Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы. Современные представления о биологических свойствах холерных вибрионов и их идентификации
1.1. Таксономическое положение и биологические свойства и вибрионов
1.2. Бактериологическая диагностика 21
1.3. Тест-системы для биохимической идентификации микроорганизмов 30
Заключение по обзору литературы 41
2. Собственные исследования разработка и экспериментально-клиническое изучение микротестсистем для ускоренной биохимической идентификации холерных вибрионов
2.1. материалы и методы 43
2.2. Обоснование набора биохимических тестов, включенных в микротестсистему 51
2.3. Разработка рецептурного состава субстратно-индикаторных сред для микротестсистем 55
2.4. Подбор оптимальной микробной нагрузки 84
2.5. Изучение биохимических свойств холерных вибрионов с помощью разработанных микротестсистем 99
3. Испытание микротестсистем на широком наборе музейных и свежевыделенных штаммов холерных вибрионов
3.1. Оценка диагностической ценности разработанных микротестсистем 104
3.2. Изучение биохимических свойств свежевыделенных штаммов холерных вибрионов с использованием МТС-У и МТС-Х 112
Разработка промышленной технологии 115
Изготовления микротестсистем заключение 120
Выводы 129
Список литературы 130
Приложения 150
- Таксономическое положение и биологические свойства и вибрионов
- Тест-системы для биохимической идентификации микроорганизмов
- Обоснование набора биохимических тестов, включенных в микротестсистему
- Оценка диагностической ценности разработанных микротестсистем
Таксономическое положение и биологические свойства и вибрионов
Проблема классификации вибрионов имеет не только важное теоретическое, но и большое практическое значение. Наличие четких таксономических признаков в значительной степени облегчает идентификацию микроорганизмов и тем самым способствует правильной бактериологической диагностике.
Длительное время основным критерием принадлежности бактерий к роду Vibrio была морфология (грамотрицательные изогнутые палочки размером 1,5-4,0 к 0,2-0,4 мкм, один полярный жгутик) и поэтому в качестве вибрионов описано большое количество микроорганизмов, различных по обмену веществ, но сходных по морфологии.
К началу седьмой пандемии холеры накопилось достаточно данных, свидетельствующих о необходимости пересмотра классификаций вибрионов и близких к ним микроорганизмов. Благодаря исследованиям Davis и Park [152], Sebald и Veron [199], R.Sakazaki et al. [196] сложилось совершенно новое представление об основных таксономических признаках вибрионов. Тщательное сравнительное изучение микроорганизмов, считавшихся вибрионами, позволило Подкомитету по таксономии вибрионов Международной ассоциации микробиологических обществ дать новое предварительное описание рода Vibrio, в котором были учтены морфологические, биохимические и генетические особености его представителей. При этом было реализовано предложение B.Eddy и K.Carpenter, M.Veron о создании нового семейства Vibrionaceae, куда вошли роды Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas, Photobacterium, Lucibacterium [157, 217]. Такое определение значительно сузило границы рода Vibrio и позволило отличать вибрионы от сходных с ними по морфологии Pseudomonas, но не исключало наиболее близких к вибрионам Aeromonas и Plesiomonas. Veron в 1971 г. предложил новую классификацию рода Vibrio, разделив его представителей на 3 группы: а) вибрионы пресной воды - V.cholerae, V.shigelloides, б) вибрионы морской воды- V.parahaemoliticus, V.fisheri, V.costicolus; в) вибрионы, встречающиеся в пресной и морской воде - Vanguillarum [61].
Об условности такого деления прежде всего свидетельствуют многочисленные факты выделения холерных вибрионов не только из пресной воды, но и из морской воды. Кроме того, вопреки установившимся в течение последнего десятилетия взглядам, Veron относит к вибрионам микроорганизмы, расщепляющие аргинин {V.shigelloides) и не декарбоксилирующие лизин и орнитин {V.costicolus и Vanguillarum). V.fisheri, так же, как и V.shigelloides, отличаются от вибрионов и по морфологии, являясь лофотрихами. Таким образом, из 6 видов, представленных в этой классификации, только 2 - V.cholerae и V.parahaemoliticus - соответствуют современным требованиям, предъявляемым к вибрионам. По современной классификации в состав семейства Vibrionaceae включены род Aeromonas, род Enhydrobacter, род Photobacterium, род Plesiomonas и род Vibrio [86]. Дифференциация бактерий семейства Vibrionaceae, Pseudomonadaceae и Enterobacteriaceae может быть осуществлена с помощью признаков, представленных в таблице 1. Для дифференциации родов семейства Vibrionaceae наибольшее значение имеют декарбоксилазы лизина и орнитина и дигидролаза аргинина. Представители рода Aeromonas в отличие от вибрионов неактивны в отношении первых двух аминокислот, но расщепляют аргинин. Plesiomonas shigelloides - единственный представитель соответствующего рода - утилизирует все три аминокислоты, хотя описаны варианты, неотличимые от вибрионов по набору декарбоксилаз, и поэтому их дифференцируют также по отношению к манниту, инозиту, крахмалу и желатине.
Надо отметить, что в таблице имеется неточность, т.к. V.cholerae и V.mimicus не нуждаются в NaCl. . Классификация семейства еще не закончена. Есть предложения выделить род Aeromonas в семейство Aeromonadaceae, а бактерии рода Plesiomonas - в семейство Enterobacteriaceae [177].
В настоящее время род Vibrio широко распространен и представлен 36 видами микроорганизмов. Являясь составной частью аутохтонной микрофлоры, они играют важную роль в экологии водоемов. 12 видов патогенны для человека: V.alginolyticus, V.carchariae, V.cholerae, V.cincinnatiensis, V.damsela, V.fluvialis, V.furnissii, Vhollisae, V.metchnikovii, V.mimicus, V.parahaemolyticus, V.vulnificus [176,218,221].
Типовой вид рода Vibrio - Vibrio cholerae, был обнаружен в 1883 г. Р.Кохом и вплоть до начала 7 пандемии считался единственным возбудителем холеры. Холерный вибрион, так же как и другие вибрионы, представляет собой короткую изогнутую палочку, спор не образует и капсул не имеет. Наличие жгутика обуславливает очень большую подвижность вибриона. Тинкториальные свойства аналогичны таковым у энтеробактерий, вибрионы хорошо окрашиваются многими анилиновыми красками. На твердых средах возбудитель образует небольшие круглые дисковидные прозрачные S-колонии с ровными краями, голубоватые в проходящем свете (что сразу их отличает от более грубых и мутно-белых колоний энтеробактерий). Колонии маслянистые, легко снимаются со среды и эмульгируются, давая феномен «тяжа». Старые культуры несколько грубеют и приобретают желтовато-коричневый оттенок. На скошенном агаре через 24 ч холерный вибрион образует блестящий желтоватый налет. На агаре с тиосульфатом, цитратом, солями желчных кислот и сахарозой (TCBS-агар) V.cholerae ферментирует сахарозу и образует желтые колонии. На пластинках желатины через 48 ч вырастают беловатые зернистые колонии, окруженные зоной разжижения. При посеве уколом через 48-72 ч вызывает воронкообразное разжижение, его верхняя часть при просматривании сбоку представляется пузырьком воздуха; позднее разжижение увеличивается, и полость заполняется белесой массой вибрионов. Также образуются неровные, мутные R-колонии; бактерии из них утрачивают чувствительность к бактериофагам, антибиотикам и не агглютинируются О-сыворотками. Игнорирование этого факта может привести к диагностическим ошибкам, так как такие неагглютинабельные штаммы могут восстановить свою агглютинабельность при пассировании через организм человека [20]. На жидких средах вызывает помутнение и образование нежной голубоватой пленки на поверхности, ее края приподняты вдоль стенок пробирки; при встряхивании она легко разрушается и оседает на дно. На 1% пептонной воде (рН 8,8-9,0) холерные вибрионы растут, опережая бактерии кишечной группы, и образуют нежную голубоватую пленку и муть. Температурный оптимум для роста 37С, хотя размножение вибрионов возможно и при более низкой температуре.
Тест-системы для биохимической идентификации микроорганизмов
В мировой практике предложено значительное число ускоренных и упрощенных методов идентификации микроорганизмов. В основу функционирования большинства тест-систем положен микрокультуральный метод, позволяющий сократить сроки исследования за счет взаимодействия небольших объемов питательных субстратов с относительно большой посевной дозой исследуемой микробной культуры. Микроусловия взаимодействия микроба с субстратом и развития цветной реакции отличаются от условий в классических пробирочных тестах. Нельзя ингредиенты и их соотношения, используемые в пробирочных реакциях, автоматически перенести в микросистемы. Однако публикаций, посвященных принципам разработок тестсистем, нет.
В зависимости от субстрата все разработанные к настоящему времени тест-системы можно разделить на несколько групп: - системы, в которых в качестве носителя питательного субстрата используется бумажная основа в виде полос или дисков, помещенных в специальные панели или планшеты; - системы, в которых несколько субстратов объединены в одной или нескольких пробирках (не более 4); - системы, содержащие высушенные или замороженные субстраты в специальных емкостях (планшеты, панели); - системы с твердыми пластинчатыми средами.
В последнее время в ряде стран получили распространение различные тест-системы одноразового использования для ускоренной биохимической идентификации микроорганизмов, в основном бактерий семейства энтеробактерий (156, 162, 164, 179, 183, 200, 209, 210). Эти системы экономичны, удобны в работе. Ниже приводится краткая характеристика некоторых тестсистем. Система API-20E, предназначенная для идентификации энтеробактерий, состоит из пластмассовой пластинки с 20 микропробирками, содержащими различные сухие питательные среды.
С помощью этой системы можно определить 23 биохимических теста в течение 18-24 часов. В пробирки вносится суспензия используемой суточной культуры микроорганизмов. Предложены различные варианты API-системы для биохимической идентификации стафилококков, стрептококков, анаэробов, дифтериеподобных бактерий и др. [131, 135, 142, 149, 159, 163, 164, 184, 187, 205]. API-20E была успешно использована для идентификации Vibrio anguillarum и V.ordalii. Первоначально система применялась в клинических лабораториях для идентификации грамотрицательных кишечных бактерий [167]. При дальнейшем усовершенствовании тест-систем API были созданы системы АТВ (Automatic Test in Bacteriology), позволяющие проводить идентификацию бактерий в течение 4 или 24 ч, а также определять их чувствительность к антибиотикам. Биохимические панели в системах АТВ содержат 32 субстрата, находящихся в ячейках в лиофилизированном виде. С помощью таких панелей возможна идентификация широкого круга микроорганизмов. Для более эффективного использования предложена полностью автоматизированная система API 3600S, которая состоит из комплекса ротора-кювет. Этот комплекс содержит 36 изолированных камер, центрифужное устройство, фотометр и учетно-печатающий блок. С помощью центрифужного устройства микробная суспензия поступает в камеры с питательными средами [49].
Система Pathotec предложена для идентификации энтеробактерий и других групп с помощью семи бумажных полос, опускаемых в пробирки с микробной взвесью. Однако в значительной части случаев этот набор оказался недостаточным для идентификации выделяемых культур, и число тестов было увеличено до 10. Эта новая система - Rapid JD позволила сократить время, необходимое для идентификации микроорганизмов, до суток за счет возможности учета результатов при помощи системы через 4 ч. С помощью индикаторных бумажек, определяющих одновременно до трех реакций (система Uni N/F Тес), было предложено дифференцировать различные грамотрицательные микроорганизмы кандид.
Из трех бумажных полос с субстратами для выявления трех ферментов (Р-галактозидазы, пролинаминопептидазы и гамма-глутаминаминопептидазы), помещенных на пластиковую панель, состоит система Neisstrep. С ее помощью в течение 15 мин можно провести дифференциацию представителей рода Нейссерия [49].
Системы Micro-JD, Minitek и Minibact сконструированы с использованием бумажной основы, импрегнированной различными субстратами. В этих системах бумажные диски помещены в лунки пластиковой панели. С помощью первой и третьей систем идентифицируют, в основном, энтеробактерии (15 тестов), вторую (20 дисков) используют главным образом для идентификации стафилококков, стрептококков, нейссерий и грамотрицательных бактерий [130,131, 135, 136, 137, 138]. При изучении системы Minitek в сравнении с общепринятыми методами согласование было 98,9% [204].
С целью быстрой идентификации грамотрицательных видов возбудителей используют панель BBL «Crystal" E/NF, требующую предварительного субкультивирования с последующей инокуляцией колоний. Предложена модификация метода с прямой инокуляцией выделенных культур, позволяющая сокращения времени исследования на 24 ч при идентификации бактерий, вызывающих бактериемию [215].
Обоснование набора биохимических тестов, включенных в микротестсистему
Для разработки микротестсистемы для биохимической идентификации холерных вибрионов прежде всего необходимо было на основании литературных данных определить минимальный набор биохимических тестов, обеспечивающих максимальную информацию. Обзор литературы показал, что число таких биологических тестов по данным разных авторов достигает . Включение такого количества тестов в одну микротестсистему сделало бы ее громоздкой и сложной в употреблении. В Методических указаниях по лабораторной диагностике холеры [58] предложен "следующий набор биохимических тестов: определение оксидазы, наличие индолообразования, декарбоксилаз лизина, орнитина, дигидролаза аргинина, ферментация глюкозы, лактозы, маннозы, сахарозы, арабинозы, маннита, салицина, дульцита, целлобиозы, инозита. Так как не существует строго регламентированного набора тестов, используемого для идентификации холерных вибрионов, каждый исследователь вправе выбирать тот набор тестов, который максимально соответствует его целям исследования. В связи с этим из предлагаемого разнообразия тестов в качестве рациональных исследовали только те, которые позволяли отличить холерные вибрионы как между собой, так и от других сходных с ними по морфологическим признакам микроорганизмов.
Дифференциально-диагностическое значение для вибриона холеры имеет ферментация сахарозы, маннозы и арабинозы. Холерные вибрионы ферментируют сахарозу, маннозу с образованием кислоты без газа (в 100 % случаев) и не расщепляют арабинозу [176], что является существенным, когда речь идет о неагглютинирующемся холерном вибрионе. В связи с этим мы решили включить в микротестсистему тесты ферментации глюкозы, маннозы и арабинозы.
Также к числу наиболее значимых для дифференциации родов семейств Vibrionaceae нами были отнесены тесты, позволяющие определить утилизацию глюкозы и маннита: по литературным данным [176] из патогенных для человека микроорганизмов V.cholerae, V.cincinnatiensis, V.damsela, V.fluvialis, V.furnissii, V.hollisae, V.metchnikovii, V.mimicus, V.parahaemolyticus, V.vulnificus, V.alginolyticus активно сбраживают до кислоты без газа глюкозу в 100% случаев, для маннита процент положительных реакций составил для V.cincinnatiensis, V.furnissi, V.alginolyticus, V.parahaemolyticus 100%, для V.cholerae, V.mimicus- 99%.
Известно, что по морфологическим и тинкториальным признакам холерные вибрионы сходны с Pseudomonas - и те, и другие могут быть прямыми или изогнутыми палочками, и те и другие грамотрицательные. В связи с этим, для дифференциации вибрионов от псевдомонад мы сочли необходимым ввести тест на индол: все Vibrio индолоположительны, а Pseudomonas - индолоотрицательны [86, 166, 176].
Кроме того, из литературы также известно [177], что некоторые авторы ввиду сходства 5S-pPHK представителей рода Plesiomonas с таковой рода Proteus предлагают перенести представителей Plesiomonas в род Proteus. Так как в настоящее время этот вопрос остается открытым, мы сочли целесообразным проводить дифференциацию Vibrio не только от Pseudomonas, но и от Proteus, что легко осуществляется с помощью оксидазного теста и индольного.
Основным признаком, отличающим вибрионы от негазообразующих аэромонад, служит их отношение к аминокислотам. Вибрионы ферментируют лизин и орнитин и не расщепляют аргинин. Представители рода Aeromonas ферментируют аргинин и остаются инертными к лизину и орнитину. Штаммы Plesiomonas утилизируют все 3 аминокислоты [86].
Что касается остальных тестов, предлагаемых в Методических указаниях по лабораторной диагностике холеры, как бы ни подходил тот или иной тест в конкретном случае, от него следует отказаться, если он часто приводит к ошибкам в интерпретации результатов [13]. Так, решено было не включать в микротестсистему тест на лактозу: отношение холерного вибриона к лактозе не постоянное, а также тест малоинформативный [86, 176].
Введение теста на салицин могло привести к диагностическим ошибкам: данный тест является вариабельным {V.cholerae ферментирует салицин в 1% случаев) [176], и его можно учитывать только в сочетании с другими тестами.
Использование теста на дульцит в микротестсистеме нерационально, поскольку практически все патогенные для человека микроорганизмы отрицательны на данном тесте, только лишь V.parahaemolyticus в 3% случаев могут ферментировать дульцит. Aeromonas и Plesiomonas также инертны к дульциту [166].
Тесты на целлобиозу и инозит также являлись неинформативными: V.cholerae отрицателен на данных тестах, другие виды вибрионов вариабельны [176].
В связи с вышеизложенным, для биохимической идентификации холерных вибрионов нами были определены для включения в микротестсистему следующие тесты: утилизация глюкозы, маннозы, арабинозы, сахарозы, маннита, обнаружение индола, оксидазы, наличие лизин- и орнитиндекарбоксилазы, аргининдегидролазы, которые мы объединили в одну микротестсистему, обозначив ее как MTC-V. Были проведены исследования по определению ферментативной активности холерных вибрионов и наиболее часто встречающихся ассоциантов по 10 вышеперечисленным тестам (табл. 10).
Оценка диагностической ценности разработанных микротестсистем
Следующим этапом явилось изучение качества разработанных микротестсистем на широком наборе музейных тест-штаммов с целью определения их диагностической ценности (воспроизводимости, сопоставимости, специфичности). Испытания проводили в сравнении с системами индикаторными бумажными (СИБ) производства ГНИИЭМ (г.Нижний Новгород), пробирочными средами Гисса НПО «Питательные среды» (г.Махачкала) и средами Меллера лабораторного приготовления, содержащие аминокислоты (лизин, орнитин, аргинин).
Всего было изучено 158 музейных штаммов, в т.ч. холерных вибрионов и ассоциантов.
С целью определения показателя воспроизводимости разработанных микротестсистем для каждого теста MTC-V и МТС-Х ставили по 10 положительных и по 10 отрицательных определений. Отрицательные результаты проверяли с V.cholerae поп 01 для тестов на арабинозу и аргининдегидролазу, с P.aeruginosa Р-5810- на тест с глюкозой, маннозой, сахарозой, маннитом и индолом, с P.vulgaris НХ19 - на оксидазу, лизин- и орнитиндекарбоксилазу. Положительные результаты для утилизации глюкозы, маннозы, сахарозы, маннита, индола, оксидазы, для обнаружения лизин- и орнитиндекарбоксилазы проводились с V.cholerae поп 01 Р-9741, для утилизации арабинозы - с A.hydrophila Р-4499, наличие аргининдегидролазы - с P.aeruginosa Р-5810. Обобщенные результаты соответствия данных, полученных с помощью микротестсистем, СИБов и сред Гисса сведены в таблицы 39, 40, 41.
Как видно из таблиц 42 и 43, обобщенные данные, полученные по всем изученным 158 музейным тест-штаммам показали, что все 10 тестов работают четко. Процент совпадений результатов, полученных с помощью испытуемой тест-системы MTC-V и коммерческой системы СИБ для разных тестов составил от (88±5) до (99+1) %, средние данные по 10 тестам составили (92,8±3) %. Процент совпадений результатов исследований с помощью MTC-V и сред ами Гисса для отдельных тестов равнялся от (85±5)% до (98+Л) %, средние данные составляли (92,3+3) %.
При изучении биохимической активности микроорганизмов с помощью МТС-Х, предназначенной для ускоренного определения вибрионов по группе Хейберга по утилизации маннозы, сахарозы и арабинозы было установлено, что процент совпадений данных для испытуемой тест-системы и СИБов составил по отдельным тестам от (76±5)% до (91 ±4)% со средними данными для трех тестов (88±3)%. Данные, полученные с помощью МТС-Х и сред Гисса, совпадали по отдельным тестам от (90+34)% до (96+1)% со средними показателями (93+2)%.
Чувствительность и специфичность разработанных микротестсистем MTC-V, МТС-Х и СИБов и статистическая обработка результатов их испытания в сравнении с классическим методом представлена в таблице 44.
Таким образом, в результате испытаний установлено, что тест-системы MTC-V и МТС-Х имеют преимущество перед бумажными индикаторными системами (СИБ) и средами Гисса по следующим характеристикам: - не требуют приготовления питательных сред, приобретения углеводов и аминокислот, закладывания дисков в пробирки, меньшему объему 1%-ной пептонной воды, физиологического раствора, стерильных пробирок; - по простоте постановки реакции; - по времени, используемому на постановку реакции с одной культурой (с учетом подготовки препаратов, посевов, инкубирования). Постановка реакций с MTC-V занимает -1 час, со средами Гисса - 2 часа и с СИБ - 3 часа.
В период эпидемии холеры в Республике Дагестан нами совместно с Центрами санэпиднадзоров г.Дербента, г.Избербаша и СПЭБа Ростовского-на-Дону противочумного института были проведены клинические испытания разработанных микротестсистем (MTC-V и МТС-Х) на 300 штаммах холерных вибрионов, выделенных от больных и вибрионосителей, зарегистрированных в различных очагах холеры. В качестве контрольных препаратов использовали питательные среды, изготовленные по классическим прописям, а также системы индикаторные бумажные (СИБ) Нижегородского НИИЭМ.
В центре санэпиднадзора г.Дербента испытания микротестсистем были проведены с 50 штаммами V.cholerae eltor, выделенными от больных и носителей г.Дербента и Дербентского района. Контрольными препаратами были индикаторные бумажные системы.
Установлено, что все 50 изученных штаммов относились к 1 группе по Хейбергу, т.е. утилизировали сахарозу и маннозу - цвет среды в ячейках планшетов изменялся из красного в желтый через 4 ч инкубации, не утилизировали арабинозу (цвет субстрата в ячейках - оранжево-красный). Все штаммы ферментировали глюкозу, маннит, давали положительную реакцию на индол и оксидазу, дезаминировали лизин и орнитин и были не активны к аргинину.
На базе центра Госсанэпиднадзора г.Хасавюрта были испытаны по 3 серии MTC-V и МТС-Х на 150 штаммах V.cholerae eltor, выделенными от больных, вибрионосителей и контактных на территории г.Хасавюрта и Хасавюртовского района.
Установлено на всех сериях МТС-Х, что все изученные 150 штаммов через 2-3 ч инкубации при температуре 37С ферментировали сахарозу и маннозу и не ферментировали арабинозу. На средах Гисса аналогичные результаты наблюдались только через 18 ч. Совпадение результатов анализа на МТС-Х и контрольных средах составило 100% для сахарозы (+), 98,6% -для маннозы (+), и 97,3 % - для арабинозы (-).
При изучении 150 штаммов на MTC-V через 2-3 ч отмечена положительная реакция по утилизации глюкозы, сахарозы, маннита, маннозы, наличие индола (малиновое кольцо) и оксидазы (розовое окрашивание); отрицательная реакция по тестам утилизации арабинозы. Через 18 ч инкубации для всех штаммов на MTC-V показано, что все 150 штаммов V.cholerae eltor обладали лизин- и орнитиндекарбоксилазой, не обладали аргининдегидролазой.
Похожие диссертации на Разработка и экспериментально-клиническое изучение микротестсистем для биохимической идентификации холерных вибрионов
