Введение к работе
Актуальность темы исследования
Туберкулез (ТБ) относится к числу инфекционных заболеваний, которые наносят значительный ущерб здоровью населения многих стран мира, поражая представителей всех рас и национальностей. В России в последние десятилетия отмечают рост заболеваемости туберкулезом: 34,0 случая на 100 тыс. населения в 1991 г., 90,7 - в 2000 г., 56,4 - в 2010 г. (WHO, 2011). Появляются новые нозологические формы и органные локализации туберкулезной инфекции: туберкулез селезенки (Azzam, 2013), поджелудочной железы (Vafa et al., 2013), центральной нервной системы (Delance et al., 2013), глаз (Yeh et al., 2012), спинальный туберкулез (Yuan et al., 2013). Все чаще регистрируется хроническое и латентное течение болезни (Druszczynska et al., 2012; Moon, Hur, 2013). Эти факты ученые связывают со способностью Mycobacterium tuberculosis переходить в дормантное (покоящееся) состояние (Kumar et al., 2013; Mariotti et al., 2013), которое позволяет микобактериям при определенных условиях реактивироваться в вегетативную форму (Gupta, Srivastava, 2012) и вызывать обострение хронической или латентной форм туберкулезной инфекции. Обострение болезни зачастую приводит к утяжелению течения болезни и увеличению летальности среди больных (Silva et al., 2010). В качестве факторов, активирующих туберкулез, могут выступать хронический стресс, голодание, прием иммуносупрессоров, а также наличие у пациента заболеваний, снижающих естественный иммунный статус (ВИЧ-инфекция, системные гематологические патологии, онкологические болезни) (Wake et al., 2013; Al-Anazi et al., 2007; Baka et al., 2013).
Показано, что активация хронического или латентного туберкулеза коррелирует со значительным изменением состава мембранных, цитоплазматических и секретируемых белков у реактивированных дормантных форм возбудителя болезни (Mylliemngap et al., 2012, Gupta, Srivastava, 2012). Особая роль при этом отводится мембранным белкам Rрf (resuscitation promoting factors), ответственным за «оживление» дормантных клеток M. tuberculosis (Капрельянц и др., 2004). В литературе описаны также случаи активации туберкулезного процесса у онкологических больных и у больных СПИДом, вакцинированных штаммом M. bovis BCG, в результате перехода клеток этого штамма из дормантного в вегетативное состояние (Bustamante et al., 2007; Lukacs et al., 2013; de Souza Campos Fernandes, Medina-Acosta, 2010). Подобные наблюдения дают основания некоторым исследователям ставить под вопрос безопасность дальнейшего использования вакцины BCG для профилактики туберкулеза (Mitchell, Scott, 1992). Тем не менее, вакцина BCG, представляющая собой аттенуированный штамм M. bovis, и сейчас продолжает оставаться единственной живой противотуберкулезной вакциной, способной обеспечить защиту вакцинированных детей от диссеминированного (милиарного) туберкулеза. Однако этот препарат не защищает взрослых людей от легочного ТБ, который на сегодняшний день является самой эпидемически опасной формой заболевания. Осложнения после применения вакцины BCG, которые, по классификации Международного союза по борьбе с туберкулезом ВОЗ (WHO, 1984) принято называть БЦЖ-инфекцией или «БЦЖитом» (BCGdisease, BCGitis) (Rook et al., 2001).
В настоящее время многие исследовательские группы в разных странах работают над созданием новых живых и химических противотуберкулезных вакцин на основе рекомбинантных штаммов и секретируемых белков возбудителя (Beresford, 2010; Dillon, 2000; Mori, 2004; Olsen, 2001; Roche, 1996). Особую актуальность приобретает разработка новых лечебных противотуберкулезных препаратов, воздействующих губительно не только на возбудителя инфекции, но и стимулирующих защитные свойства макроорганизма (Бельский и др., 2009).
Разработка и испытание новых противотуберкулезных лекарственных и профилактических средств для человека, как правило, предполагает предварительное тестирование этих препаратов на биологических моделях: in vitro – на искусственно культивируемых клетках и тканях теплокровных животных, и in vivo – на мелких и крупных животных разных видов.
Важная информация о развитии туберкулезного процесса была получена на культурах макрофагов и нейтрофиллов в 70-е гг. прошлого столетия и в последующие годы (Muroaka, Takeya, 1976; Nomoto et al., 1976; Brown et al., 1983; Nathan, Hibbs, 1991; Morris et al., 2013). В частности, выявлено, что в ответ на присутствие микобактерий фагоциты генерируют активные, с бактерицидными свойствами формы кислорода и NO*-радикалы, существенно влияющие на тяжесть течения болезни. Установлено, что именно высокий уровень естественного синтеза NO* в фагоцитах мышей обеспечивает данному виду животных более высокую, по сравнению с морскими свинками, устойчивость к заболеванию туберкулезом (Блум, 2002). Врачебные подходы, основанные на стимуляции системы «окислительного взрыва» фагоцитов с помощью новых противотуберкулезных лекарственных и профилактических средств, открывают новые возможности клиницистам позитивно влиять на течение инфекционный процесса у больного (Shiloh et al., 1999; Пальцев, 2004).
Животные модели ТБ-инфекции используют для воспроизведения различных форм ТБ инфекции, изучения патоморфологических изменений органов и тканей в инфицированном организме, для тестирования эффективности новых вакцин и методов лечения туберкулеза, выяснения причин неудач клинической терапии и других целей (Smith et al., 1989; vanMiert et al., 1995; Каркищенко, 2004; Apt et al., 2011). При этом для решения конкретных задач используют разные виды и линии животных, а также варьируют способы их заражения (Барри, 2002). Весьма сложной задачей в области применения животных моделей для воспроизведения туберкулезной инфекции является моделирование хронической и латентной форм туберкулеза (предмет наших исследований). По мнению Apt et al. (2011), наиболее приемлемым для моделирования хронического и латентного туберкулеза является низкодозовое аэрозольное инфицирование животных. Однако использование данной модели ТБ инфекции ограничивается высокой стоимостью оборудования (аэрозольных установок) и сложностью обеспечения безопасности экспериментов. Кроме того, к недостаткам аэрозольного инфицирования можно отнести значительные колебания «разброса» в заражающих дозах, получаемых отдельными особями одной экспериментальной партии.
Поэтому поиск животной модели для воспроизведения хронического и латентного туберкулеза представляется весьма актуальной задачей для исседователей этого опасного для человека заболевания.
Цель исследования
Целью настоящего исследования является разработка новой мышиной модели хронического туберкулеза и ее использование для изучения патогенеза указанной формы болезни, поиска и оценки новых противотуберкулезных препаратов профилактического и терапевтического назначения, а также использование других видов животных и моделей для исследования туберкулезной инфекции.
Задачи исследования:
1. Разработать новую, удобную для исследователей, модель хронического туберкулеза на мышах линии C57Bl и сравнить ее с другими моделями туберкулезной инфекции.
2. На разработанной мышиной модели изучить реактивацию хронической туберкулезной инфекции при воздействии на организм больных животных иммуномодуляторами: липополисахаридом Escherichia coli, аминогуанидином, анти-ФНО моноклональными антителами.
3. Изучить на разработанной мышиной модели хронического туберкулеза реактивацию инфекции, вызванной мутантными вариантами штамма M. tuberculosis H37Rv, нокаутными по генам секретируемых белков rpf (resuscitation promoting factors), под воздействием перечисленных выше иммуномодуляторов.
4. На мышиной «аэрозольной» модели туберкулезной инфекции изучить вирулентные свойства мутантных вариантов штамма M. tuberculosis H37Rv, нокаутных по двум-четырем генам rpf.
5. На мышиных «аэрозольной» и «внутривенной» моделях туберкулезной инфекции оценить протективные свойства нокаутного штамма M. tuberculosis H37Rv rpfA rpfB rpfC rpfD как возможного кандидата для создания противотуберкулезной вакцины.
6. На «внутривенной» мышиной модели и на «аэрозольной» модели морских свинок провести испытание экспериментальных образцов новых субъединичных кандидатных противотуберкулезных вакцин «Ag85A-DBD» и «ESAT6-DBD», являющихся комплексными субстанциями, включающими в себя антигены микобактерий Ag85 и ESAT-6, «слитые» с декстран-связывающим доменом DBD, в смеси с адъювантом (декстран 500), по схеме «prime-boost».
7. На клеточной модели «окислительного взрыва» фагоцитов изучить эффективность препаратов липосомированных эфирных масел растений (ЛЭМР) как стимуляторов данного биологического феномена.
8. На моделях хронического туберкулеза у мышей и острого туберкулеза у морских свинок провести испытание спреевых форм липосомированных растительных эфирных масел как профилактических и терапевтических средств.
9. Оценить эффективность применения препарата липосомированных эфирных масел раститений, изученных на биологических моделях, в качестве профилактического и терапевтического противотуберкулезного средства в лечебно-профилактических учреждениях Московского региона.
Научная новизна
Впервые, с помощью разработанной мышиной модели хронической туберкулезной инфекции, подтверждена роль секретируемых белков Rpf в реактивации хронического туберкулеза в острый инфекционный процесс. Показано, что хронический туберкулез, формирующийся у мышей линии C57Bl после их заражения микобактериями внутрибрюшинно, по сравнению с другими биологическими моделями туберкулезной инфекции (хроническая и острая ТБ инфекция у мышей после аэрозольного заражения, острая инфекция ТБ у мышей после ретроорбитального заражения), характеризуется более постоянными показателями обсемененности паренхиматозных органов M. tuberculosis H37Rv (разброс показателей КОЕ патогена в легочной ткани разных животных в группе не превышает 20 – 30 %) и минимальным уровнем летальности инфицированных мышей (около 10 % животных за 18 мес.)
Впервые экспериментально показано, что нокаутные по двум-четырем генам rpf штаммы M. tuberculosis H37Rv в разной степени способны к реактивации в организме модельных мышей линии C57Bl, подвергнутых воздействию липополисахарида E. coli, аминогуанидина и анти-ФНО моноклональных антител: наибольшая активация зафиксирована у «двойных» мутантов, в меньшей степени – у «тройных» и полностью отсутствует у «четверных» мутантов.
Впервые на мышиной «аэрозольной» модели показана разная степень аттенуации «двойных», «тройных» и «четверных» нокаутных мутантов по генам rpf штамма М. tuberculosis H37Rv. Максимально аттенуация выражена у «четверного» мутанта M. tuberculosis H37RvrpfA rpfB rpfC rpfD.
Впервые показано, что нокаутный мутантный штамм M. tuberculosis H37Rv rpfA rpfB rpfC rpfD, утративший вирулентность и неактивирующийся в макроорганизме при иммуносупрессии, способен обеспечивать лабораторным животным защиту от заражения вирулентным штаммом M. tuberculosis H37Rv и может быть рекомендован в качестве кандидатного штамма для создания живой противотуберкулезной вакцины.
Впервые показана эффективность новых субъединичных кандидатных противотуберкулезных вакцин нового поколения «Ag85A-DBD» и «ESAT6-DBD», при их применении на втором этапе вакцинации (после иммунизации BCG) по схеме «prime-boost».
Впервые на моделях первичных культур нейтрофилов и макрофагов показан феномен активации «окислительного взрыва» фагоцитов липосомированными эфирными маслами растений; продемонстрирован лечебный противотуберкулезный эффект при аэрозольной обработке ЛЭМР мышей, больных хроническим туберкулезом и профилактический противотуберкулезный эффект спреевых форм ЛЭМР в экспериментах на морских свинках. Впервые получены данные об эффективном использовании ЛЭМР при аэрозольной обработке воздуха в лечебно-профилактических учреждениях Москвы и Московской области, основанные на анализе показателей микробной чистоты воздуха, а также клинических показателей больных туберкулезом пациентов (вес тела, формула крови, содержание возбудителя в мокроте, интенсивность кашля и др.).
Теоретическая и практическая значимость работы
Создана новая биологическая модель для изучения ТБ - хроническая туберкулезная инфекция у мышей, развивающаяся у них после внутрибрюшинного заражения клетками штамма M. tuberculosis H37Rv. Эта модель позволяет изучать особенности патогенеза хронического и латентного туберкулеза, механизмы активации инфекции под воздействием различных неблагоприятных факторов, а также проводить испытания новых кандидатных вакцинных штаммов. Разработаны и внедрены на учрежденческом уровне методические рекомендации: «Использование модели внутрибрюшинного заражения мышей для получения хронической туберкулезной инфекции», Оболенск, 2010 г., и «Порядок работы с аэрозолями наночастиц и микроорганизмов (с использованием установки Глас-Кол модели 099С А4224)», Оболенск, 2010 г.
Два штамма M. tuberculosis H37Rv, мутантные по генам rpf, rpfA rpfB rpfC rpfD и rpfA rpfB rpfC rpfЕ , обеспечивающие защиту мышей от туберкулезной инфекции, предложены в качестве кандидатов для создания живой противотуберкулезной вакцины нового поколения. Штаммы депонированы в коллекции «ГКПМ-Оболенск» (№ B-6857 и В-6857) (Федеральный уровень внедрения).
Получен патент РФ «Композиция из взвеси липосом для профилактики и лечения воздушно-капельных инфекций, в частности туберкулеза (варианты) и способ ее аэрогенной доставки» №2452470 (Федеральный уровень внедрения).
Результаты исследования использованы при разработке Методических указаний МУ 1.2. 2635-10. «Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов» – М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010 г. (Федеральный уровень внедрения); Санитарных правил «Безопасность работы с микроорганизмами 1-2 групп патогенности (опасности). Изменения и дополнения 1 к СП1.3.1285-03» М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010 (Федеральный уровень внедрения). Результаты изучения ЛЭМР применяются в практической работе лечебных учреждений Московского региона.
Данные экспериментальных исследований диссертационной работы используются в курсах лекций по магистерской образовательной программе «Нанобиобезопасность» Пущинского государственного естественно-научного института (ПущГЕНИ) и по программе Курсов повышения квалификации «Микробиология. Основы и особенности работы с биологическими агентами I-IV групп патогенности в научно-исследовательских лабораториях», «Химическая, биологическая и бактериологическая безопасность. Основы безопасной работы на биотехнологических и микробиологических производствах», «Инфекционные болезни. Основы биологической безопасности и практика работ с микроорганизмами I-IV групп патогенности».
Методология и методы исследования
Эксперименты, представленные в диссертационной работе, выполнены на основе комплексного использования методов микробиологии (микроскопии, культивирования микроорганизмов), иммунологии (иммуноферментного анализа, проточной цитофлуориметрии), биохимии (определение уровня лимфокинов в крови, электрофорез), биофизики (спектрофотометрия, хемолюминесценция, спектральный анализ), молекулярной генетики (полимеразная цепная реакция), биотехнологии (технология липосом), медицины (анализ клинических показателей состояния больных туберкулезом), математической статистики (статистическая обработка данных).
Положения, выносимые на защиту:
-
Разработанная in vivo-модель хронического туберкулеза, основанная на внутрибрюшинном заражении лабораторных мышей линии C57Bl клетками штамма M. tuberculosis H37Rv, позволяет изучать факторы, активирующие указанную форму болезни, оценивать возможность реактивации кандидатных вакцинных штаммов микобактерий, а также тестировать новые противотуберкулезные лекарственные препараты.
-
Способность нокаутных мутантов штамма M. tuberculosis H37Rv к реактивации в организме модельных животных в результате воздействия на последних иммуномодуляторами, а также уровнь аттенуации этих мутантов коррелируют с количеством инактивированных у них генов секретируемых белков Rpf, участвующих в реактивации дормантных форм туберкулезного микроба.
-
Аттенуированный, не способный реактивироваться в организме теплокровного животного под воздействинем иммуносупрессоров штамм M. tuberculosis H37Rv rpfA rpfB rpfC rpfD, обладает протективными свойствамии и может быть рекомендован в качестве кандидатного штамма для создания живой противотуберкулезной вакцины.
-
Вакцинация мышей по схеме «prime-boost», включающая в себя первичную иммунизацию («prime») живой противотуберкулезной вакциной BCG и последующие ревакцинации («boost») субъединичными противотуберкулезными вакцинами нового поколения, созданными на основе антигенных туберкулезных комплексов Ag85 и ESAT-6 и адъюванта декстрана 500, обеспечивает высокий уровень защиты экспериментальных животных от заражения туберкулезом на моделях морских свинок и мышей.
-
Липосомированные растительные эфирные масла при аэрозольном использовании обладают лечебным противотуберкулезным эффектом на модели хронического туберкулеза у мышей, а также профилактическим противотуберкулезным эффектом на модели острого туберкулеза у морских свинок.
-
Аэрозольная обработка помещений лечебно-профилактических учреждений препаратами липосомированных растительных эфирных масел обеспечивает улучшение показателей микробной чистоты воздуха, а также клинических показателей у туберкулезных больных (вес тела, формула крови, содержание возбудителя в мокроте, интенсивность кашля и др.).
Степень достоверности и апробация результатов
Материалы диссертации представлены на 13 Всероссийских и международных научных конф.х: IV международной конф. «НаноБио и другие новые и перспективные технологии», Пущино, 2007 г.; «Проблемы биобезопасности нанотехнологий», Москва, 2008 г.; Научно-практической конф. молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире», Оболенск, 2009 г.; 13-ой Международной Пущинской школе-конф. молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2009 г.; Международной конф. «Современные проблемы инфекционной патологии», Минск, 2009 г.; Московской международной научно-практической конф. «Биотехнология: экология крупных городов», Москва, 2010 г.; 14-ой Международной Пущинской школе-конф. молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2010 г.; 3-м Международном Форуме по нанотехнологиям, Москва, 2010 г.; VII Всероссийской научно-практической конф. «Молекулярная диагностика-2010», Москва, 2010 г.; III Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням, Москва, 2011 г.; 15-ой международной Пущинской школе-конф. молодых ученых «Биология – наука XXI века», Пущино, 2011 г.; 12-ом Международном форуме и выставке «Высокие технологии XXI века», Москва, 2011 г.; 51-th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Chicago, IL, USA, September 17-20, 2011 г.; Всероссийской молодежной конф. «Актуальные проблемы химии и биологии», Пущино, 2012 г.; 17-ой международной Пущинской школе-конф. молодых ученых «Биология – наука XXI века», Пущино, 2013 г.
Диссертация обсуждена и одобрена на межлабораторном научном семинаре ФБУН ГНЦ ПМБ «16» сентября 2013 г., протокол №____
Личный вклад в выполнение работы
Диссертационная работа выполнена лично автором; результаты, описанные в отдельных главах, получены в сотрудничестве с коллегами: лаборатории биологически активных наноструктур Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, зав. лабораторией д.б.н В.Г. Лунин; лаборатории электронной микроскопии ФБУН ГНЦ ПМБ, зав. лабораторией д.б.н В.Н. Герасимов; отдела иммунобиохимии ФБУН ГНЦ ПМБ, зав. отделом к.б.н. С.Ф. Бикетов; лаборатории биохимии стрессов микроорганизмов Института биохимии им. А.Н. Баха РАН, зав. лабораторией д.б.н., профессор А.С. Капрельянц; отдела особо опасных инфекций ФБУН ГНЦ ПМБ, зав. отделом к.м.н. А.Н. Мокриевич; ООО «РЕБИОН», научный консультант д.б.н. С.А. Чубатова.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 46 научных работ, в том числе 10 статей в рецензируемых изданиях, один патент, два методических документа Федерального уровня, три статьи в других изданиях и 30 тезисов сообщений на научных конференциях.
Объём и структура диссертации
Диссертация изложена на 250 страницах и содержит введение, обзор литературы, описание материалов и методов, пять глав собственных исследований, заключение, выводы и указатель литературы, включающий 100 отечественных и 160 зарубежных источников. Иллюстрации представлены 7 таблицами и 49 рисунками.
