Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 15
1.1. Эпидемиологическая ситуация по сибирской язве в мире и на территории Российской Федерации 15
1.2. Современное представление о патогенности возбудителя сибирской язвы... 26
1.3. Современные диагностические препараты, используемые для индикации и идентификации возбудителя сибирской язвы... 31
Собственные исследования 44
Глава 2. Материалы и методы исследования 44
Глава 3. Изучение специфической активности и специфичности иммуноглобулинов флуоресцирующих сибиреязвенных вегетативных адсорбированных 55
3.1. Оценка специфической активности иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных вегетативных адсорбированных 56
3.2. Определение специфичности иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных вегетативных 63
Глава 4. Определение диагностической ценности (специфическая активность, специфичность) иммуноглобулинов флуоресцирующих сибиреязвенных споровых адсорбированных 72
4.1. Определение специфической активности иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных споровых 73
4.2. Изучение специфичности иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных споровых адсорбированных сухих 80
Глава 5. Определение диагностической ценности сибиреязвенного бактериофага гамма а -26 88
5.1. Изучение диапазона литической активности сибире бактериофага Гамма А-26
5.2. Оценка специфичности сибиреязвенного бактериофага Гамма А- 26
Заключение
Выводы
Список литературы
- Современное представление о патогенности возбудителя сибирской язвы...
- Определение специфичности иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных вегетативных
- Изучение специфичности иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных споровых адсорбированных сухих
- Оценка специфичности сибиреязвенного бактериофага Гамма А-
Введение к работе
Актуальность исследования. Сибирская язва относится к особо опасным инфекциям с острым началом, тяжелым течением и высокой летальностью, которая при несвоевременном лечении, может достигать 90 % (Макаров В.В. и др., 2012; Маринин Л.И. и др., 2008, Swartz M., 2001). Одной из главных причин эпидемического неблагополучия по сибирской язве является способность возбудителя образовывать во внешней среде устойчивые споры, годами сохраняющие свою жизнеспособность и патогенные свойства, что представляет собой опасность для людей и животных (Онищенко Г.Г. и др., 1999, 2009; Черкасский Б.Л., 2004; Ладный В.И. и др., 2009; Кологоров А.И. и др., 2010). Кроме этого, существует возможность завоза инфицированных животных, сырья и продуктов животного происхождения, контаминированных спорами возбудителя, из неблагополучных по сибирской язве стран (Еременко Е.И. и др., 2010).
За последние 5 лет заболеваемость сибирской язвой на территории Российской Федерации несколько стабилизировалась, однако все еще остается на высоком уровне. Эпидемическая ситуация по данному заболеванию на ближайшие годы прогнозируется как неблагополучная (Куличенко А.Н. и др., 2011; Онищенко Г.Г., 2010; Рязанова А.Г. и др., 2011). Учитывая вышеизложенное, своевременное выявление и идентификация возбудителя сибирской язвы, является актуальным.
В системе противоэпидемических мероприятий важное место отводится мониторингу за циркуляцией Bacillus anthracis. Диагностика сибирской язвы включают в себя обнаружение возбудителя в исследуемом материале, выделение и идентификацию культуры. Основными методами индикации сибирской язвы являются метод флуоресцирующих антител (МФА) с помощью флуоресцирующих иммуноглобулинов и ПЦР, а также экспресс-методы (ИФА, РНГА).
Из современных наиболее доступных и надежных сигнальных методов серологической диагностики является МФА в реакции иммунофлуоресценции (РИФ) (Куличенко А.Н. и др., 2010; Саяпина Л.В. и др., 2010). Положительные результаты, полученные в ходе проведения МФА, позволяют сделать предварительный вывод о наличии возбудителя сибирской язвы в исследуемом материале и своевременно начать проведение противоэпидемических и профилактических мероприятий.
Несмотря на совершенствование лабораторной диагностики сибирской
язвы, использование традиционных методов идентификации возбудителя, не утратили своего значения. Важная роль при идентификации типичных и атипичных штаммов Bacillus anthracis, отводится определению их чувствительности к бактериофагам (Рязанова А.Г. и др. 2009; Головинская Т.М. и др., 2011). Одним из направлений улучшения лабораторной диагностики сибирской язвы является использование зарегистрированных препаратов (Порядок организации и проведения лабораторной диагностики сибирской язвы для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней» МУК 4.2.2941-11).
Специалистами Ставропольского научно-исследовательского
противочумного института (Ставропольский НИПЧИ) предложены
иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие вегетативные и споровые адсорбированные и бактериофаг Гамма А-26, предназначенные для обнаружения и идентификации возбудителя сибирской язвы в объектах окружающей среды и биологическом материале.
В связи с этим, исследования по изучению диагностической ценности сибиреязвенных препаратов, предназначенных для выявления и идентификации возбудителя сибирской язвы, являются актуальными.
Цель исследования – изучить диагностическую ценность
сибиреязвенных иммуноглобулинов флуоресцирующих (вегетативные и споровые) адсорбированных и бактериофага Гамма А-26 на этапах индикации и идентификации возбудителя сибирской язвы.
Задачи исследования:
1. Оценить специфическую активность и специфичность
иммуноглобулинов флуоресцирующих сибиреязвенных вегетативных
адсорбированных в РИФ по сравнению с бактериологическим методом (тест на
гемолиз).
2. Охарактеризовать диагностическую ценность (специфическая
активность и специфичность) иммуноглобулинов флуоресцирующих
сибиреязвенных споровых адсорбированных на чистых культурах, в пробах из
объектов окружающей среды и биологического материала.
3. В сравнительных испытаниях определить широту диапазона
литической активности и специфичности бактериофагов диагностических
сибиреязвенных Гамма А-26 и Fah ВНИИВВиМ.
4. Обосновать возможность использования сибиреязвенных препаратов
иммуноглобулинов флуоресцирующих (вегетативные и споровые)
адсорбированных и бактериофага Гамма А-26 для индикации и идентификации возбудителя сибирской язвы в лабораторной диагностике.
Научная новизна
Впервые установлена высокая специфическая активность
иммуноглобулинов сибиреязвенных вегетативных адсорбированных при
исследовании мазков из чистых культур, проб из объектов окружающей среды
и биологического материала (мясо животного), контаминированных
B. anthracis. Показано, что иммуноглобулины в разведении 1:64 обеспечивают специфическое свечение 93,8±6,0 % из 16 исследуемых штаммов B. anthracis в вегетативной форме.
Впервые на представительном материале (объекты окружающей среды, биологический материал, чистые культуры) установлена диагностическая ценность иммуноглобулинов флуоресцирующих сибиреязвенных споровых адсорбированных, обеспечивающих в разведении 1:64 специфическое свечение сибиреязвенного микроба в споровой форме в мазках чистых культур, проб из объектов окружающей среды (смывы, корма, вода, почва) и биологического материала и не вызывающих специфического свечения со штаммами близкородственных микроорганизмов.
Доказано преимущество проведения РИФ с помощью иммуноглобулинов флуоресцирующих сибиреязвенных вегетативных и споровых адсорбированных перед бактериологическим методом (тест на гемолиз) при исследовании проб объектов окружающей среды и биологического материала по времени учета результатов – 2,5-3 ч против 40 ч соответственно.
Новыми являются данные сравнительных исследований бактериофагов
сибиреязвенных Гамма А-26 и Fah ВНИИВВиМ (ветеринарного).
Испытываемый бактериофаг Гамма А-26 обладает широким диапазоном
действия к исследуемым штаммам B. anthracis и высокой специфичностью в
отношении близкородственных микроорганизмов. Установлено, что
сибиреязвенный бактериофаг Гамма А-26 лизировал 97,9±2,1 % типичных и атипичных штаммов B. anthracis из 47 исследуемых и не лизировал 95,8±2,36 % из 72 штаммов близкородственных микроорганизмов.
Обоснована целесообразность применения в практическом
здравоохранении изучаемых иммуноглобулинов сибиреязвенных вегетативных и споровых адсорбированных, а также бактериофага сибиреязвенного
Гамма А-26, предназначенных для индикации и идентификации возбудителя сибирской язвы.
Практическая значимость работы
В результате работы внедрены в практику следующие препараты:
Иммуноглобулины флуоресцирующие сибиреязвенные вегетативные адсорбированные сухие (Регистрационное удостоверение № ФСР 2011/11338);
Иммуноглобулины флуоресцирующие сибиреязвенные споровые
адсорбированные сухие (Регистрационное удостоверение
№ ФСР 2011/11339);
Бактериофаг сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий (Регистрационное удостоверение № ФСР 2011/10415).
Внесены изменения в нормативную документацию:
Технические условия (ТУ) 9389-003-01897080-2010 и инструкцию по применению на иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие сибиреязвенные вегетативные адсорбированные сухие (Акт внедрения рекомендаций, утвержденный директором ФКУЗ Ставропольского НИПЧИ);
Технические условия 9389-005-01897080-2010 и инструкцию по
применению на иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие
сибиреязвенные споровые адсорбированные сухие (Акт внедрения
рекомендаций, утвержденный директором ФКУЗ Ставропольского НИПЧИ);
Технические условия 9389-013-01897080-2009 и инструкцию по применению на бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий (Акт внедрения рекомендаций, утвержденный директором ФКУЗ Ставропольского НИПЧИ).
Материалы диссертации используются при чтении лекций на курсах повышения квалификации специалистов по особо опасным инфекциям.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Испытываемые иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие
сибиреязвенные вегетативные адсорбированные в разведении 1:64
обеспечивают специфическое свечение 93,8±6,0 % штаммов B. anthracis в
вегетативной форме, что позволяет их использовать для индикации при
исследовании чистых культур, объектов окружающей среды и биологического
материала в лабораторной диагностике сибирской язвы.
2. Диагностический препарат иммуноглобулины флуоресцирующие
сибиреязвенные споровые адсорбированные в разведении 1:64 выявляет
93,8±6,0 % исследуемых штаммов B. anthracis и в 96,9±3,1 % случаев не реагирует со штаммами близкородственных микроорганизмов; в пробах из объектов внешней среды и биологического материала сибиреязвенный микроб обнаруживается в 100 % случаев.
3. Использование иммуноглобулинов сибиреязвенных вегетативных и
споровых адсорбированных в РИФ имеет явное преимущество перед
бактериологическим методом (тест на гемолиз) при исследовании проб
объектов окружающей среды и биологического материала по времени
постановки и учету результатов – 2,5-3 ч против 40 ч.
4. Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 обладает
широким диапазоном литической активности и специфичностью, что
подтверждено наличием лизиса 97,9±2,1 % штаммов B. anthracis из 47
исследуемых и ее отсутствием в 95,8±2,36 % случаев при исследовании 72
штаммов близкородственных микроорганизмов. При учете результатов
установлено, что бактериофаг сибиреязвенный Гамма А-26 превосходит
препарат сравнения по четкости лизиса исследуемых штаммов B. anthracis.
Работа выполнена на базах лаборатории препаратов против чумы и др.
особо опасных инфекций ГИСК им Л.А. Тарасевича, Государственной
коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб», Иркутского НИПЧИ,
Государственного научного центра прикладной микробиологии и
биотехнологии (п. Оболенск), бактериологической лаборатории ФГКУ 294 ЦСООР МЧС РФ.
Апробация материалов диссертации
Материалы диссертации нашли отражение на Всероссийских и
межгосударственных научно-практических конференциях: научно-
практической конференции «Итоги и перспективы фундаментальных и
прикладных исследований в РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов, 2009); XI
Межгосударственной научно-практической конференции «Современные
технологии в совершенствовании мер предупреждения и ответных действий на чрезвычайные ситуации в области общественного здравоохранения санитарно-эпидемиологического характера» (Саратов, 2012); на 2 научно-практической конференции молодых ученых «Научные подходы к повышению качества экспертизы лекарственных средств: реалии и перспективы» в ФГБУ «НЦЭСМП Минздрава России» (Москва, 2013 г.).
Материалы диссертации вошли в отчеты по законченным техническим и медицинским испытаниям сибиреязвенных препаратов за период 2007 - 2010 гг.
Результаты исследований были использованы при составлении 3
нормативных документов: Технические условия 9389-003-01897080-2010 и
инструкция по применению на Иммуноглобулины диагностические
флуоресцирующие сибиреязвенные вегетативные адсорбированные сухие;
Технические условия 9389-005-01897080-2010 и инструкция по применению на Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие сибиреязвенные споровые адсорбированные сухие;
Технические условия 9389-013-01897080-2009 и инструкция по применению на Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий.
Публикации
По теме диссертации опубликованы 4 статьи, 3 из них в изданиях, рекомендованных ВАК Российской Федерации.
Личный вклад автора
Обоснование проблемы, постановка цели и задачи работы, выбор методов
исследования, выполнение экспериментальной и аналитической части работы,
обобщение и интерпретация полученных данных, подготовка научных
публикаций. Соискателем проведен анализ полученных данных,
сформулированы основные положения диссертации, составляющие ее новизну и практическую значимость.
Структура и объем диссертации
Работа изложена на 135 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 3 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литеоатуры. Диссертация иллюстрирована 14 таблицами и 7 рисунками. Библиографический указатель включает 168 источников литературы, в том числе 117 отечественных и 51 зарубежных авторов.
Современное представление о патогенности возбудителя сибирской язвы...
Сибирская язва - острое инфекционное заболевание животных и человека, относящееся к группе особо опасных инфекций. Впервые проявившись в какой-либо регионе, она может сохранять на многие года угрозу повторного развития, способствуя этим развитию и существованию эпизоотической цепи [51, 109, 131]. Сибирская язва относится к природно-очаговым сапрозоонозам со своеобразным инфекционным циклом, который предполагает обязательный внеорганизменный этап споруляции возбудителя [4, 59, 130, 156].
Согласно сведениям Dixon Т. [126], на протяжении многих веков, болезнь регистрировалась не менее, чем в 200 странах мира, заболеваемость людей составила 20-100 тысяч случаев в год. По данным ВОЗ, ежегодно на земном шаре гибнут около 1 млн. животных и заболевают около 1 тысячи людей с нередким летальным исходом. Из общего числа людей, заболевших сибирской язвой, 21,9 % зарегистрированы в Европе; 25,1 % - в Африке; 42,8 % - в Азии и 10,1 % - в Америке [4, 118, 120, 131].
Суммарно регистрируемая ежегодно заболеваемость животных и людей на уровне 900-1000 случаев выявляется в десятках стран не только слаборазвитого афро-азиатского региона, но и на территориях Европы, Америки, Австралии, в наиболее развитых странах - США, Канаде, Франции, Финляндии [61, 122, 139, 165].
В эпизоотический процесс, наряду с крупным рогатым скотом (КРС) и мелким рогатым скотом (МРС), вовлекаются и подвержены гибели травоядные животные многочисленных видов, в том числе и хищники, так или иначе контактирующие с почвой как основным резервуаром и источником инфекции [7, 55, 132, 154]. Среднегодовая глобальная инцидентность варьирует в пределах 250-300 вспышек и более со стереотипными индексами очаговости от десятков до единиц в зависимости от групповой специфики поражаемых животных, что отражает также их биосистемную роль в сибиреязвенном инфекционном цикле [40, 41, 64, 65].
Исключения, выпадающие из общестатистических характеристик, представляют уникальные эпизоотические прецеденты вспышечного характера, сопровождающиеся гибелью многих десятков домашних и сотен диких животных, регулярно возникающие в определенных регионах мира [133]. Многочисленными примерами последних лет могут служить внезапная гибель гиппопотамов, зебр (Уганда, Намибия, Кения) антилоп, коров (Зимбабве), слонов (Ботсвана), газелей (Монголия, Китай), лошадей (Новый Уэльс, Австралия), буйволов и бизонов (Южная Дакота, штат Монтана, США, Канада) и др. [87, 119, 121, 133, 140, 153, 161, 162].
Такое широкое распространение сибирской язвы в мире свидетельствует о существовании и сохранении на Земле уникальных гиперэндемичных природно-территориальных локусов, что может быть обусловлено наличием там специфической совокупности условий, наиболее благоприятных для сибиреязвенной биосистемы [111, 129, 165].
Принципиально важно, что спонтанная заболеваемость человека облигатно зоогенна и вторична по отношению к сибирской язве животных [169]. Поэтому эпидемическая цепь «контаминированная почва как резервуар и источник заражения животных — больное животное или его продукты как амплификатор — заражение человека» обусловливает аналогичную по своей природе и совпадающую территориально эндемичность глобального характера [14, 63, 66, ПО].
Человек относительно резистентен к естественной сибиреязвенной инфекции. Тем не менее, в 2005-2013 г.г. ежегодно регистрировалось более 100 спонтанных вспышек болезни с заражением людей и усредненными индексами очаговости и смертности 3-5 и 0.5-1.0, соответственно, со средней летальностью 25 % [39, 88]. На общем фоне особенно неблагополучны такие регионы, как Индонезия, Индия, Казахстан, Киргизия, Монголия, Вьетнам, Россия (Бурятия и Башкирия), где регистрируются сотни контактировавших (общение с больными животными, убой, разделка туш, потребление контаминированного мяса), десятки заболевших кожной и кишечной формой, высокая летальность [8, 29, 49, 58, 120, 131, 157].
Согласно многолетней мировой эпидемиологической статистике на каждые 10 заболеваний сибирской язвой животных регистрируется 1 кожная форма сибирской язвы у человека, на каждые 150 кожных форм -1 генерализованная форма [17, 66, 129, 134]. В общей структуре заболеваемости сибирской язвы 1-2 % составляют заболевания среди людей [14, 22].
Территории гибели или места организации скотомогильников павших от сибирской язвы животных, за более чем столетний период изучения данной болезни, представляют собой почвенные очаги сибирской язвы, которые весьма медленно санируются в естественных условиях благодаря антагонизму микроорганизмов, бактерицидному действию ризосферы отдельных видов растений и инсоляции [23, 94].
Установлено, что возникновение чрезвычайных эпизоотических и эпидемических прецедентов в зонах с использованием выпасов животных на зараженных территориях экстраполируется на рост заболеваемости по цепи «животное-человек» [41, 95, 134, 166].
Сибирская язва на современном этапе причисляется к индигенным инфекциям, т.е. постоянно встречается на территории, но не имеет массового характера [4, 76]. Экологические особенности инфекционного цикла, в основном, определяемые случайными событиями, обуславливают спорадичность проявления эпизоотического процесса [7, 18, 52, 162].
Определение специфичности иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных вегетативных
Изучение иммуноглобулинов сибиреязвенных вегетативных проводилось по разработанной нами Программе исследования по следующим показателям: физико-химическим свойствам; определению рабочего разведения (наибольшее разведение препарата, при котором возможно обнаружение возбудителя); чувствительности (способность препарата в рабочем разведении выявлять в исследуемых пробах чистых культур минимальные концентрации В. anthracis); специфической активности (процент выявления штаммов В. anthracis положительных проб объектов окружающей среды и биологического материала к числу контаминированных В. anthracis); специфичности (процент отрицательных результатов при исследовании проб, контаминированных близкородственными микроорганизмами); воспроизводимости (процент совпадений результатов исследования положительных и отрицательных проб); продолжительности анализа (в часах).
При оценке внешнего вида иммуноглобулинов в ампуле установлено, что они представляли собой аморфную пористую массу желто-оранжевого цвета, при растворении имели вид прозрачной опалесцирующей жидкости желто-оранжевого цвета. По физико-химическим свойствам препарат соответствовал требованиям проекта нормативной документации рН 7,6 (норма 7,5-8,5).
С целью изучения специфической активности иммуноглобулинов сибиреязвенных вегетативных адсорбированных использовались чистые культуры В. anthracis. Всего исследовано 47 штаммов чистых культур микроорганизмов. Все штаммы были типичными по культурально-морфологическим, биохимическим свойствам и имели отличия по генетическим свойствам. Исследуемые штаммы прошли независимую процедуру шифрования сотрудниками, не принимающими участия в приготовлении мазков и учете результатов. Результаты оценивали с помощью люминесцентной микроскопии по четырех крестовой схеме. Специфическим считали свечение с яркостью на 4 или 3 креста, свечение с яркостью 2 или 1 крест считали неспецифическим.
Определение специфической активности иммуноглобулинов сибиреязвенных вегетативных адсорбированных в разведениях от 1:8 до 1:256 проводилось в РИФ с использованием 16 различных штаммов В. anthracis. Нами проведен анализ полученных результатов исследования штаммов В. anthracis с помощью иммуноглобулинов в ходе постановки РИФ (табл. 3.1).
Результаты проведенных исследований позволили выявить высокую специфическую активность испытываемого препарата. Как видно из представленных данных, специфическая активность с уменьшением разведения иммуноглобулинов флуоресцирующих сибиреязвенных вегетативных существенно не изменились. Так, из 16 штаммов В. anthracis, взятых в исследование, все штаммы были выявлены в разведении препарата 1:8. С применением испытуемого препарата в разведениях 1:16, 1:32 и 1:64 специфическое свечение на 3-4 креста наблюдалось у 15 штаммов В. anthracis. Результаты проведенных исследований позволили выявить высокую специфическую активность исследуемого препарата. Как видно из представленных данных, специфическая активность с уменьшением разведения иммуноглобулинов флуоресцирующих сибиреязвенных вегетативных существенно не изменились. Так, из 16 штаммов В. anthracis, взятых в исследование, все штаммы были выявлены в разведении препарата 1:8. С применением испытуемого препарата в разведениях 1:16, 1:32 и 1:64 специфическое свечение на 3-4 креста наблюдалось у 15 штаммов В. anthracis.
Анализируя полученные результаты необходимо отметить, что с увеличением разведения степень специфической активности иммуноглобулинов снижалась. Обнаружено, что с применением испытуемого препарата в разведении 1:128 специфическое свечение на 3-4 креста наблюдалось у 10 штаммов В. anthracis, что составило 62,5±12,1 %. С увеличением разведения иммуноглобулинов до 1:256 специфическое свечение наблюдалось только с 3 штаммами В. anthracis.
Показано, что из 16 исследованных штаммов В. anthracis 15 штаммов были выявлены иммуноглобулинами сибиреязвенными вегетативными в разведении 1:64, что подтверждается яркостью свечения на 3 или 4 креста.
Учитывая вышеизложенное за рабочее разведение опытных иммуноглобулинов было принято разведение 1:64, о чем свидетельствовало яркое зеленовато-желтое свечение интенсивностью на 3-4 креста у 93,8±6,0 % исследованных штаммов В. anthracis. Установленное рабочее разведение 1:64 соответствует требованиям проекта нормативной документации, в соответствии с которыми препарат в рабочем разведении не менее 1:16 должен вызывать специфическое свечение вегетативной формы о сибиреязвенного микроба в концентрации 1,0x10 м.к./мл с интенсивностью на 3-4 креста.
Изучение специфичности иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных споровых адсорбированных сухих
Проведенные исследования позволили установить достаточно высокую информативность нового препарата. Вместе с тем следует отметить, что фаголизабельность не является строго специфичным видовым признаком, так как возбудитель сибирской язвы входит в группу близкородственных бацилл и имеет ряд общих свойств с другими ее представителями. В связи с этим выделяемые штаммы, не лизирующиеся сибиреязвенным бактериофагом, но по некоторым признакам соответствующие сибиреязвенному микробу, требуют дополнительных исследований. У всех выделенных культур, подозрительных на принадлежность к возбудителю сибирской язвы, должны определяться свойства, характеризующие их видовую принадлежность, а при необходимости, изучаться и дополнительные свойства.
Метод изучения чувствительности испытуемых штаммов к лизирующему действию сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26 является технически простым, информативным и легко воспроизводимым, что подтверждают проведенные эксперименты.
Полученные данные явились основанием для внесения изменений в нормативную документацию. В проект Технических условий внесены изменения в методику постановки пробы для определения литической активности и специфичности бактериофага. С этой целью для получения более четкого литического пятна рекомендовано растирать исследуемую культуру на агаровой пластинке диаметром до 1,5 см.
В Инструкцию по применению бактериофага Гамма А-26 внесено дополнение: «Ввиду наличия генетического родства сибиреязвенного микроба с другими представителями рода Bacillus, допускается лизис близкородственных штаммов не более, чем у 5 % от числа исследуемых». В связи с этим применение сибиреязвенного бактериофага должно использоваться в комплексе с другими методами идентификации микрооорганизмов рода Bacillus.
Таким образом, в результате проведенных нами исследований, показана возможность использования бактериофага Гамма А-26 для идентификации штаммов В. anthracis в вегетативной форме в лабораторной диагностике сибирской язвы. Исследование фаголизабельности культуры наряду с методами индикации (МФА, ПЦР) и другими идентификационными тестами (обнаружение капсулы in vitro, чувствительность к пенициллину и т.д.) позволит объективно и своевременно обнаружить возбудителя сибирской язвы.
Сибирская язва относится к особо опасным инфекциям со своеобразным инфекционным циклом, который предполагает обязательный внеорганизменный этап споруляции возбудителя [4, 131, 156].
Одной из главных причин неблагополучия по сибирской язве является способность возбудителя образовывать во внешней среде устойчивые споры, которые могут годами сохранять жизнеспособность и патогенные свойства, что обуславливает не только дальнейшее пребывание возбудителя в анабиотическом состоянии, но и, возможность, размножаться и накапливаться в почве [23, 85, ПО].
В последние годы, когда существенно возросли риски техногенных и природных катастроф (землетрясения, цунами, извержения вулканов, засуха, наводнение и т.п.), эпидемиологическая обстановка по сибирской язве прогнозируется как неблагополучная, поскольку высока вероятность вскрытия сибиреязвенных скотомогильников, что способствует осложнению эпидемической ситуации [37, 58, 60, 68]. Не исключена возможность попадания животных, сырья и продуктов животноводства, контаминированных спорами возбудителя сибирской язвы, на территорию Российской Федерации [78, 91, 109].
Учитывая вышеизложенное, вопрос своевременного выявления В. anthracis является весьма актуальным. При этом возникает острая необходимость в проведении лабораторной диагностики стандартными препаратами, предназначенными для обнаружения и идентификации возбудителя сибирской язвы в различных объектах окружающей среды и биологическом материале. Основными методами индикации возбудителя сибирской язвы, являются экспресс-методы (МФА, ПНР, ИФА, РНГА). Из современных методов серологической диагностики сибирской язвы наиболее быстрым и информативным методом является метод флуоресцирующих антител (МФА), обеспечивающий обнаружение возбудителя сибирской язвы на ранних этапах диагностики [10, 67, 80, 151]. Положительные результаты, полученные с помощью реакции иммунофлуоресценции, позволяют сделать предварительный вывод о наличии возбудителя сибирской язвы или его антигенов в исследуемом биологическом материале или объектах окружающей среды и своевременно начать проведение противоэпидемических, профилактических и терапевтических мероприятий.
Оценка специфичности сибиреязвенного бактериофага Гамма А-
Специфичность препарата также была высокой и составила 96,9±3,1 %. Воспроизводимость совпадения результатов при исследовании положительных и отрицательных проб при 10-кратном повторении разными исполнителями и в разные дни во всех случаях составила 100 %.
Проведенные сравнительные исследования выявили преимущество по срокам постановки РИФ с помощью иммуноглобулинов сибиреязвенных споровых адсорбированных перед методом сравнения (тест на гемолиз).
Продолжительность проведения исследований с помощью испытуемых иммуноглобулинов составила 20 ч при исследовании проб чистых культур и 2,5-3 ч при исследовании проб объектов окружающей среды и биологического материала; при исследовании проб с помощью теста на гемолиз - 20 ч при исследовании проб чистых культур и 40 ч при исследовании проб объектов окружающей среды и биологического материала. Как видно из полученных данных, временные затраты в РИФ значительно ниже, чем при проведении исследований бактериологическим методом, что особенно важно с целью оперативного обнаружения возбудителя сибирской язвы из объектов окружающей среды и биологического материала.
Результаты, полученные в процессе исследования диагностической ценности испытываемого препарата, показали возможность его применения для специфической индикации при исследовании материала из объектов окружающей среды и биологического материала, а также чистых культур.
На основании полученных данных были внесены предложения в проекты нормативной документации на иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные вегетативные и споровые адсорбированные, касающиеся уточнения названия (вместо иммуноглобулины соматические включили иммуноглобулины вегетативные) и назначения препарата. Внесены дополнения в методику обеззараживания мазков, что позволило проводить ее в соответствии с Санитарными правилами «Безопасность работы с микроорганизмами I и II групп патогенности (опасности)» (СП 1.3.1285-03).
В соответствии с требованиями МУ 4.2.2413-08 «Лабораторная диагностика для обнаружения сибирской язвы» и МУК 4.2.2941-11 «Порядок организации и проведения лабораторной диагностики сибирской язвы для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней» важным тестом, позволяющем идентифицировать штаммы В. anthracis, является лизабельность бактериофагом.
Известно, что существующие сибиреязвенные бактериофаги различаются по широте спектра лизируемых ими штаммов возбудителя сибирской язвы, а также по специфичности их действия. Изучение показателей фагочувствительности и фагорезистентности штаммов представляет интерес не только с точки зрения надежности теста лизабельности при идентификации сибиреязвенных культур, но и как основа метода выделения штаммов В. anthracis с разной чувствительностью к действию бактериофагов.
Проведенные сравнительные исследования позволили установить высокую информативность испытуемого препарата - бактериофага Гамма А-26, который лизировал штаммы В. anthracis в 97,9±2,1 % случаев из 47 исследованных. С помощью бактериофага сибиреязвенного Fah ВНИИВВиМ процент правильно идентифицированных чистых культур штаммов В. anthracis к числу исследованных составил 98,6±1,38 %. При анализе данных литической активности бактериофага Гамма А-26 установлено, что испытываемый бактериофаг лизировал 95,8±2,36 %, препарат сравнения -98,6±1,36 % штаммов В. anthracis.
При изучении воспроизводимости результатов с помощью бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 с использованием штаммов В. anthracis СТИ-1 (положительный результат) и В. cereus 16 (отрицательный результат) во всех случаях получены совпадающие результаты в 10 повторностях, что свидетельствует о стабильности препарата и хороших его эксплуатационных и качественных характеристиках.
Метод изучения чувствительности изучаемых штаммов к литическому действию сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26 является технически простым, информативным и легко воспроизводимым, что подтверждается проведенными исследованиями. Полученные данные свидетельствуют о широком диапазоне действия и высокой специфической активности бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 и подтверждают возможность его 109 использования при идентификации штаммов В. anthracis в лабораторной диагностике сибирской язвы.
К моменту проведения наших исследований в Российской Федерации только часть препаратов, необходимых для диагностики особо опасных инфекционных болезней, в том числе и сибирской язвы, была зарегистрирована в установленном порядке. В соответствии с приказом Роспотребнадзора № 88 от 17.03.08. «О мерах по совершенствованию мониторинга за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней» лаборатории территориального, регионального и федерального уровнях для проведения всех этапов индикации и идентификация возбудителя сибирской язвы будут обеспечены зарегистрированными препаратами.
Таким образом, проведенными исследованиями диагностической ценности иммуноглобулинов флуоресцирующих сибиреязвенных (вегетативные и споровые) адсорбированных, а также бактериофага сибиреязвенного Гамма, обоснована целесообразность их применения в лабораторной диагностике на этапах индикации и идентификации возбудителя сибирской язвы.
![Конструирование и внедрение в практику генодиагностической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы [Электронный ресурс]](/i/i/4289/212277.png "Конструирование и внедрение в практику генодиагностической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы [Электронный ресурс] Тучков Игорь Витальевич")
