Введение к работе
Актуальность
Бифидобактерии - род грачположительных неспорообразующих анаэробных бактерий, являющихся облигатными обитателями желудочно-кишечного тракта человека и многих видов животных, как позвоночных, так и беспозвоночных. В подавляющем большинстве случаев бифидобактерии находятся в тесных мутуалистических отношениях с организмом хозяина, а разрыв такой симбиотической связи грозит нарушением нормальной физиологии интестиналыюго тракта последнего. Длительная симбиотическая коэволюция бифидобактерии и человека привела к формированию у данного рода микроорганизмов большого количества взаимовыгодных адаптации, благотворно влияющих на жизнедеятельность макроорганизма хозяина. Среди таких свойств наиболее значимы: активная и пассивная колонизационная резистентность, направленная на предотвращение заселения желудочно-кишечного тракта условно-патогенными и патогенными микробами, участие в катаболических и биосинтетических процессах в кишечной трубке и иммуномодулирующее влияние [М.С. Collado и другие, 2005; A. Pompei и другие, 2007; Н Tanaka и другие, 2000; F. Backhed и М. Hornef, 2003].
Позитивные пробиотические свойства бифидобактерии с успехом использует как медицина, так и пищевая промышленность. В нашей стране был создан целый ряд биотерапевтических препаратов, имеющих в своем составе живые культуры бифидобактерии и широко применяющихся для лечения широкого круга гастроэнтерологических заболеваний [Г.И. Гончарова, 1982; Б.А. Ефимов и В.М. Коршунов, 1992; С.Н. Барзашка-Попова, 1990]. Бифидобактерии находят все большую популярность как компоненты разнообразных кисломолочных продуктов и продуктов функционального питания.
Благодаря своему общепризнанному благотворному влиянию на физиологию как интестинального тракта, так и всего организма человека в целом бифидобактерии стали объектом многочисленных исследований. Однако до недавнего времени существовали лишь отрывочные сведения о молекулярной биологии и генетике данного рода бактерии Значительный прогресс в изучении тонких молекулярных свойств бифидобактерии наметился на рубеже XX и XXI вв. Последние годы ознаменовались завершением секвенирования геномов нескольких видов бифидобактерии [М A. Schell и другие, 2002] и публикацией значительного числа работ, посвященных вопросам их молекулярной физиологии и молекулярных механизмов взаимодействия с организмом хозяина [М. Ventura и другие. 2005;
1 і
Y '
A. Margolles и другие, 2006; J. De Dea Lindner и другие, 2007].
Отдельной важной темой является изучение плазмид и мобильных генетических элементов бнфидобактерий [Б А Ефимов и другие, 2008] Включение в инструментарий исследователя подобных генетических элементов позволяет от описательной генетики перейти к экспериментальной, базирующейся на методологии генетической инженерии Вместе с тем, расширение наших знаний о генетике этого рода прокариот и разработка методов генетического манипулирования ими позволит уже в ближайшем будущем направленно создавать пробиотичсские и биотерапевтические штаммы с принципиально новыми свойствами В частности, это сделает возможным получение рекомбинантных штаммов-продуцентов белковых, нуклеиновых или иных молекул с терапевтическими свойствами.
Цель настоящего исследования
Разработать оригинальный инструментарий и методологию, необходимые для осуществления простой и эффективной генетической модификации бнфидобактерий и последующей продукции в шгх гетерологичных белков с терапевтическими свойствами (цитокинов, ферментов, вакцинных антигенов и пр.)
Задачи исследования:
1. Провести поиск плазмидных ДНК в коллекции штаммоз бнфидобактерий, выделенных
от здоровых детей раннего возраста;
-
Определить полные нуклеотидные последовательности избранных плазмид и проанализировать их методами биоинформатики;
-
На основе описанных плазмид создать челночные клонирующие вектора Bifidobacterium-E. coh, позволяющие доставлять гетерологичные гены в клетки бнфидобактерий,
-
Разработать оптимальный протокол генетической трансформации перспективного хозяйского штамма бифидобактерий;
-
Подобрать необходимые генетические элементы (промоторные, терминаторные и лидерные последовательности), обеспечивающие оптимальную транскрипцию и трансляцию гетерологичного гена, а также эффективную секрецию рекомбинантных белков.
Научная новизна
В ходе настоящего исследования впервые было проведено изучение плазмидных профилей в индигенных штаммах бифидобактерий, выделенных от детей раннего возраста Обнаружена существенная частота встречаемости плазмидных ДНК в бифидобактериях различных видов и выявлено доминирование ограниченного числа консервативных семейств таких плазмид в популяциях бифидобактерий. Определены и аннотированы полные нуклеотидные последовательности двух новых плазмид, в числе которых одна - первая полностью просеквенированная плазмида из бифидобактерий вида Bifidobacterium bifidum, вторая - плазмида с нетипичным для бифидобактерий генным составом, напоминающая некоторые конъюгативные плазмиды бактерий рода Streptomyces.
Продемонстрировано присутствие на описанных плазмидах генов, вовлеченных в процесс конъюгативного переноса данных молекул ДНК. Отдельный интерес представляет присутствие на одной из плазмид набора генов tra необходимых и достаточных, по всей видимости, для осуществления конъюгативного переноса данной плазмиды по уникальному стрептомицет-подобному механизму.
На основе изученных плазмид создана серия челночных клонирующих векторов Е coli -Bifidobacterium, способных к автономной репликации в обоих типах хозяйских клеток и несущих соответствующие селективные маркерные гены для селекции в них. Продемонстрирована способность большей части полученных векторов к трансформации бифидобактерий вида Bifidobacterium breve с относительно высокой эффективностью.
Сконструированы экспрессирующие челночные вектора, несущие необходимые регуляторные элементы для обеспечения экспрессии гетерологичных генов в бифидобактериях. Функциональность полученных плазмидных векторов была подтверждена при помощи трех модельных генов - FGF2 человека, ILI0 человека и атуВ Bifidobacterium adolescentis. Кроме того, в случае с генами FGF2 и IL10, впервые была осуществлена гетерологичная экспрессия человеческого гена в бактериях рода Bifidobacterium.
Практическая значимость работы
Полученные нами данные о высокой частоте встречаемости плазмидных ДНК в клетках бифидобактерий, индигенных для интестинального тракта здоровых детей, а также данные об отсутствии каких-либо потенциально опасных маркеров на данных плазмидах могут внести существенные коррективы в распростралепное мнение о недопустимости включения
плазмидных штаммов бифидобактерий в состав препаратов-пробиотиков
Разработанные в ходе настоящего исследования челночные клонирующие вектора Е coh - Bifidobacterium, а также методы их доставки в клетки Bifidobacterium breve имеют высокую практическую значимость. Данный инструментарий может быть использован для доставки и экспрессии гетерологичных генов в клетках бифидобактерий как в рамках фундаментальных исследований, направленных на изучение биологии бифидобактерий, так и в рамках прикладных работ, имеющих целью получение пробиотических или биотерапевтических штаммов бифидобактерий с новыми полезными свойствами
Полученные нами штаммы бифидобактерий, экспрессирующие и секретирующие основной фактор роста фибробластов человека (FGF-2) я интерлейкин-10 человека (ИЛ-10), имеют как демонстрационное, так и самостоятельное прикладное значение. С учетом последних данных о возможности использования белков FGF-2 и ИЛ-10 для лечения различных тяжелых заболеваний желудочно-кишечного тракта, указанные штаммы-продуценты могут стать прообразами принципиально новых бнотсрапевтических штаммов, полученных с использованием методов генетической инженерии
Разработанные нами Еекторные системы, в комбинации с клонированным геном (X-амилазы атуВ Bifidobacterium adolescentis, могут лечь в основу нового поколения безопасных клонирующих векторов для бифидобактерий, соответствующих стандарту «food-grade», полностью лишенных потенциально-опасных фрагментов ДНК и пригодных для получения рекомбинантных пробиотических и биотерапевтических штаммов бифидобактерий.
Разработанные в ходе данного исследования векторные системы уже в настоящее время используются для фундаментальных и прикладных исследований бактерий рода Bifidobacterium как в нашей стране, так и в ряде лабораторий США и Европы
Апробация работы
Основные положения работы были доложены на заседании научной конференции кафедры микробиологии и вирусологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава 12 марта 2008 года, на заседаниях секции гнотобиологии Московского отделения Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им. И И Мечникова в 2006 и 2007 годах, а также на международном симпозиуме «Propionibacteria and Bifidobacteria. Dairy and Probiotic Applications» (Wadahl, 2007).
Положения выносимые на защиту:
1. Штаммы бифидобактерий, колонизирующие кишечник здоровых детей, часто являются носителями небольших кольцевых критических плазмидных ДНК, которые реплицируются по механизму «катящегося кольца», несут ряд генов, кодирующих консервативные белки с неизвестными функциями, а также обладают потенциальной способностью к коныогативному переносу;
2 Криптические плазмиды, выделенные из кишечных штаммов бифидобактерий, могут быть использованы для создания челночных клонирующих векторов Bifidobacterium — E.coli, обеспечивающих возможность проведения генетической трансформации бифидобактерий;
-
Полученные в ходе данного исследования челночные клонирующие вектора могут быть использованы для доставки в клетки бифидобактерий генетических конструкций, обеспечивающих продукцию в них гетерологичных белков с полезными свойствами, в том числе цитокинов (FGF-2, ИЛ-10) и ферментов (ос-амилаза);
-
Генетически-трансформированпые штаммы бифидобактерий, полученные с использованием описанных челночных векторов, могут стать основой для создания принципиально нового поколения пробиотических и биотерапевтических агентов.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе 8 статей в рецензируемых научных журналах (5 в отечественных и 3 в зарубежных).
Объем и структура диссертации
