Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. СОВРЕМЕННЫЕ АСПЕКТЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ЛИСТЕРИОЗА
Роль листерий в инфекционной патологии человека 14
Особенности биологических свойств листерий 24
Современные методы микробиологической диагностики листериоза....36
Питательные среды для культивирования листерий 48
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
РАЗРАБОТКА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД И МИКРОТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ
НАКОПЛЕНИЯ, ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ЛИСТЕРИЙ 62
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 62
2.1. Материалы исследования 62
2.1.1 .Штаммы микроорганизмов 62
2.1.2.Питательные среды и реагенты 70
2.1.3 .Лабораторные животные 73
2.2. Методы исследования 73
2.2.1 .Физико-химические методы 73
2.2.2.Биологические методы 74
2.3.Методы статистической обработки материала 81
3. РАЗРАБОТКА И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ
БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ
КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЛИСТЕРИЙ 83
Изучение физико-химических и энергетических показателей культивирования L. monocytogenes 83
Изучение различных гидролизатов как основы питательных сред для выделения, накопления и идентификации листерий 89
Разработка рецептуры среды для накопления L. monocytogenes 99
3.4. Разработка селективного питательного бульона для предварительного
обогащения культур Listeria в пищевых продуктах 123
Разработка селективной питательной среды для выделения и культивирования листерий (листерия-агар) 144
Разработка сухой питательной среды для первичной идентификации листерий (теллурит- агар) 161
3.7. Разработка дифференциально-диагностических питательных сред для
изучения биологических свойств листерий 179
Питательная среда для определения подвижности культур листерий 179
Питательная среда для определения лецитиназной активности листерий 186
РАЗРАБОТКА МИКРОТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ УСКОРЕННОЙ БИОХИМИЧЕСКОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЛИСТЕРИЙ 194
Разработка состава питательных сред для ячеек микро-контейнеров.... 195
Подбор оптимальной микробной посевной дозы в ячейку микроконтейнера 204
Изучение эффективности микротест-систем для биохимической идентификации листерий 211
ПОЛУЧЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ СЕРИЙ РАЗРАБОТАННЫХ СУХИХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД И МИКРОТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ НАКОПЛЕНИЯ, ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ЛИСТЕРИЙ 227
Технологическая схема производства сухих питательных сред для листерий 227
Технология изготовления МТС-Л для биохимической идентификации листерий 229
Определение биохимических свойств листерий с использованием МТС-Л 232
4 6.0.ИЗУЧЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ РАЗРАБОТАННЫХ ПИТПТЕЛЬНЫХ СРЕД И МИКРОТЕСТ-СИТЕМЫ В ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ МИКСТ-ИНФЕКЦИЙ У ЖЕНЩИН С
АКУШЕРСКО-ГИРНКОЛОГИЧЕСКОЙ ПАТОЛОГИЕЙ 237
7.0. ИЗУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ШТАММОВ L. monocytogenes, ВЫРАЩЕННЫХ НА РАЗРАБОТАННЫХ
СРЕДАХ 256
ОБСУЖДЕНИЕ 265
ВЫВОДЫ 284
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 286
ПРИЛОЖЕНИЕ 316
Введение к работе
Актуальность проблемы. Несмотря на несомненные успехи, достигнутые в борьбе с инфекционными болезнями, значимость инфекционного фактора в патологии человека не только не снижается, но и проявляет тенденцию к нарастанию (63, 64, 65, 70, 71).
В связи с этим существенно расширились представления о роли инфекционных агентов в возникновении и развитии патологических процессов у человека. К числу вновь открытых в ушедшем ХХ-ом столетии инфекций с доказанной нозологической самостоятельностью относят листериоз, возбудитель которого широко распространен в природе и вызывает острое инфекционное заболевание людей и животных (2, 6, 84, 86, 91,92,93).
Листериоз, не являлась широко распространенной инфекцией и уступая таким заболеваниям, как сальмонеллезы и кампилобактериозы по количеству выявленных случаев, значительно превосходит их по тяжести клинического течения и проценту летальных исходов. Из 2518 больных листериозом, выявленных в США в 1997г., в 20% случаев имел место летальный исход, а госпитализация требовалась в 92% случаев (Тартаковский И.С., 2000, Mead P.S. et all, 1999).
Листериоз у взрослых чаще всего протекает с симптомами менингита, менингоэнцефалита, сепсиса. Вместе с тем возрастает число случаев листериоза с необычными клиническими проявлениями, такими как: эндокардит, перитонит, холецистит, остеомиелит, абсцессы и др. Наибольшую опасность листериозная инфекция представляет для беременных и новорожденных, вызывая выкидыши, мертворождение, пороки развития плода, а также менингоэнцефалиты, сепсис и пневмонии у новорожденных. Несмотря на своевременную антибиотикотерапию, смертность при перинатальном и неонаталыюм листериозе достигает 30-
50%, в том числе при внутрибольничных вспышках в роддомах (Тартаковский И.С., 2002г; Kaufmann S.H.E.,1993 г; Lorber В. 1997 г.)
В последние годы наблюдается рост числа случаев листериоза на фоне онкологических заболеваний, почечной и сердечной недостаточности, диабета, у лиц пожилого возраста, а также на фоне иммунодепресантной терапии, сопутствующих заболеваний, в том числе ВИЧ-инфекции. У этой группы пациентов листериоз встречается в 150-300 раз чаще, чем в общей популяции (84, 85, 86).
Разнообразные клинические проявления листериоза на фоне снижения клеточного иммунитета при лимфомах, СПИДе, беременности, иммуносупрессивной терапии наряду с экспериментальными данными подтверждают ведущую роль клеточного иммунитета в развитии листериозной инфекции (84,85,86).
В последние годы крупные вспышки листериоза с высоким процентом летальных исходов обусловлены потреблением пищевых продуктов, прежде всего, сыра, других молочных продуктов и салатов, мясных, куриных и рыбных изделий (84,85,86).
Начиная с 1992г. в Российской Федерации официально регистрируется заболеваемость листериозом. Количество положительных находок невелико (до 100 случаев ежегодно), что, вероятно, связано с отсутствием эффективной системы санитарно-эпидемиологического надзора за листериозом и неудовлетворительным качеством лабораторной диагностики.
Одним из важных этапов совершенствования санитарно-эпидемиологического надзора и лабораторной диагностики листериоза в России являются разработка и промышленное производство отечественных селективных сред для накопления и выделения листерий, а также микротест-систем, необходимых для реализации современных схем выделения и экспресс-биохимической идентификации L.monocytogenes в соответствии с международными стандартами и регламентация общепринятых методов
7 выделения и идентификации возбудителя соответствующими документами Минздравсоцразвития РФ (50,60,61,83,85,87,90,91,96,108,113).
Создание современной диагностической базы позволит осуществлять не только лабораторную диагностику листериоза среди больных, но и профилактику среди групп риска (беременных, новорожденных и лиц с нарушением иммунного статуса) (69, 86, 110, 160, 159).
Анализ различных методических подходов к диагностике листериоза выявляет ведущую роль бактериологических методов выделения и идентификации L.monocytogenes при создании новых селективных сред и микротест-систем, а также указывает на необходимость их быстрого внедрения в практику клинических лабораторий и центров санэпиднадзора.
В 2002г. утверждены методические указания, для организации контроля пищевых продуктов на наличие в них Listeria monocytogenes. Введение обязательных регламентированных требований санитарно-бактериологического контроля за обсемененностью пищевых продуктов патогенными штаммами листерии позволило обратить более пристальное внимание к проблеме листериоза и позволит получить реальную картину ситуации в целом по России.
Основные зарубежные фирмы производители питательных сред (фирмы «Oxoid», «BBL», «Merck», «bio Merieux», «HiMedia» и др.) выпускают сухие коммерческие селективные среды для выделения и накопления листерии. Однако использование этих сред в практических лабораториях нашей страны крайне ограничено по причине их высокой стоимости.
В настоящее время в арсенале лабораторной службы отсутствуют отечественные питательные среды для культивирования, выделения и идентификации патогенных листерии. Кроме того, не менее важно применение для экспресс-диагностики и биохимической идентификации листерии современных тест-систем, промышленное производство которых также отсутствует в нашей стране.
В связи с этим диссертационная работа посвящена решению ключевых вопросов микробиологической диагностики листериоза.
Цель исследования. Разработка питательных сред и микротест-системы для накопления, выделения и идентификации листерий.
Задачи исследования;
Экспериментально обосновать рецептуру питательной среды для накопления L.monocytogenes при выделении из клинического материала и состав селективного питательного бульона для предварительного обогащения культур Listeria при контроле пищевых продуктов.
Сконструировать агаризованные питательные среды для выделения, культивирования и идентификации листерий.
3. Разработать и апробировать в эксперименте и на клиническом
материале микротест-систему для ускоренной биохимической
идентификации листерий.
4. Отработать технологию производства питательных сред и
микротест-системы для накопления, выделения и идентификации листерий.
Определить диагностическую ценность разработанных препаратов при бактериологическом исследовании клинического материала и контроле пищевых продуктов.
Предложить рациональную схему исследования клинического материала на листериоз.
Научная новизна. Впервые с учётом питательных потребностей возбудителя научно обоснованы рецептуры, экспериментально и клинически апробированы созданные на их основе отечественные питательные среды для накопления, выделения и идентификации листерий. Сконструированные среды обеспечивают высокий уровень накопления Listeria при их минимальных количествах в исследуемом клиническом материале, что позволяет существенно сократить сроки выявления возбудителя, а также провести идентификацию патогена по биохимическим тестам. Установлена диагностическая ценность созданных питательных сред для лабораторной
9 диагностики листериозной инфекции. Приоритет разработанных питательных сред для накопления и первичной идентификации листерий подтвержден патентами (№2158758 от ЮЛ 1.00г и № 2201957 от 04.05.01 г).
Впервые разработана отечественная микротест-система для ускоренной биохимической идентификации листерий (МТС-Л), позволяющая провести идентификацию листерий через 6 ч инкубации вместо 18 ч при использовании традиционных сред Гисса.
Экспериментально доказана стабильность сохранения биологических свойств листерий при культивировании на разработанных питательных средах с использованием расширенного набора музейных штаммов и свежевыделенных культур листерий из исследуемого материала различного происхождения.
Практическая значимость работы. Впервые в России на производстве филиала ФГУП НПО «Микроген» МЗ и СР РФ НПО «Питательные среды» разработаны и освоены питательные среды и микротест-система для накопления, выделения и идентификации листерий.
Питательная среда для накопления листерий, помимо, использования с целью выделения патогена из клинического материала, может применяться при получении биомассы листерий в экспериментальных исследованиях и на биотехнологических производствах.
Использование питательной среды для предварительного обогащения листерий при микробиологическом контроле пищевых продуктов позволит обеспечить эффективный эпидемиологический надзор за распространением листериоза, обусловленного инфицированными продуктами питания.
Применение разработанной среды для выделения листерий при определении чувствительности к антибактериальным препаратам сократит количество питательных сред, используемых в процессе диагностики.
Созданная микротест-система для биохимической идентификации листерий существенно ускорит сроки получения результатов бактериологических исследований в клинико-диагностических лабораториях.
Предложенная рациональная схема бактериологического исследования клинического материала на листериоз позволяет сократить сроки выделения и идентификации возбудителя с использованием сконструированных сред и микротест-системы.
На основании проведенных исследований разработана нормативно-
техническая документация (НТД) для промышленного выпуска
питательных сред и микротест-системы для накопления, выделения и
идентификации листерий. По результатам исследований утверждены НТД:
ФСП 42-0504-7919-06 и ПР №1241-02 «Сухая питательная среда для
накопления листерий»; ФСП 42-0504-7918-06 и ПР №1309-03 «Сухая
питательная среда для выделения и культивирования листерий».
Разработанные питательные среды и микротест-система апробированы в специализированных лабораториях ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (Москва), РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов), ВГНИИ контроля и стандартизации ветеринарных препаратов (Москва), а также в клинических лабораториях ДНЦ РАН (Махачкала), родильных домов №1 и №2 (Махачкала). По результатам испытаний питательных сред и микротест-системы получены положительные заключения от этих учреждений о целесообразности их применения в диагностических целях.
Внедрение разработанных сред и микротест-системы в медицинскую практику позволит обеспечить лабораторную службу страны стандартными препаратами для бактериологического исследования клинического материала на листериоз и контроля пищевых продуктов на обсемененность листериями.
Методические приемы по биохимической идентификации листерий, разработанные в ходе исследований, вошли в учебное пособие для студентов медицинских вузов «Микротест-системы в лабораторной диагностике инфекционных болезней» (М.: «Медицина»,2006), рекомендованное Учебно-методическим объединением по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России.
Основные положения, выносимые на защиту
Экспериментально обоснован состав и разработана технология получения сухих питательных сред для накопления, выделения и идентификации листерий.
Сконструирована и апробирована микротест-система МТС-Л для биохимической экспресс-идентификации листерий.
При бактериологическом исследовании клинического материала на листериоз и контроле пищевых продуктов на обсемененность культурами листерий доказана диагностическая эффективность разработанных препаратов.
Предложена рациональная схема бактериологического исследования на листериоз, позволяющая сократить сроки выделения и идентификации возбудителя.
Апробация материалов диссертации. Материалы диссертации доложены на научно-практической конференции, посвященной 75-летию государственной санитарно-эпидемиологической службы «Региональные проблемы охраны окружающей среды и здоровья населения» (Махачкала, 1997г.); на VI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1999г.); на 3-й научно-практической конференции НПО «Питательные среды» МЗ РФ «Актуальные вопросы разработки и производства диагностических сухих питательных сред и микротест-систем» (Махачкала, 2001 г.); на VIII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002г); на научно-практической конференции, посвященной 50-летию НПО «Питательные среды» МЗ РФ «Разработка и стандартизация микробиологических питательных сред и тест-систем» (Махачкала, 2003г.); на XI11 Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006г.);
Публикации. Основное содержание диссертации, выполненной в рамках НИР 01.99.0005312, 01.95.0003694, 01.98.0007058, отражено в 30 опубликованных работах.
12 Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 315 страницах и состоит из введения, обзора литературы, 7 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 338 источников и приложения. Материалы исследований иллюстрированы 88 таблицами и 36 рисунками.
13 СОКРАЩЕНИЯ ПО ТЕКСТУ ДИССЕРТАЦИИ
АГВ - среда для определения чувствительности
микроорганизмов к антибиотикам
ГРМ - гидролизат рыбной муки
ГОСТ - государственный отраслевой стандарт
МТС - микротест-система
МУК - методические указания
ОСО - отраслевой стандарт образец (мутности)
РП - регламент производства
СПА - сухой питательный агар
СПБ - сухой питательный бульон
ТУ - техничекие условия
TCB(TSB) - триптиказо-соевый бульон
TCA(TSA) - триптиказо-соевый агар
ФС - фармакопейная статья
ФСП - фармакопейная статья предприятия
ЭПР - экспериментально-производственный регламент
ЭКД - экстракт кормовых дрожжей
