Содержание к диссертации
Глава 1. КИШЕЧНЫЕ ЗООАНТРОПОНОЗЫ: КАМПИЛОБАКТЕРИОЗ И ЛИСТЕРИОЗ -СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ (обзор литературы)1.1. Кампилобактериоз и кампилобактерий
1.2. Листериоз и листерий
1.3. Экология кампилобактерий и листерий и пути их передачи
1.4. Современное состояние лабораторной диагностики листериоза и кампилобактериоза и её особен-н о сти
1.5. Заболеваемость острыми кишечными инфекциями и листериозом на территории Ставропольского края
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Штаммы микроорганизмов, использованные в опытах
2.2. Питательные среды
2.3. Химические реактивы, использованные в опытах
2.4. Аппаратное оснащение исследований
2.5. Объекты исследований
2.6. Лабораторные животные, использованные в экспериментах
2.7. Методы контроля антигенов и сывороток
2.8. Выделение иммуноглобулинов
2.9. Получение и контроль иммунофлуоресцирующих конъюгатов
2.10. Получение и контроль иммуноферментных конъюгатов
2.11. Физико-химические методы
2.12. Лиофилизация биологического материала
2.13. Характеристика реагентов, используемых для получения магноиммуносорбентов
2.14. Методы математической и статистической обработки материалов
Глава 3. РАЗРАБОТКА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ КАМПИЛОБАКТЕРИОЗА ИЛИСТЕРИОЗА
Глава 4. 4.1. 4.2. 4.3. РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИСТЕРИОЗНЫХ И КАМПИЛОБАКТЕРИОЗНЫХ ДИАГНОСТИКУМОВ ДЛЯ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИИ (РА) И РЕАКЦИИ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РИГА) Получение диагностических поливалентных агглютинирующих сывороток Получение диапюстикумов полигрупповых цветных листериозного и кампилобактериозного для реакции агглютинации Разработка биотехнологии приготовления эрит-роцитарных листериозного и кампилобактериозного диагностикумов
Глава 5. КОНСТРУИРОВАНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ЛИСТЕРИОЗНЫХ И КАМПИЛОБАКТЕРИОЗНЫХ ПОЛИГРУППОВЫХ ИММУ-НОГЛОБУЛИНОВЫХ КОНЪЮГАТОВ
5.1. Получение гипериммунных сывороток и специфических иммуноглобулинов
5.2. Получение диагностических флуоресцирующих иммуноглобулинов
5.3. Получение диагностических иммуноглобулинов для иммуноферментного анализа
Глава 6. РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМ МАГНОИМ-МУНОСОРБЕНТНЫХ ДЛЯ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ КАМПИЛОБАКТЕРИОЗА И ЛИСТЕРИОЗА В ИММУНОФЕРМЕНТ-НОМ АНАЛИЗЕ И КОЛИЧЕСТВЕННОЙ РЕАКЦИИ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ
6.1. Разработка биотехнологии кампилобактериозных и листериозных магноиммуносорбентов
6.2. Конструирование магноиммуносорбентных тест-систем для ИФА
6.3. Разработка метода селективного концентрирования возбудителей кампилобактериоза и листерио-за на магноиммуносорбенте с последующей постановкой количественного иммунофлуоресцент-ного анализа (КИФА)
Глава 7. СТАБИЛИЗАЦИЯ СВОЙСТВ БИОЛОГИЧЕСКОГО СЫРЬЯ И ИММУНОГЛОБУЛИНО-ВЫХ ПРЕПАРАТОВ. РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА СЫРЬЯ И ГОТОВОЙ ПРОДУКЦИИ. ИЗУЧЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЦЕННОСТИ МИБП
7.1. Сублимация «.иммунобиологических препаратов и биологического сырья для их производства
7.2. Разработка системы контроля качества сырья и готовой продукции при производстве МИБП
7.3. Изучение диагностической ценности сконструированных МИБП '
Введение к работе
Актуальность проблемы. Структура инфекционной патологии человека за последние десятилетия претерпела существенные изменения, обусловленные как открытием целого ряда неизвестных ранее инфекционных агентов (возбудители ВИЧ-инфекции; гепатитов В, С и Д; геморрагических и арбовирусных лихорадок; легионеллеза и т.д.), так и изменением роли и удельного веса хорошо известных возбудителей. Ко второй группе наряду с возбудителями туберкулеза, условно патогенными бактериями широкого спектра, вызывающими гнойно-септические заболевания и пневмонии, в полной мере можно отнести кампилобактерии и листерии (Тартаковский И.С., Малеев В.В., Ермолаева А., 2002; Покровский В.И. и др., 2004). Хотя упомянутые микроорганизмы давно известны, в последние годы заметно расширился удельный вес вызываемых ими инфекций, равно как и спектр их клинических проявлений.
Кампилобактериоз (вибриоз) — инфекционная болезнь животных и человека, вызываемая патогенными микроорганизмами рода Campylobacter, которые интенсивно циркулируют во внешней среде (вода, домашние и дикие животные). Анализ данных литературы показывает, что кампилобактериоз довольно широко распространен на всех континентах и во многих странах мира. Вследствие довольно широкого географического распространения, циркуляции среди животных и людей, у которых, это заболевание протекает, чаще всего как ток-сикоинфекция, кампилобактериоз приобретает существенное социально-экономическое значение.
Листериоз относится к числу природно-очаговых инфекций. Возбудителем листериоза является грамположительная аспорогенная бактерия Listeria monocytogenes. Листериоз у людей проявляется спорадически, но также описаны многочисленные вспышки пищевого листериоза и внутрибольничные заболевания в родильных домах. Заражение в основном происходит при употреблении в пищу инфицированных продуктов животного и растительного происхождения.
Внимание к листериозу возросло после расшифровки в конце 80-х годов прошлого столетия вспышек пищевого листериоза у людей с летальностью до 33 % в США, Канаде, Мексике, Швейцарии, Великобритании, то есть в странах с традиционно высоким уровнем здравоохранения и технологий приготовления продуктов питания.
Анализ состояния лабораторной диагностики как кампилобактериоза, так и листериоза позволяет предположить, что зарегистрированный уровень заболеваемости представляет лишь «вершину айсберга» и при совершенствовании организационных и методических вопросов лабораторной диагностики число зарегистрированных больных может значительно возрасти.
Ранняя лабораторная диагностика, т.е. своевременное выявление источника инфекции занимают основное место в системе противоинфекционных мероприятий. Современная микробиология характеризуется развитием диагностических технологий, основанных на глубоких фундаментальных знаниях биологии микроорганизмов и передовых инженерно-технических решениях задач автоматизации и повышения эффективности анализа (Онищенко Г.Г. с соавт., 2003).
В связи с этим возникает необходимость в совершенствовании имеющихся иммунобиологических методов, создании новых экспресс-методов диагностики и индикации, направленных на сокращение времени проведения анализа, его упрощение при одновременном увеличении надежности и легкости интерпретации полученных результатов при высокой чувствительности и специфичности.
Цель исследования: научная разработка экспресс-методов лабораторной диагностики возбудителей кампилобактериоза, листериоза и создание технологии производства медицинских иммунобиологических диагностических препаратов.
Основные задачи исследования: 1. Разработать транспортную, селективные и накопительные питательные среды для возбудителей кампилобактериоза и листериоза.
2. Подобрать эффективный метод извлечения специфических антигенов белковой природы из микробных масс возбудителей кампилобактериоза и лис-териоза для использования их при конструировании медицинских иммунобиологических препаратов.
3. Разработать производственные схемы получения иммунных сывороток с высокими титрами агглютининов и преципитинов и провести сравнительную оценку методов выделения из них иммуноглобулинов для дальнейшего их применения в качестве биологического сырья при производстве иммунобиологических препаратов.
4. Определить оптимальные параметры биотехнологии производства иммуноферментных и иммунофлуоресцентных кампилобактериозных и листери-озных иммуноглобулиновых конъюгатов.
5. Разработать биотехнологию аффинных сорбентов с магнитными свойствами и на их основе создать тест-системы магноиммуносорбентные, а также методики их применения в экспресс-методах лабораторного анализа.
6. Определить параметры единого режима сублимации биополимеров (биологического сырья и МИБП) с целью сохранения их исходных свойств.
7. Оценить эффективность применения разработанных диагностикумов на экспериментальном, клиническом и полевом материале.
Научная новизна работы. Унифицирована питательная основа для транспортной, селективных, накопительных питательных сред, которые позволяют успешно выделять Campylobacter jejuni и Listeria monocytogenes от людей, животных, из пищевых продуктов, объектов внешней среды.
Подобраны эффективные методы, дающие возможность получения нативных специфических водорастворимых антигенных комплексов белковой природы из биомассы кампилобактерий и листерий.
Разработаны новые, высокоэффективные схемы иммунизации кроликов для получения специфических агглютинирующих и гипериммунных сывороток с высокими титрами.
Впервые осуществлена научно-методическая разработка биотехнологии производства кампилобактериозных и листериозных микрогранулированных органокремнеземных иммуносорбентов с магнитными свойствами, обладающих высокой сорбционной емкостью, стабильностью, чувствительностью, специфичностью.
Впервые сконструированы кампилобактериозные и листериозные магноиммуносорбентные тест-системы для иммуноферментного (ИФА) и количественного иммунофлуоресцентного (КИФА) анализов, позволяющие исследовать пробы из внешней среды с высокой степенью загрязнения неограниченного объема, низкой концентрацией патогена, с чувствительностью, в 1000 и более раз превышающей традиционные.
Материалы выполненных исследований легли в основу двух патентов РФ на изобретение № 2135210 от 27.08.1999 г. «Способ получения диагностической сыворотки»; № 2290641 от 27.12.2006 г. «Способ проведения иммуноферментного анализа (ИФА)». • Практическая значимость работы. • Разработаны накопительные питательные среды с соответствующими добавками для наращивания биомасс кампилобактерий и листерий.
Подобраны эффективные методы и приемы по извлечению антигенного материала, получению иммунных сывороток и выделению иммуноглобулинов.
Оптимизация параметров конъюгации лигандов и маркеров позволили унифицировать биотехнологию производства ряда МИБП для экспресс-диагностики кампилобактериоза и листериоза, индикации их возбудителей (эритроцитарные, иммуноферментные, иммунофлуоресцентные), стабильно отвечающие общим медико-биологическим требованиям (ОМБТ), предъявляемым к индикационным препаратам.
Разработан единый ускоренный экономичный режим стабилизации биологического сырья и МИБП методом сублимации, позволяющий сохранять их исходные свойства длительное время.
Таким образом, создан алгоритм технологического процесса получения диагностических препаратов для индикации и идентификации возбудителей кампилобактериоза и листериоза, включающий в себя все этапы производства: от накопления биомассы на питательной среде до стабилизации полученных диагностических препаратов методом сублимационной сушки.
Внедрение результатов в практику.
Методики применения разработанных кампилобактериозных и листериозных МИБП изложены в «Методических рекомендациях по лабораторной диагностике листериоза у людей»; «Методических рекомендациях по лабораторной диагностике кампилобактериоза у людей»; «Методических рекомендациях «Магноиммуносорбенты в микробиологических и клинических исследованиях».
На диагностикумы листериозные эритроцитарные, флуоресцирующие, магноимму носорбентные кампилобактериозные и листериозные для ИФА и КИФА составлена первичная нормативная документация (регламенты производства, фармакопейные статьи предприятия, инструкции по применению), прошедшая экспертизу в ОБТК СтавНИПЧИ, одобренная Ученым советом (протоколы № 2 от 28.02.2002 г.; №6 от 26.06.2003 г.; № 2 от 28.02.2007 г.) и утвержденная директором института.
Материалы диссертации используются в лекциях и практических занятиях на курсах первичной специализации и повышения квалификации врачей по особо опасным инфекциям при СтавНИПЧИ, семинарах для практических врачей и научных работников МЗ РФ по экспресс-диагностике инфекционных заболеваний и применению магноиммуносорбентных препаратов в мониторинге инфекционных агентов.
Основные положения, выносимые на защиту 1. Предложены научно-методические подходы к получению питательных сред и биологического сырья (антигенов и антител) для производства кампилобактериозных и листериозных МИБП, которые дают возможность повысить их качество.
2. Разработаны методические приемы конструирования эритроцитарных, иммуноферментных, иммунофлуоресцентных диагностикумов, обеспечивающие высокую эффективность обнаружения антигенов кампилобактерий и листерий и антител к ним.
3. Создана биотехнология изготовления кампилобактериозных и листериозных твердофазных микрогранулированных композиционных аффинных органоминеральных магноиммуносорбентов; тест-системы магноиммуносор-бентные для экспрессных методов иммуноанализа (ИФА, КИФА) позволяют максимально концентрировать патоген в исследуемом материале, что дает возможность повысить разрешающуюся способность экспересс-методов.
4. Результаты практического применения разработанных кампилобактериозных и листериозных МИБП, демонстрирующие повышение эффективности лабораторных исследований клинического и полевого материала.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на научной конференции «Проблемы биологии и химии на Северном Кавказе», посвященной 70-летию биолого-химического факультета СГУ (Ставрополь, 2001); научной конференции Ставропольской медицинской академии (Ставрополь, 2002); 11-ой итоговой межвузовской конференции студентов и молодых ученых (Ставрополь, 2003); международной научно-практической конференции «Биоресурсы, биотехнологии, инновации Юга России», 21-24 октября 2003 г. (Ставрополь-Пятигорск); научно-практической конференции «Опыт работы учреждений Роспотребнадзора в Ставропольском крае по обеспечению санэпидблагополучия и защите прав потребителей (Ставрополь, 2005); на Проблемной комиссии Научного Совета по санитарно-эпидемиологической охране территории России (Ростов-на-Дону, 2006); II съезде военных врачей медико-профилактического профиля Вооруженных Сил Российской Федерации на базе Военно-медицинской академии им. М. Кирова 15-17 ноября 2006 г. (Санкт-Петербург).
Основное содержание диссертации, выполненной в рамках 3 НИР, отражено в опубликованных работах -38 (в ведущих научных журналах, рекомендуемых ВАК — 9 статей, депонированных — 8, 2 патентах РФ на изобретение, в материалах Международных, Всероссийских научных конференций - 19 публикаций), а также в 3 методических рекомендациях и 4 нормативных документах (регламентах производства, фармакопейных статьях предприятия).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы, приложений.
Она изложена на 245 страницах, содержит 24 таблицы и 28 рисунков.
Список литературы включает 295 отечественных и 196 зарубежных литературных источников.
![Конструирование и внедрение в практику генодиагностической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы [Электронный ресурс]](/i/i/4289/212277.png "Конструирование и внедрение в практику генодиагностической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы [Электронный ресурс] Тучков Игорь Витальевич")
