Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Холерный вибрион серогруппы: характеристика свойств и лабораторная диагностика 14
Глава 2. Принципы конструирования иммуноглобулиновых флуоресцирующих диагностических препаратов 31
Глава 3. Материалы и методы 39
3.1. Бактериальные штаммы 39
3.2. Питательные среды и условия культивирования 40
3.3. Антигены 41
3.4. Экспериментальные животные 42
3.5. Реактивы и растворы 42
3.6. Оборудование и приборы 43
3.7. Методы выделения и очистки иммуноглобулинов 45
3.8. Получение флуорохромных конъюгатов 46
3.9. Изготовление пероксидазных конъюгатов 46
3.10. Серологические и иммунохимические методы исследования 46
3.11. Статистическая обработка 48
Глава 4. Получение гипериммунных холерных агглютинирующих сывороток к vibrio cholerae 0139 49
4.1. Подбор животных-продуцентов 50
4.2. Получение и физико-химическая характеристика антигенов для иммунизации животных-продуцентов 51
4.3. Схемы иммунизации продуцентов 54
4.4. Иммуногенные свойства антигенов и эффективность различных схем иммунизации 60
4.5. Изучение стабильности нативных иммунных кроличьих сывороток в процессе хранения 67
Глава 5. Изготовление и характеристика флуоресцирующих иммуноглобулинов к vibrio cholerae 0139 70
5.1. Сравнительная характеристика эффективности методов фракционирования холерных 0139 кроличьих иммуноглобулинов ... 70
5.2. Флуоресцентная метка иммуноглобулинов 75
5.3. Изучение активности и специфичности флуорохромных конъюгатов 77
5.4. Повышение специфичности холерных 0139 флуоресцирующих иммуноглобулинов 78
5.5. Стерилизующая фильтрация иммуноглобулинов 82
Глава 6. Стабилизация свойств флуоресцирующих иммуноглобулинов к vibrio cholerae 84
6.1. Лиофилизация препарата 84
6.2. Использование протекторов для стабилизации иммуноглобулинов 85
6.3. Изучение влияния температурного режима и сроков хранения на основные свойства холерных флуоресцирующих имму ноглобулинов 86
Глава 7. Применение флуоресцирующих иммуноглобулинов для детекции vibrio cholerae 91
7.1. Эффективность скрининга чистых культур V. cholerae 0139 прямым методом флуоресцирующих антител 91
7.2. Обнаружение V. cholerae 0139 в искусственно инфицированных образцах биологического материала и объектов внешней среды 102
7.3. Идентификация V. cholerae Ol39 различными методами экспресс-анализа с применением флуоресцирующих иммуноглобулинов 104
Заключение 113
Выводы 122
Список использованных источников 124
- Принципы конструирования иммуноглобулиновых флуоресцирующих диагностических препаратов
- Получение и физико-химическая характеристика антигенов для иммунизации животных-продуцентов
- Сравнительная характеристика эффективности методов фракционирования холерных 0139 кроличьих иммуноглобулинов
- Изучение влияния температурного режима и сроков хранения на основные свойства холерных флуоресцирующих имму ноглобулинов
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В основе целенаправленной научно обоснованной борьбы с холерой лежит ее своевременная диагностика. Для холеры, как карантинной инфекции, очень важна постановка диагноза в кратчайшие сроки с целью определения объемов проведения противоэпидемических и профилактических мероприятий.
Начиная с 1992 г., когда эпидемиологическая ситуация по холере на побережье Бенгальского залива была серьезно осложнена крупными вспышками диарейных заболеваний, вызванных представителями новой, ранее не известной 0139 серогруппы, данный патоген привлекает к себе внимание исследователей в связи с его способностью к длительному существованию в эндемичных по холере районах в межэпидемический период, а также к распространению на другие континенты (154, 208). Вспышки, обусловленные Vibrio cholerae 0139, продолжают фиксироваться в странах Юго-Восточной Азии. В 2003 г. зарегистрирована крупная эпидемия (30 000 больных) в Дакке и примыкающих территориях, вызванная холерными вибрионами 0139 (98).
Учитывая интенсивные миграционные процессы населения, связанные с туризмом, коммерцией, трудовой и политической миграцией (26, 206), не исключена вероятность завоза данного бактериального агента в другие страны, в том числе и на территорию Российской Федерации. Подтверждением этому являются события 1993 г., когда впервые в нашей стране был зарегистрирован случай холеры "Бенгал" (77).
Практические лаборатории Федеральной службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей и благополучия человека и лечебно-
профилактические учреждения располагают широким спектром
диагностических препаратов для выявления и идентификации холерных
вибрионов 01 серогруппы, однако, диагностика холеры, вызванной
V. cholerae 0139, требует дальнейшего совершенствования, поскольку данные
микроорганизмы являются относительно новым этиологическим агентом
%
эпидемической холеры. На сегодняшний день единственным в Российской Федерации лицензированным препаратом для детекции V. cholerae 0139, внесенным в перечень препаратов для лабораторной диагностики холеры (МУ 4.2.1097-02), является кроличья агглютинирующая сыворотка для РА на стекле.
^ Достоверность лабораторной диагностики холеры "Бенгал" может быть
достигнута при комплексном применении различных методов - от
классической реакции агглютинации Видаля до тест-систем, разработанных на
основе современных технологий, таких, как гибридомная (5, 85, 128, 180), а
также генодиагностических методов - ПНР (24, 33). В то же время при
конструировании диагностических препаратов немаловажным фактором
является их доступность для практического здравоохранения. К числу таких
МИБП относятся препараты для диагностики бактериальных инфекций
методом флуоресцентной микроскопии. Этот метод занимает одно из ведущих
мест в экспресс-диагностике особо опасных инфекций благодаря высокой
иммунологической чувствительности в сочетании с точностью
микроскопического анализа (168, 169). Чувствительность МФА при приготовлении мазков непосредственно из взвеси бактерий колеблется в пределах 1x105 - 5x105 м.кл./мл (28). МФА надежно зарекомендовал себя при диагностике холеры, обусловленной V. cholerae 01 серогруппы (135, 136,143, 182,218).
Неблагоприятный прогноз по холере "Бенгал" в мире, в том числе странах СНГ (59, 78, 83, 84, 95, 96, 97, 98, 101, 102, 109, 126), ограниченный выбор препаратов для детекции V. cholerae 0139 дают основания считать актуальной проблему разработки новых диагностических препаратов для выявления и идентификации холерных вибрионов "Бенгал", которой и посвящена настоящая работа.
Л* ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ - усовершенствование лабораторной
диагностики холеры, вызванной V. cholerae 0139, путем конструирования препарата флуоресцирующих иммуноглобулинов.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:
1. Изучить способность к индукции специфических антител в организме
биопродуцента препаратов холерного О-антигена, приготовленных
различными способами, и оценить их эффективность для получения
сывороток с высоким уровнем активности.
Отработать оптимальную схему гипериммунизации кроликов-продуцентов холерной 0139 сыворотки с минимальным содержанием гетерологичных антител.
Экспериментально обосновать выбор оптимального метода фракционирования кроличьих иммуноглобулинов, не влияющего на их специфическую активность и характеризующегося высоким выходом белка.
4. Получить флуорохромные конъюгаты холерных 0139 кроличьих
иммуноглобулинов и охарактеризовать их специфическую активность.
5. Отработать рациональный режим адсорбции ФИТЦ-меченых
иммуноглобулинов с целью повышения специфичности препарата.
6. Отработать оптимальные условия стабилизации кроличьх
флуоресцирующих холерных 0139 иммуноглобулинов.
7. Определить диагностическую ценность препарата в МФА, а также в
других методах экспресс-анализа.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые, на основе сравнительного анализа препаратов О-антигена холерного вибриона 0139 сероварианта, полученных различными способами, показано, что с наибольшей эффективностью в схеме изготовления флуоресцирующих иммуноглобулинов может быть использован препарат, полученный с помощью комбинации методов ультрафильтрации на полых волокнах и гель-хроматографической очистки.
Впервые, на основе экспериментальных исследований по индуцированию у лабораторных животных антител к О-антигену, предложена эффективная схема гипериммунизации кроликов, позволяющая получать холерные 0139 сыворотки с высокой активностью и низким уровнем содержания гетерологичных антител.
Впервые разработаны общие принципы и методические приемы изготовления кроличьих флуоресцирующих иммуноглобулинов к V. cholerae 0139, заключающиеся в выделении активной фракции иммуноглобулинов сульфатом аммония, обессоливанием гель-фильтрацией, выборе оптимальных соотношений флуорохрома и иммуноглобулинов, адсорбции неспецифических антител из препарата экспериментально установленным спектром штаммов холерных вибрионов 01 и не 01 серогрупп, стерилизующей фильтрации, применении наиболее эффективных стабилизаторов при проведении процесса лиофилизации.
Впервые показана возможность использования препарата флуоресцирующих иммуноглобулинов в других эффективных _ тестах экспресс-выявления возбудителя холеры "Бенгал": реакции слайд-агглютинации, иммуноферментном и дот-иммуноанализе, что существенно расширяет сферы его применения в лабораторной практике.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Разработана биотехнологическая схема серийного изготовления нового препарата для выявления V. cholerae 0139 в реакции иммунофлуоресценции, определены условия его стабилизации.
Подтверждена авторскими исследованиями и комиссионными испытаниями высокая диагностическая эффективность применения препарата для выявления патогенных вибрионов 0139 серогруппы методом флуоресцирующих антител (Акт о проведении комиссионных испытаний иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих холерных 0139 адсорбированных кроличьих сухих от 02.02.04).
Составлен проект нормативной документации - экспериментально-производственный регламент (ЭПР), фармакопейная статья предприятия (ФСП), инструкция по применению на иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие холерные 0139 адсорбированные кроличьи сухие, одобренный Ученым советом РосНИПЧИ "Микроб" (протокол № 5 от 25.06.04).
Материалы, представленные в диссертационной работе, получены в процессе реализации исследований, выполненных в рамках плановых тем НИР: "Совершенствование технологии производства и системы контроля качества медицинских иммунобиологических препаратов", № 036-2-00 (№ Госрегистрации 01.20.0010636); "Создание банка антигенов возбудителей ООИ и антител к ним, стандартных по своим физико-химическим и иммунобиологическим характеристикам", № 005-2-01 (№ Госрегистрации 01.20.0010635).
Разработанный препарат используется на курсах первичной специализации врачей и биологов по особо опасным инфекциям и курсах усовершенствования врачей по бактериологии при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" при проведении практических занятий в цикле изучения микробиологии и лабораторного диагноза холеры.
ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:
1. Сконструированный препарат "Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие холерные 0139 адсорбированные кроличьи сухие" предназначен для детекции холерных вибрионов "Бенгал" методом прямой иммунофлуоресценции.
2.0-антиген холерного вибриона 0139, полученный способом ультрафильтрации на полых волокнах, является оптимальным препаратом для гипериммунизации кроликов-продуцентов с целью получения сыворотки-полуфабриката для изготовления флуоресцирующих иммуноглобулинов.
Рациональная схема иммунизации кроликов-продуцентов позволяет получать активные холерные 0139 сыворотки с минимальным уровнем содержания гетерологичных антител.
Разработанная биотехнологическая схема экспериментально-производственного изготовления холерных 0139 флуоресцирующих иммуноглобулинов позволяет получать препарат, характеризующийся
высокой активностью и специфичностью, сохраняющий основные свойства в течение 2,5 лет (срок наблюдения).
5. Диагностические холерные 0139 флуоресцирующие иммуноглобулины
могут быть использованы для детекции холерных вибрионов 0139 серогруппы
в других методах экспресс-анализа, включающих слайд-агглютинацию,
- иммуноферментный и дот-иммуноанализ.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации представлены на:
межрегиональной научно-практической конференции "Медицинские, экологические и социальные аспекты формирования здоровья населения (Челябинск, 2001);
юбилейной научно-практической конференции "Эпидемиологическая безопасность на Кавказе. Итоги и перспективы", посвященной 50-летию Ставропольского НИПЧИ (Ставрополь, 2002);
- юбилейной научно-практической конференции "Инфекционные
болезни в регионах Северного Кавказа: эпидемиология, лабораторная
диагностика, профилактика", посвященной 50-летию Дагестанской
противочумной станции (Махачкала, 2002);
VIII Российской научно-практической конференции "Холера и патогенные для человека вибрионы" (Ростов-на-Дону, 2003);
научно-практических конференциях РосНИПЧИ "Микроб" "Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте "Микроб" (Саратов, 2001, 2002, 2004);
Всероссийской научно-практической конференции "Медицинская микробиология - XXI век" (Саратов, 2004).
ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из
введения; 2 глав обзора литературы; 5 глав собственных исследований,
щ включающих описание материалов и методов исследований и
экспериментальную часть; заключения; выводов; списка литературы,
включающего 241 источник, из них зарубежных - 95. Объем диссертации
составляет 151 страницу машинописного текста, включая 9 рисунков и 17 таблиц.
*
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Принципы конструирования иммуноглобулиновых флуоресцирующих диагностических препаратов
Холера — тяжелое инфекционное заболевание, предотвратить широкое распространение которого в настоящее время пока не удается. Несмотря на большой комплекс проводимых противоэпидемических мероприятий, стойкие эндемичные очаги заболевания сформировались в странах Юго-Восточной Азии, Африки и Латинской Америки. Учитывая цикличность эпидемического процесса в период седьмой пандемии холеры, следует ожидать дальнейшего роста заболеваемости, чему способствуют интенсивные миграционные процессы населения, повышение уровня мирового океана и температуры поверхностных вод (166), ухудшение условий окружающей среды, ведущее к усилению загрязнения прибрежных вод (177, 203, 214).
В настоящее время известно около 200 серотипов холерных вибрионов (1, 108, 179). До 1992 г. возбудителями эпидемической холеры являлись V. cholerae биоваров cholerae и eltor, относящиеся к 01 группе.
Несмотря на большое сходство микроорганизмов V. cholerae 01 и не 01 серогрупп по ряду свойств (подвижность, положительный хемотаксис, адгезивность, наличие ферментов патогенности, продукция термостабильных и термолабильных токсинов), до 1992 г. холерные вибрионы не 01 служили причиной лишь спорадических случаев холероподобных диарейных заболеваний, а групповые вспышки диарей, вызванные ими, считались нозологически самостоятельными и не имеющими отношения к холерной инфекции. В отдельных случаях V. cholerae не Ol способны обусловливать заболевания с внекишечной локализацией возбудителя, в т.ч. септицемию (60, 79). Существовало мнение, что холерные вибрионы не 01 группы не обладают эпидемическим потенциалом и, следовательно, не могут вызывать эпидемического распространения инфекции. Однако, в 1992-1993 г.г. в Индии и Бангладеш были зарегистрированы вспышки диарейных заболеваний, принявших характер крупных эпидемий, возбудителями которых явились V. cholerae не 01 (95, 192, 199, 221). В отличие от известных ранее спорадических случаев или локальных вспышек, вызванных этими вибрионами, заболевания в указанных регионах характеризовались интенсивностью эпидемического проявления (десятки тысяч случаев), тяжестью клинического течения, высокими показателями смертности - до 5 %. Заболевание поражало в основном взрослый контингент. Хотя клинический синдром был не отличим от типичной холеры (объемный стул характера рисового отвара, дегидратация, гиповолемический шок), причинным агентом всех этих случаев заболеваний людей явился холерный вибрион не 01 группы, который был отнесен к новой, ранее не известной 0139 серогруппе. Из-за первоначального места его выделения вдоль береговых районов Бенгальского залива он получил название "Бенгал" (147). Таким образом, появление V. cholerae 0139 серогруппы в качестве второго этиологического агента эпидемической холеры опровергло долго существующее представление о том, что только холерные вибрионы 0\ группы способны вызывать эпидемии и пандемии (148). У микроорганизмов V. cholerae 0139 отмечены не только большой эпидемический потенциал, но и быстрота его распространения. В отличие от V. cholerae eltor, которые вызвали седьмую пандемию холеры, холерные вибрионы 0139 распространялись в три раза быстрее. Из районов Индии и Бангладеш инфекция проникла в соседние государства Азии, вспышки заболеваний были отмечены в Пакистане, Непале, Китае, Таиланде, Казахстане, Афганистане, Малайзии. Завозные случаи холеры, вызванной V. cholerae 0139, были зарегистрированы в Соединенных Штатах Америки и ik Великобритании. В 1993 г. холера "Бенгал" была завезена из Индии и на территорию России (77). После стремительного распространения V. cholerae 0139 создалось впечатление, что этот микроорганизм является этиологическим агентом новой восьмой пандемии (148, 179, 192, 229). Однако, спустя год после появления, холерные вибрионы "Бенгал" стали вытесняться вибрионами эльтор, которые вновь начали преобладать в Индии (153, 154). Спустя еще год в цИ распространении обеих серогрупп стали выявляться поразительные различия. В северной части Индии V. cholerae 0139 был замещен холерными вибрионами 01, однако, на южном побережье сохранилось преобладание серогруппы "Бенгал". Был сделан вывод, что холерные вибрионы 0139 могут стать эндемичными в прибрежных экосистемах, а угроза пандемии может быть не так велика, как казалось вначале (220). После 1996 г. наблюдается сосуществование холерных вибрионов эльтор и 0139 (178, 189, 195, 199, 232). Повторное выявление V. cholerae 0139 в Калькутте и вспышка холеры "Бенгал" в 1998 г. в Нагпуре (Махараштра), крупная эпидемия в 2003 г. в Дакке (30 000 больных), вызванная холерными вибрионами 0139, являются свидетельством того, что эта серогруппа играет основную роль во временных вариациях возбудителя холеры и существует необходимость мониторинга за ней (96, 98, 208, 216). Как и представители 01 серогруппы, V. cholerae 0139 неоднозначны в отношении эпидемического потенциала, определяемого наличием хромосомного "острова патогенности", поскольку у непатогенных холерных вибрионов он отсутствует (46, 119, 126, 193). Авирулентные штаммы холерных вибрионов "Бенгал", не способные к продукции холерного токсина, на территории России выделены из воды рек Иркутской, Новосибирской, Московской, Ростовской областей и Калмыкии (56,69,95, 131). Факторы патогенности и особенности антигенной структуры. Одним из основных принципов конструирования современных профилактических и диагностических препаратов является изучение структур бактериальной клетки, являющихся антигенами и факторами патогенности (100, 196). Патогенность - это полидетерминантный признак, предусматривающий возможность участия на одном и том же этапе развития инфекционного процесса разных факторов и, напротив, одних и тех же факторов на различных стадиях взаимодействия возбудителя с чувствительным макроорганизмом (3, 4,19,76,117,121).
Установлено, что холерные вибрионы 0139 экспрессируют те же факторы патогенности, что и cholerae 01 серогруппы. На начальной стадии инфекционного процесса - преодолении естественных барьеров организма хозяина - важную роль играет такой фактор патогенности, как подвижность микробной клетки. Изучение авирулентных штаммов V. cholerae 0139, выделенных из внешней среды, показало, что одним из признаков их авирулентности является слабая подвижность (104).
Следующая фаза развития инфекционного процесса связана с адгезией возбудителей холеры к поверхности эпителиальных клеток тонкой кишки и дальнейшей колонизацией. Важнейшим колонизирующим фактором V. cholerae 0139 являются ТКПА (токсин-корегулируемые пили адгезии), основная функция которых, по мнению T.J. Kirn et al. (198), заключается в опосредовании взаимодействия между бактериями путем прямого контакта пилей, необходимого для ассоциации микроорганизмов в микроколонии и колонизации кишечника. Этот адгезии, имеющий фимбриальную структуру, получил свое название из-за поразительно координированной регуляции экспрессии структурных генов пилей адгезии и холерного токсина (119, 151, 192, 194, 230, 231). ТКПА экспрессируются штаммами V. cholerae 0139 в тех же условиях выращивания, что и у вибрионов eltor. Наличие идентичных последовательностей гена tcpA, ответственного за синез ТКПА, указывает на филогенетическое родство холерных вибрионов eltor и 0139 (24).
Получение и физико-химическая характеристика антигенов для иммунизации животных-продуцентов
"Постоянная работа над повышением качества употребляемых для иммунизации антигенов, над разработкой новых видов их, отбор среди выработанных препаратов, обладающих наибольшей иммунизирующей активностью, - вот один из наиболее эффективных путей повышения качества вырабатываемых сывороток" (Ш). Исходя из этого принципа конструирования высококачественных диагностических препаратов, нами была изучена эффективность применения для иммунизации кроликов антигенов с различными физико-химическими свойствами — полученных как традиционными, так и вновь разработанными методами. Физическое состояние антигена - немаловажный фактор, предопределяющий интенсивность иммуногенеза, поэтому в настоящем исследовании были использованы корпускулярные и растворимые О-антигены V. cholerae 0139. В практике серийного изготовления агглютинирующих холерных О-сы-вороток традиционным является применение корпускулярных О-антигенов, которые представляют собой взвесь инактивированных микробных клеток в изотоническом растворе (41). Для приготовления корпускулярного 0139-антигена были использованы клетки штамма V. cholerae Р-16064 и его бескапсульных вариантов, полученных в лаборатории патогенных вибрионов РосНИПЧИ "Микроб" (120, 133). Бактерии холерных вибрионов 0139 выращивали на бульоне Мартена рН 7,6 при температуре 37 С в течение 4-6 ч, затем пересевали на агар Мартена рН 7,6 и инкубировали еще 18-20 ч при температуре 37 С. Микробную взвесь с поверхности агара смывали 0,9 % раствором натрия хлорида рН 7,2 осторожным покачиванием, фильтровали через стерильный марлевый фильтр с целью удаления частиц агара и разливали по пробиркам. Далее взвесь бактерий в пробирках инактивировали кипячением на водяной бане в 10 % растворе натрия хлорида при температуре (101+1) С в течение 2 ч. Длительное прогревание, помимо инактивации микроорганизмов, обеспечивало и разрушение термолабильных антигенных веществ (жгутикового Н-антигена). После охлаждения микробную взвесь концентрировали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20-30 мин и дважды отмывали 0,9 % раствором натрия хлорида рН 7,2 тем же способом. Осадок отмытых микробных клеток ресуспендировали в 0,9 % растворе натрия хлорида рН 7,2, доводя взвесь до концентрации 50-70 млрд м.к./мл и разливали по ампулам. Специфическую активность О-антигена проверяли в пробирочной РА с гомологичной коммерческой холерной сывороткой 0139. Для иммунизации кроликов использовали О-антиген, взаимодействующий с сывороткой в реакции агглютинации в титре не ниже, чем 1:200. Приготовленный корпускулярный антиген хранили при температуре 4 С в течение 1 года. При иммунизации корпускулярными антигенами развивающийся иммунный ответ является суммарным на многие содержащиеся в целой микробной клетке антигенные детерминанты, что способствует повышению содержания в сыворотках неспецифических антител. В этой связи в качестве альтернативных иммуногенов были исследованы растворимые антигены, представляющие собой препараты ЛПС, полученные из штамма V. cholerae 0139 МО-45 путем экстракции трихлоруксусной кислотой по методу A. Boivin et ah (160) и способом ультрафильтрации безмикробного формалинизированного супернатанта штамма V. cholerae 0139 МО-45 (29, 30, 31). В основу метода ультрафильтрации положено то, что водорастворимый О-антиген, содержащийся в культуральной жидкости, концентрируется на полых волокнах и при этом происходит его освобождение от компонентов среды и низкомолекулярных продуктов жизнедеятельности клеток. Ультрафильтрация исключает применение химических агентов для выделения О-антигена. Исходным материалом для получения О-антигена из холерного вибриона 0139 МО-45 явился формалинизированный центрифугат бульонной культуры (ФЦБК), выращенной в течение (10 + 2) ч на бульоне казеиновом или Хоттингера методом глубинного культивирования. Микробные клетки и балластные белки осаждали путем снижения рН до (4,4 + 0,2) и удаляли центрифугированием при (10500 + 2500) об/мин. Фазовое состояние О-антигена при этом не изменялось - он оставался растворенным в центрифугате и содержание его было на прежнем уровне. Конечное содержание формалина в препарате составляло (0,25 + 0,05) %, рН (7,0 + 0,2). Мембранную ультрафильтрацию центрифугата проводили на высокотехнологичной автоматизированной установке АУФ-01 (г. Нижний Новгород) через полые стекловолокна, пропускающие частицы с молекулярной массой 100 кДа и менее. Одновременно с очисткой О-антигена от неспецифических примесей происходило и его концентрирование в 20 раз. Концентрированный раствор О-антигена очищали от оставшихся высокомолекулярных неспецифических примесей (протеаза, фосфатаза) путем разделительной хроматографии в TSK-геле HW-60, который обладает большой механической стабильностью и обеспечивает высокоскоростное выделение антигена при минимальном разведении. Серологическую активность препарата определяли в реакции иммунодиффузии в геле микрометодом, внося по 0,01 мл в лунку, и выражали в условных единицах, соответствующих обратному титру в РИД, рассчитанному на 1 мл материала (хЮО). По данным РИД, титр антигена при использовании холерной 0139 тест-сыворотки составлял 400 - 800 у.е./мл. В качестве тест-сыворотки использовали экспериментальную неадсорбирован-ную холерную 0139 кроличью сыворотку. Полученный растворимый О-антиген характеризовался липополисахаридопротеиновой природой, LD5o для мышей составляла 2,4 мг. Итак, в качестве иммуногенов для получения гипериммунных холерных 0139 сывороток нами были отобраны два вида корпускулярных О-антигенов, приготовленных на основе капсульного и бескапсульного вариантов штамма V. cholerae 0139 Р-16064, и два варианта растворимых О-антигенов на основе штамма V. cholerae 0139 МО-45, полученных методом A. Boivin et al. и ультрафильтрацией на полых волокнах.
Сравнительная характеристика эффективности методов фракционирования холерных 0139 кроличьих иммуноглобулинов
Таким образом, применение в качестве иммуногена бескапсульных вариантов штамма V. cholerae 0139 Р-16064, безусловно, позволило получить более активные сыворотки. Однако, высокое содержание перекрестнореагирующих антител не позволило рассматривать данные сыворотки как сырье для получения высокоспецифичных холерных 0139 флуоресцирующих иммуноглобулинов. В связи с этим были проведены исследования с целью изучения эффективности применения в качестве иммуногенов растворимых антигенов. Иммунизация продуцентов ЛПС индуцирует выработку антител к О-специфической полисахаридной цепи, но не к кору или липиду А, на которых находятся общие группоспецифические антигены. В интактной молекуле ЛПС они закрыты О-цепью и иммунологически не активны. Вероятно, традиционное приготовление корпускулярного О-антигена путем кипячения может приводить к образованию частично деградированного олигосахарида и обнажению участков ЛПС, содержащих группоспецифические антигенные детерминанты, которые становятся иммунореактивными и индуцируют выработку перекрестнореагирующих антител (80). Именно поэтому при выборе иммуногена большой интерес для нас представляли растворимые антигены с максимально сохраненной нативной структурой О-антигена.
При сравнении иммуногенной активности О-антигена Буавена и О-антигена, полученного методом ультрафильтрации, выявлены преимущества второго в показателях активности при использовании схемы иммунизации № 4 - соответственно (400 + 0) и (666 ± 67) (табл 8). Видимо, воздействие на О-антиген химическими агентами, в частности, трихлоруксусной кислотой, не позволяет в полной мере сохранить его иммуногенную активность. О-антиген, выделенный методом ультрафильтрации из формалинизированного безмикробного супернатанта штамма V. cholerae 0139 МО-45, характеризовался неизменностью своей первоначальной нативной структуры на всех этапах выделения (29, 30) и, как следствие, высокой иммунногенностью. Как и в случае иммунизации продуцентов корпускулярными антигенами, при иммунизации растворимым О-антигеном, выделенным методом ультрафильтрации, более эффективной оказалась схема, предусматривающая только внутривенное введение антигена. При таком способе иммунизации были получены самые активные сыворотки - величина содержания специфических антител в них составила (800 + 0) (табл. 8). Таким образом, в результате экспериментов было установлено, что внутривенное введение О-антигена, полученного методом ультрафильтрации, индуцирует наибольшую выработку специфических антител по сравнению с корпускулярными О-антигенами (рис. 1), что совпадает с результатами проводившихся параллельно исследований других авторов (180, Терешкина Н.Е., 2005).
При выборе оптимальной схемы иммунизации животных важно было создать такие условия (доза антигена, кратность инъекций), которые привели бы к значительному преобладанию уровня специфических антител над неспецифическими.
При иммунизации кроликов растворимым О-антигеном, полученным методом ультрафильтрации, были использованы три различные схемы. Результаты сравнения активности и специфичности полученных иммунных сывороток показали, что наиболее эффективна схема иммунизации № 6 (табл. 6) - трехкратное введение возрастающих доз антигена -2-4-8 мг с интервалом между инъекциями 4 дня и последующим повторным циклом иммунизации через месяц по такой же схеме (табл. 8). Специфическая активность сывороток, полученных при такой схеме иммунизации - (743 + 164), была сравнима с активностью сывороток, полученных при иммунизации по схемам №№ 4 и 5 - (666 + 67) и (800 + 0), однако, титр гетерологичных антител в этих сыворотках был значительно ниже - (129 + 19), (211 + 39) и (533 + 136), соответственно, что наглядно демонстрирует рис 2.
Таким образом, на данном этапе исследований при сравнении различных схем иммунизации доказано, что оптимальной является двухцикловая схема, в результате которой получены агглютинирующие сыворотки к V. cholerae 0139, которые характеризовались достаточно высокой активностью при низком уровне содержания неспецифических антител, что позволило рассматривать данные сыворотки в качестве сырья для получения препарата флуоресцирующих иммуноглобулинов к V. cholerae 0139.
Изучение влияния температурного режима и сроков хранения на основные свойства холерных флуоресцирующих имму ноглобулинов
Несмотря на то, что в настоящее время разработан ряд эксперименталь ных диагностикумов и тест-систем для индикации и серологической идентификации V. cholerae 0139, единственным сертифицированным препаратом для детекции данного патогена, которым оснащены практические лаборатории Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и других организаций, осуществляющих мониторинг эпидблагополучия территории Российской Федерации, является холерная 0139 кроличья адсорбированная сухая сыворотка для реакции агглютинации на стекле. Коммерческий выпуск других диагностических препаратов и ПЦР-тест-систем для подтверждения принадлежности выделенных культур холерных вибрионов к 0139 серогруппе на сегодняшний день отсутствует.
Поскольку холерные вибрионы "Бенгал" являются эпидемически значимыми, применение высокоспецифичных иммуноглобулинов для скрининга данного патогена с помощью иммунофлуоресценции позволит повысить качество и надежность лабораторной диагностики холеры "Бенгал".
МФА широко применяется в микробиологической практике для обнаружения и идентификации бактерий благодаря высокой иммунологической чувствительности в сочетании с точностью микроскопического анализа (168, 169). МФА надежно зарекомендовал себя при диагностике V. cholerae Ol серогруппы (135, 136,143, 182,218). На следующем этапе работы было проведено определение активности экспериментальных серий иммуноглобулинов флуоресцирующих холерных 0139 адсорбированных кроличьих сухих, минимальной концентрации клеток V. cholerae 0139, которую можно выявить с их помощью (чувствительность метода), а также изучение специфичности препарата и оценка эффективности идентификации культур холерных вибрионов 0139 серогруппы методом прямой иммунофлуоресценции. Чувствительность МФА при приготовлении мазков непосредственно из взвеси холерных вибрионов 0139 серогруппы определяли по минимальной дозе, при которой обнаруживали не менее 1-5 светящихся вибрионов в каждом поле зрения. Все экспериментальные серии препарата в рабочем разведении (1:32-1:64) позволяли обнаруживать клетки холерных вибрионов 0139 в концентрации 1x105 м.кУмл - единичные клетки при просмотре 4-5 полей зрения, в то время как при концентрации холерных вибрионов 5х105м.к./мл обнаруживаются 1-2, реже 3, клетки в каждом поле зрения. Выявление холерных вибрионов в меньшей концентрации было возможным, но требовало значительного напряжения зрения исследователя и просмотра большого числа полей зрения. Таким образом, чувствительность прямого МФА с применением флуоресцирующих холерных 0139 иммуноглобулинов была определена в пределах 1x105 - 5x105 м.к./мл, что вполне соответствует общепринятым значениям чувствительности данного метода (28).
Для определения активности иммуноглобулинов были использованы вирулентные штаммы холерных вибрионов "Бенгал", выделенные от больных и вибриононосителей, - 22 штамма и штаммы V. cholerae 0139, выделенные из объектов внешней среды (из воды), - 20 штаммов. Специфичность препарата подтверждали на наборе штаммов, включающем холерные вибрионы различных серогрупп: 02-083 - 83 штамма, 01 -16 штаммов классического и эльтор биоваров сероваров Инаба и Огава и 2 штамма в R-форме, а также штаммы других родов семейства Vibrionaceae (Comamonas —3, Aeromonas — З, Plesiomonas shigelloides - 3), микроорганизмы семейства Pseudomonaceae {Pseudomonas — 3), семейства Enterobacteriacae {Yersinia enterocolitica — 2, Escherichia coli - 1, Shigella sonnei — 2, Salmonella typhimurium - 1, Salmonella paratyphi B- 1).
Результаты комиссионных испытаний трех экспериментальных серий иммуноглобулинов, представленные в таблице 14, свидетельствуют о том, что все указанные штаммы холерных вибрионов "Бенгал", независимо от источника выделения, вступали в реакцию с флуоресцирующими иммуноглобулинами, обеспечивая в разведении 1:64 - 1:128 флуоресценцию с интенсивностью на 4+ и 3+. В соответствии с оценками интенсивности свечения клеток холерных вибрионов 0139 серогруппы в различных разведениях (от 1:16 до 1:128) были комиссионно подтверждены значения красящих титров - 1:128 для серий 02 и 05 и 1:64 для серии 03, а также рабочие разведения препарата - 1:64 для серий 02 и 05 и 1:32 для серии 03.
Результаты, представленные в таблицах 14 и 15, свидетельствуют о том, что в проведенном испытании трех экспериментальных серий разработанного препарата эффективность выявления V. cholerae 0139 серогруппы составила 100 % независимо от источника выделения штаммов, а также подтверждают высокую специфичность нового препарата, поскольку ни с холерными вибрионами 01 и 02 - 083 серогрупп, ни с другими микроорганизмами, взятыми в эксперимент, не было зарегистрировано положительных реакций иммунофлуоресценции.
Таким образом, сконструированные на основе кроличьей холерной 0139 поликлональной сыворотки флуоресцирующие иммуноглобулины, предназначенные для детекции V. cholerae 0139, являются высокоспецифичными и позволяют выявлять в 100 % случаев (экспериментальные данные) вирулентные и авирулентные штаммы холерных вибрионов 0139 прямым МФА в соответствующих рабочих разведениях при отсутствии перекрестных реакций с микроорганизмами других таксономических групп.
