ОСО. Полученную взвесь десятикратными разведениями (9 мл физиологического раствора с 1 мл микробной взвеси) доводили до разведения 10 7 (100 КОЕ/мл). Затем по 1 мл взвеси из разведений 10 5, 10"6, 10"7 засевали в 9 мл каждой среды накопления (предлагаемой, магниевой и селенитовой). Посевы инкубировали в течение 6,24, 48 ч при температуре 37 С. Из пробирок, в которых отмечено помутнение, производили высев 0,1 мл взвеси на 3 чашки Петри со средой МПА (для каждой из сред). Посевы инкубировали в течение 24 ч при температуре 37 С. Учет результатов проводили визуально, путем подсчета выросших колоний. Исследования были проведены в трех повторностях. Контроль посевных доз осуществляли высевом микроорганизмов на чашки Петри с МПА.
Показатель ингибирования оценивали по степени подавляющего воздействия на постороннюю микробиоту.
На предлагаемую и среды равнения высевали монокультуры бактерий и их смеси. а) Для чистых культур определение проводили согласно описанному выше методу. б) Для смешанных культур: из суточной культуры (для каждой отдельно) S. paratyphi В № 506 и Е. coli № 3912/41 готовили микробную взвесь равную 10 ед. по стандартному образцу мутности ОСО, с использованием физиологического раствора. Полученную взвесь десятикратными разведениями (9 мл физиологического раствора с 1 мл микробной взвеси) доводили до разведения 10"5 (Е. coli № 3912/41) и 10 6 (S. paratyphi В № 506).
Подбор оптимального соотношения ингредиентов в составе предлагаемой среды
При выполнении данного раздела необходимо было решить следующие задачи: подобрать оптимальный состав и соотношение компонентов питательной среды, обеспечивающий высокий уровень накопления биомассы сальмонелл, а также подавить или замедлить рост возможной сопутствующей микробиоты.
Для решения первой задачи нами были использованы: - экстракт кормовых дрожжей (ЭКД) - в качестве источника питательных веществ (4,5 г/л; 5,0 г/л; 5,5 г/л); - калий фосфорнокислый однозамещенный (8,1 г/л; 8,6 г/л; 8,8 г/л; 9,5 г/л); - едкий натр (0,1 г/л; 1,3 г/л; 1,4 г/л; 1,6 г/л);
В качестве ингибиторов посторонней микробиоты апробированы: - бриллиантовый зеленый 0,1 % водный раствор (4,0 мл/л, 5,0 мл/л, 10,0 мл/л) - для ингибирования роста грамотрицательньгх бактерий; - кристаллический фиолетовый 0,01 % водный раствор (8,0 мл/л; 9,5 мл/л; 10,0 мл/л; 20,0 мл/л) - для подавления роста грамположительных микроорганизмов;
В опыт включили штаммы S. typhimurium № 9640, S. derby, S. enteritidis для подбора питательной основы, Е. coli, К. pneumoniae, Е. faecalis в качестве возможной сопутствующей микробиоты. Посевная доза составила 1000, 100 и 10 КОЕ/мл согласно «Методическим рекомендациям к контролю питательных сред по биологическим показателям» (1981).
Результаты экспериментальных исследовании по подбору питательной основы представлены в таблице 2.
При определении влияния ЭКД, едкого натра и калия фосфорнокислого однозамещенного на рост тест-штамма S. typhimurium № 9640, S. enteritidis и S. derby установлено, что оптимальным соотношением является содержание в среде ЭКД в количестве 4,5 - 5,0 г/л, едкого натра 1,3-1,4 г/л, калия фосфорнокислого 8,6 - 8,8 г/л и рН- 6,6 -6,8.
В ходе определении влияния веществ-ингибиторов на рост сопутствующей микробиоты к питательной основе, подобранной ранее, добавляли вещества-ингибиторы и вносили монокультуры испытуемых бактерий. Результаты опытов учитывали через 24 ч инкубации посевов при температуре 37 С.
Анализ полученных данных свидетельствует, что 0,01 % раствор кристаллического фиолетового не задерживает рост сальмонелл в концентрациях 8,0 мл/л, 9,5 мл/л, 10,0 мл/л, 20,0 мл/л. Данные концентрации также не оказывают влияния на рост Е. coli и К. pneumoniae. В тоже время рост Е. faecalis полностью подавлялся при добавлении в среду 10,0 и 20,0 мл/л 0,01 % раствора кристаллического фиолетового (табл. 4).
Добавление к питательной основе 0,1 % раствора бриллиантового зеленого в концентрации 4,0 мл/л не повлияло ни на рост сальмонелл, ни на рост сопутствующей микробиоты. Увеличение вносимой концентрации до 5,0 - 10,0 мл/л не оказывало подавляющего воздействия на рост сальмонелл, но ингибировало рост К coli, К. pneumoniae и Е. faecalis (табл. 5).
Сочетание 5,0 мл/л 0,1 % раствора бриллиантового зеленого и 10,0 мл/л 0,01 % раствора кристаллического фиолетового привело к подавлению роста Е. coli, К. pneumoniae и Е. faecalis при посеве 1000, 100 и 10 КОЕ/мл, не оказывая влияния на рост тест-штаммов сальмонелл.
Подводя итог сказанному выше, можно сделать вывод, что оптимальным соотношением ингредиентов, при котором происходит увеличение количества сальмонелл и подавление роста сопутствующей микрофлоры, явилось:
Сконструированная жидкая среда обогащения для выделения сальмонелл из водных объектов прозрачна, имеет травянисто-зеленый цвет. Показатель концентрации водородных ионов (рН) - от 6,6 до 6,8. Содержание аминного азота - от 0,8 до 1,0 %.
Срок хранения предлагаемой среды накопления 1 год при температуре от 2 до 25 С. Экспериментальные серии питательной среды накопления для выделения сальмонелл из водных объектов готовили по следующей технологии: вносили навески однозамещенного фосфорнокислого калия (8,8 г), натрия гидроксида (1,4 г) и экстракта кормовых дрожжей (5,0 г) в 1,0 л воды очищенной и нагревали ее до полного растворения ингредиентов. Растворенные навески переливали в бутыль, в которую вносили 5,0 мл 0,1 % водного раствора бриллиантового зеленого и 10,0 мл 0,01 % водного раствора кристаллического фиолетового. Проверяли рН среды. Затем подвергали среду стерилизационной фильтрации. Для чего использовали метод мембранной фильтрации с применением мембранных фильтров «Владипор» марки МФЦ и МФЦ - 2 с использованием установки УСФ 293 - 7.
Распространение, количественная и видовая характеристика сальмонелл, выделенных из воды горканализации городов Ростова-на-Дону и Азова с применением различных сред накопления
Всего было исследовано 56 проб сточной воды горканализации городов Ростова-на-Дону и Азова на разных этапах очистки с применением 3 сред накопления.
При исследовании воды горканализации г. Ростова-на-Дону положительными на сальмонеллы, в целом, оказались 100,0 % проб (опытная среда), 84,4 % (магниевая) и 18,8 % (селенитовая). При этом средний индекс сальмонелл составил 6015,6 ± 3310,0 КОЕ/л при использовании разработанной среды, 202,2 ± 63,9 КОЕ/л - магниевой и лишь 3,4 ± 1,2 КОЕ/л - селенитовой (различия между количественным содержанием сальмонелл в 1 л исследуемой воды существенны и статистически достоверны: t = 1,9, р 0,05; t = 1,8, р 0,05, соответственно).
При исследовании воды горканализации г. Азова сальмонеллы в среднем выделены в 83,3 % проб с использованием разработанной среды, 66,6 % и 33,3 % магниевой и селенитовой, соответственно. При этом средний индекс сальмонелл составил 1380,6 ± 459,5 КОЕ/л при использовании разработанной нами среды, 65,3 ± 22,0 КОЕ/л - магниевой и лишь 6,0 ± 2,1 КОЕ/л - селенитовой (различия между количественным содержанием сальмонелл в 1 л исследуемой воды существенны и статистически достоверны: t = 2,7, р 0,001 и t = 3,0, р 0,001, соответственно).
В сточных водах, отобранных до очистки, сальмонеллы были обнаружены в 100,0 % проб с использованием опытной среды и магниевой сред, тогда как с использованием селенитовой лишь в 43,8 %. Было выделено 36 сероваров при использовании предлагаемой нами среды, 18 - магниевой и 8 - селенитовой. Индекс сальмонелл при этом составил на предлагаемой среде 5997,8 ± 2222,4 КОЕ/л, на магниевой 150,7 ± 49,5 КОЕ/л, на селенитовой 7,2 ± 2,9 КОЕ/л (различия между количественным содержанием сальмонелл в 1 л исследуемой воды существенны и статистически достоверны: t = 2,6, р 0,01 и t = 2,7, р 0,01, соответственно). При этом с опытной среды выделено 24 серовара сальмонелл , 13 сероваров с магниевой и 5 - с использованием селенитовой среды.
В сточных водах, прошедших механическую и биологическую очистку и обеззараживание, в 66,7 % исследуемых проб с помощью опытной среды были обнаружены сальмонеллы 17 сероваров в количестве 683,6 ± 296,7 КОЕ/л. При использовании магниевой среды в 53,3 % проб выделены 11 сероваров сальмонелл в количестве 18,5 ± 7,0 КОЕ/л. С использованием селенитовой среды сальмонеллы обнаружены нами в 6,7 % проб (1 серовар) в количестве 0,4 ± 0,2 КОЕ/л. Различия между количественным содержанием сальмонелл в 1 л исследуемой воды существенны и статистически достоверны: t = 2,2, р 0,05 и t = 2,3, р 0,05, соответственно.
Всего на разных этапах очистки сточной воды выделено 437 культур бактерий рода Salmonella 47 сероваров. Из них 280 культур при помощи разработанной среды, 127 -магниевой и лишь 30 - селенитовой,
При использовании разработанной среды из воды горканализации чаще других выделены следующие серовары: S. derby, S. essen, S. typhimurium, S. brandenburg, S. enteritidis, магниевой - brandenburg, S. derby, S. essen, S. heidelberg и S. derby, S. brandenburg, S. reading - селенитовой (табл. 21).
Всего было исследовано 109 проб воды р. Дон, взятых в биотопах с различной степенью бактериального загрязнения. Исследования, с применением различных сред накопления, показали, что сальмонеллы имеют широкую циркуляцию в воде Нижнего Дона, они зарегистрированы во всех изучаемых биотопах. В целом по водоему бактерии рода Salmonella вьщелены в 93,6 % проб с применением предлагаемой нами среды, в 70,6 % - с магниевой и лишь в 25,7 % - с селенитовой (рис.15).
Если рассматривать каждый биотоп в отдельности, можно заключить, что самый высокий процент выделения сальмонелл (100,0 %) с применением разработанной среды был отмечен из биотопов в районе речного вокзала, пляжа г. Ростова-на-Дону и ниже выпуска сточных вод азовской горканализации. Самый низкий процент выделения зарегистрирован из воды ростовского водозабора - 77,8 %, тогда как из воды водозабора г. Азова этот процент составил - 92,3 %, что объясняется незначительным удалением последнего от городской черты г. Ростова-на-Дону на расстояние 42 км, тогда как для самоочищения водоема необходим более длительный период.
Очевидно преимущество предлагаемой нами среды накопления перед магниевой и селенитовой, поскольку вновь созданная среда, позволяет выделять сальмонеллы в большем проценте проб из биотопов с различной степенью бактериологического загрязнения.
Таким образом, полевые исследования показали преимущество использования жидкой слабоингибиторной питательной среды накопления при выделении сальмонелл из воды различной степени биологического загрязнения. Разработанная нами среда более чувствительна, позволяет выделять сальмонеллы разных серологических групп, нежели среды применяемые в практике здравоохранения. Данная среда позволяет повысить эффективность проведения мониторинга за водными объектами с большей степенью достоверности результата.
