Введение к работе
Актуальность темы
Уреаплазменная инфекция продолжает оставаться одной из актуальных проблем клинической микробиологии. Возбудители - Ureaplasma urealyticum и Ureaplasma parvum часто колонизируют урогенитальную систему человека. Обычно наблюдается бессимптомное носительство уреаплазм среди клинически здоровых лиц. Вместе с тем, уреаплазменная инфекция может сопровождаться развитием патологических процессов, в числе которых негонококковый уретрит, хориоамнионит, преждевременные роды, поражение дыхательной системы и ЦНС у преждевременно родившихся детей, артриты у лиц со сниженным иммунитетом и др. (Гамова Н.А., 1993; D. Taylor-Robinson, 1996; Раковская И.В., 1999; M. Abele-Horn et al., 2000; C. Skevaki, D.A. Kafetzis, 2003). В связи с этим, существует необходимость в объективном и достоверном выявлении Ureaplasma spp. в клиническом материале.
Лабораторные методы исследований играют решающую роль в диагностике уреаплазменной инфекции вследствие отсутствия четких клинических проявлений, широкого распространения бессимптомного носительства и частого сочетания уреаплазм с другими инфекционными агентами. Несмотря на широкое использование в настоящее время молекулярно-биологических методов диагностики уреаплазменной инфекции, микробиологический метод сохранил позиции наиболее достоверного и информативного метода, позволяющего с высокой чувствительностью и специфичностью выявлять бактерии рода Ureaplasma, определять их количество в исследуемом клиническом материале, а также чувствительность выделенных штаммов к антибактериальным препаратам (K.B. Waites et al., 2001; Дмитриев Г.А., 2003).
Культивирование уреаплазм, чрезвычайно требовательных к составу питательных сред, связано с рядом трудностей, в числе которых отсутствие сред определенного состава, сложность состава сред, необходимость максимального соответствия состава питательным потребностям бактерий рода Ureaplasma, а также необходимость оценки ростовых свойств сред и их отдельных компонентов (Раковская И.В., 1999; K.B. Waites et al., 2001).
В настоящее время отмечается тенденция перехода от классических микробиологических исследований к современным технологиям анализа; при этом большее значение придается оптимизации, стандартизации, а также упрощению и автоматизации метода. Весьма перспективным является использование микротест-систем, избавляющих практических микробиологов от трудоемких работ и позволяющих получить стандартные, воспроизводимые результаты (Скала Л.З. и соавт., 2004).
Стремление к усовершенствованию и стандартизации микробиологического метода реализовано разработкой и внедрением в практику за рубежом ряда наборов для выявления и идентификации урогенитальных микоплазм, определения их количества и чувствительности к антибактериальным препаратам, в числе которых «Mycoplasma Lyo», «Mycoplasma IST» (bioMerieux, Франция); «Mycoplasma Duо», «Mycoplasma SIR» (Bio-Rad, Франция); «Mycofast All-In», «Mycofast Evolution 2», «Mycofast US» (International Microbio, Франция). Показано, перечисленные выше наборы обладают высокой диагностической эффективностью (M. Sillis, 1993; M. Abele-Horn et al., 1996; S.A. Poulin, R.B. Kundsin, 1997; Гладкова Н.С. и соавт., 1999; R. Aaltone et al., 2002; F.-C. Cheah et al., 2005). Однако в России эти диагностические наборы имеют ограниченное использование, прежде всего, в связи с их достаточно высокой ценой; некоторые из них недоступны вообще.
В нашей стране еще недостаточно решена проблема микробиологической диагностики уреаплазменной инфекции, хотя имеются питательные среды лабораторного изготовления для выявления Ureaplasma spp.; однако, производственный выпуск данных препаратов, разрешенных для использования в Российской Федерации, отсутствует.
В свете сказанного, несомненно важнейшей задачей является совершенствование микробиологического метода как основного, наиболее объективного и информативного метода диагностики уреаплазменной инфекции. Перечисленные выше предпосылки позволили сформулировать цель и определить задачи работы.
Цель исследования – разработка и стандартизация микротест-системы для выявления и идентификации Ureaplasma spp..
Задачи исследования
1. Разработать селективную питательную среду для культивирования Ureaplasma spp.. Изучить рост штаммов уреаплазм на предложенной среде. Оценить селективные свойства среды и пригодность для выявления уреаплазм в образцах клинического материала.
2. Разработать транспортную среду для сохранения жизнеспособности уреаплазм в образцах клинического материала.
3. Разработать метод оценки роста уреаплазм на основе измерения оптической плотности культур в процессе роста на предложенной питательной среде.
4. Разработать методику оценки ростовых свойств питательной среды для культивирования и выявления Ureaplasma spp. в лабораторных условиях.
5. Создать микротест-систему для выявления и идентификации Ureaplasma spp. и внедрить ее в практику здравоохранения.
6. Разработать методику оценки качества микротест-системы для выявления и идентификации Ureaplasma spp. в клинико-эпидемиологических испытаниях.
7. Разработать программу проведения государственных испытаний микротест-системы совместно с ГИСК им. Л.А. Тарасевича и Комитетом МИБП.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Предложенная микротест-система для выявления и идентификации Ureaplasma spp. «Уреаплазма Микротест» обеспечивает стандартизацию микробиологического метода диагностики уреаплазменной инфекции.
2. Методы определения наиболее вероятного количества бактерий и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени позволяют определить концентрацию уреаплазм в исследуемом материале.
3. Изменение оптической плотности среды в экспоненциальной фазе роста культуры Ureaplasma spp. в стандартных условиях культивирования отражает накопление жизнеспособных клеток уреаплазм.
4. Анализ кривых изменения оптической плотности среды в процессе роста культур тест-штамма в средах сравнения и испытуемой в стандартных условиях позволяет оценить ростовые свойства испытуемой среды.
5. Критерий диагностической эффективности U=U(P) позволяет в клинико-эпидемиологических испытаниях определить ценность микротест-системы «Уреаплазма Микротест», предназначенной для выявления и идентификации условно-патогенных бактерий рода Ureaplasma.
Научная новизна
В связи с необходимостью усовершенствования микробиологической диагностики уреаплазменной инфекции, нами разработаны селективная питательная среда для культивирования и выявления Ureaplasma spp. и транспортная среда для сохранения жизнеспособности уреаплазм в образцах клинического материала. На основе разработанных сред впервые предложена микротест-система для выявления и идентификации Ureaplasma spp. - «Уреаплазма Микротест».
Использование микротест-системы позволяет: 1) выявлять и идентифицировать бактерии рода Ureaplasma; 2) определять обсемененность исследуемого материала уреаплазмами, что важно для оценки их этиологической роли в развитии патологических процессов в урогенитальной системе; 3) оценивать чувствительность выделенных штаммов к антибактериальным препаратам, являющуюся основанием для рационального выбора антибактериальной терапии и одновременно дифференциально-диагностическим критерием идентификации (по отношению штаммов Ureaplasma spp. к антибиотикам групп макролидов и линкозамидов).
Впервые предложен оригинальный метод определения концентрации уреаплазменных культур в экспоненциальной фазе роста по измерению оптической плотности среды, что позволило разработать метод строгой оценки ростовых свойств питательной среды в условиях лаборатории и стандартизовать инокулят при определении чувствительности штаммов Ureaplasma к антибактериальным препаратам.
Впервые разработан метод оценки ростовых свойств питательной среды для культивирования и выявления Ureaplasma spp., основанный на анализе кривых изменения оптической плотности среды в процессе роста тест-штамма в средах сравнения и испытуемой.
Разработана программа клинико-эпидемиологических испытаний диагностической микротест-системы с использованием принципов доказательной медицины. Показана высокая диагностическая эффективность микротест-системы «Уреаплазма Микротест», предназначенной для выявления и идентификации условно-патогенных бактерий рода Ureaplasma.
Научно-практическая значимость
В теоретическом плане проведенные исследования расширяют представления о биологических свойствах бактерий рода Ureaplasma; позволяют оптимизировать методические подходы к определению количества уреаплазм в культурах и образцах клинического материала и стандартизовать процесс выявления и идентификации Ureaplasma spp..
Практическая значимость работы заключается в том, что разработана технология производства микротест-системы для выявления и идентификации Ureaplasma spp. «Уреаплазма Микротест». Разработаны и утверждены фармакопейная статья предприятия ФСП № 42-0115624405 на микротест-систему для выявления и идентификации Ureaplasma spp. «Уреаплазма Микротест»; инструкция по применению препарата № 01-041/135-05 и производственный регламент № 01897593-00805.
Получен патент 2265656 на разработанную питательную среду для выявления Ureaplasma spp. и способ диагностики.
Полученный фактический материал представляет интерес при конструировании препаратов для диагностики урогенитальных микоплазмозов другой этиологии, например, вызванных Mycoplasma hominis.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены на 1-й Всероссийской конференции по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций» (Москва, 2004); 5-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва, 2004); научной конференции кафедры микробиологии с вирусологией и иммунологией ММА им. И.М. Сеченова (14 июня 2006 года, протокол № 29).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, в том числе 5 в центральной печати.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 176 страницах машинописного текста, иллюстрирована 18 рисунками и 39 таблицами; состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов исследования, пяти глав собственных исследований, обсуждения результатов исследования, выводов, списка литературы и приложения. В работе использовано 39 отечественных и 223 зарубежных источников литературы.
Похожие диссертации на Изучение, разработка и стандартизация микротест-системы для выявления и идентификации уреплазм [Электронный ресурс]
