Введение к работе
Актуальность темы
Согласно оценкам ВОЗ, с каждым годом во всем мире регистрируется все большее число новых случаев заболевания туберкулезом. Так, в 2007 г. насчитывалось 9,27 млн. новых случаев заболевания туберкулезом и 1,75 млн. человек умерло от туберкулеза, из которых 0,45 млн. были ВИЧ-инфицированы [WHO, 2008]. Возбудители туберкулеза относятся к Mycobacterium tuberculosis complex, куда входят M.tuberculosis (MET), M.bovis, M.bovis BCG, M.microti, M.africanum.
Наряду с широким распространением по всему миру туберкулеза, отмечается также рост заболеваемости микобактериозами, возбудителями которых являются нетуберкулезные микобактерий (НТМБ) (Оттен Т.Ф., 2004; Макарова М.В., 2007). Резкий подъем числа заболеваний, вызываемых НТМБ, в том числе M.avium, M.intracellulare, M.kansasii, M.fortuitum и др., в значительной мере обусловлен развитием эпидемии ВИЧ-инфекции - у 25-50% больных СПИДом развивается диссеминированная микобактериальная инфекция (Adle-Biassette Н. et al., 2003; Bonard D. et al., 2004). Особенностью НТМБ является их высокая природная резистентность к антибактериальным препаратам, в том числе и противотуберкулезным. На сегодня по литературным данным во всем мире известно более 120 видов НТМБ [Griffith D.E. et al., 2007; Euzeby J.P., 2008]. В России распространенность НТМБ в 2004-2005 гг. составила 0,5-6,2 % среди всех микобактерий у впервые выявленных больных [Оттен Т.Ф., Васильев А.В., 2005]. При схожей клинической картине туберкулеза и микобактериоза главным критерием при постановке диагноза микобактериоза является бактериологическое исследование больного с выделением культуры микобактерий и их идентификацией.
Классический бактериологический метод выделения и идентификации микобактерий основывается на способности роста культуры при различных температурах, оценке скорости роста, морфологии колонии, пигментообразования, ферментативной активности, биохимических свойств
4
[Зыков М.П., Ильина Т.Б., 1978]. Основным недостатком
бактериологического метода является длительность. Так, по данным авторов
Т.Ф. Оттен, А.В. Васильев (2005г.) сроки идентификации НТМБ
классическими бактериологическими методами достигают до 6 месяцев. По
приказу №109 МЗ РФ от 21.03.2003 г. «О совершенствовании
противотуберкулезных мероприятий в РФ» диагноз туберкулез ставится
после двухкратного подтверждения бактериологическим методом, а все
остальные методы идентификации являются дополнительными.
Существующие на сегодняшний день ускоренные методы идентификации микобактерий, такие как молекулярно-генетические, хроматографические, автоматизированные системы культивирования на жидких средах, при несомненных своих достоинствах и преимуществах существенно ограничены для широкого внедрения и применяются в основном в крупных централизованных микробиологических центрах. Для проведения этих исследований необходима специализированная лабораторная служба, высококвалифицированный персонал, используются дорогостоящие расходные материалы и оборудования. Все это делает актуальным поиск, разработку и внедрение в широкую практику новых современных экспресс методов идентификации микобактерий.
В связи с этим, мы обратили внимание на принципиально новый перспективный экспрессный лазерно-флюоресцентный метод. Он основан на регистрации и анализе собственной флюоресценции микроорганизмов, индуцированной лазерным излучением. Лазерно-флюоресцентный метод разработан отечественными авторами М.Т.Александровым, А.А.Воробьевым, Е.ШТашковым и был удостоен в 2002 году Государственной премии Российской Федерации. Однако до настоящего времени экспериментально-теоретическое обоснование лазерно-флюоресцентного метода, его методическое и технологическое обеспечение для индикации и идентификации M.tuberculosis complex и нетуберкулезных микобактерий не были разработаны.
5 Таким образом, проблема разработки современных экспрессных,
чувствительных и специфичных методов идентификации микроорганизмов,
доступных для широкого применения, остается на сегодняшний день весьма
актуальной, в первую очередь, для диагностики таких опасных
инфекционных заболеваний, как туберкулез и микобактериоз.
Цель исследования:
Разработать принципы ускоренной идентификации различных видов микобактерий лазерно-флюоресцентным методом.
Задачи исследования:
Изучить лазерно-индуцированную аутофлюоресценцию микобактерий комплекса M.tuberculosis и нетуберкулезных микобактерий in vitro.
Создать базу данных спектрально-флюоресцентных характеристик микобактерий в различных концентрациях, микобактериальных ассоциациях.
Разработать принципы повышения эффективности идентификации микобактерий лазерно-флюоресцентным методом на основе использования детергента (мирамистин), учета оптических характеристик среды и факторного анализа их спектральных характеристик.
Разработать алгоритм экспресс-идентификации микобактерий лазерно-флюоресцентным методом в чистых и смешанных культурах.
Провести апробацию лазерно-флюоресцентного метода экспресс-идентификации микобактерий на неизвестных клинических штаммах и оценить его эффективность.
Научная новизна
Проведено экспериментально-теоретическое обоснование применения лазерно-флюоресцентного метода для экспресс-идентификации разных видов микобактерий {M.tuberculosis complex и НТМБ). Впервые создана база данных спектрально-флюоресцентных характеристик 17 видов микобактерий в чистых культурах и их смесях, основанная на фундаментальном изучении
их лазерно-индуцированной аутофлюоресценции. На основании
базы данных амплитудно-спектральных характеристик флюоресценции микобактерий впервые разработан ускоренный метод их идентификации в смешанных культурах. Теоретически обосновано и экспериментально установлено, что для объективной и эффективной идентификации микобактерий необходимо повышение чувствительности существующего лазерно-флюоресцентного метода. Объективно обосновано применение для этих целей детергента (мирамистин), учета оптических характеристик среды и факторного анализа их спектральных характеристик.
Практическая значимость работы
Проведенные экспериментально-теоретические и лабораторно-клинические научные исследования явились фундаментальным этапом разработки лазерно-флюоресцентного метода экспресс-идентификации микобактерий. Данная научно-исследовательская работа имеет важное значение в практической фтизиатрии, так как может позволить реализовать новый метод экспресс индикации и дифференциации возбудителей туберкулеза и микобактериозов в клинических штаммах с предварительным результатом идентификации уже через 1-2 часа и с окончательным через 1-2 суток по сравнению с классическим бактериологическим методом (3-6 мес).
Положения, выдвигаемые на защиту
На основании экспериментальных исследований объективно обосновано применение метода лазерной флюоресценции для ускоренной идентификации M.tuberculosis complex и нетуберкулезных микобактерий в чистых и смешанных культурах.
Разработаны основные принципы повышения эффективности лазерно-флюоресцентного метода идентификации микобактерий на основе использования детергента (мирамистин), учета оптических характеристик среды и факторного анализа спектральных характеристик микобактерий.
7
3. Лазерно-флюоресцентный метод позволяет проводить
индикацию и дифференциацию возбудителей туберкулеза и микобактериоза в клинических штаммах с эффективностью 80-90%. Апробация работы и публикации
Основные положения работы доложены на I Международной научно-практической конференции «Научно-техническое творчество молодежи -путь к обществу, основанному на знаниях» 24-27 июня 2009 года, за участие в которой работа была награждена дипломом 1 степени и удостоена золотой медали.
Апробация диссертации состоялась на заседании научной конференции кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ММА им. И.М.Сеченова 12 декабря 2008г. (протокол №6).
По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ. Внедрение в практику
Результаты исследования внедрены в лабораторную практику Московского городского научно-практического Центра борьбы с туберкулезом и используются в учебном процессе для студентов, аспирантов и врачей на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ММА им. И.М.Сеченова.
Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», 2-х глав собственных результатов исследования, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. В диссертации представлено 22 таблицы и 45 рисунков. Список литературы включает 142 источника, из них 65 отечественных и 77 зарубежных авторов. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования В ходе работы были изучены спектрально-флюоресцентные свойства 19 видов микроорганизмов, из них 17 видов микобактерий (МБ) и 2 условно-
