Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 11
1.1. Значение нормальной микрофлоры пищеварительного тракта в иммунном статусе теплокровных 11
1.2. Механизмы действия пробиотических культур микроорганизмов (пробиотиков) в коррекции иммунного статуса организма хозяина. 24
1.3. Использование молочной сыворотки и микробных препаратов на основе вторичного молочного сырья в кормлении и профилактике желудочно-кишечных заболеваний сельскохозяйственной птицы ... 35
Экспериментальная часть 44
2.1. Материалы 44
2.2. Методы исследования 46
2.2.1. Отбор проб 46
2.2.2. Обогащение проб, выделение чистых культур и их первичная идентификация 47
2.2.3. Методы определения патогенности энтерококков 50
2.2.4. Методы определения антагонистической активности лактобацилл и энтерококков 52
2.2.5. Методы исследования культуральных физиологических и биохимических свойств лактобацилл и энтерококков 53
2.2.6. Исследование свойств штаммов при пассажах in vitro и лабораторном хранении 54
2.2.7. Методы исследования и условия подбора культур микроорганизмов для закваски и разработки технологии пробиотической кормовой добавки 55
2.2.8. Исследование готовой кормовой добавки 58
2.2.9. Клинические исследования и производственные испытания пробиотической кормовой добавки на суточных цыплятах- бройлерах 58
2.2.10. Расчет экономического эффекта от применения пробиотической кормовой добавки 60
2.2.11. Статистические методы обработки результатов экспериментов 61
2.3. Результаты исследований и их обсуждение 62
2.3.1. Схемы проведения исследований по выделению, отбору и изучению штаммов лактобацилл и энтерококков, обладающих пробиотическими свойствами 62
2.3.2. Селекция штаммов лактобацилл и энтерококков, обладающих пробиотическими свойствами 65
2.3.3. Исследование энтерококков на патогенность 72
2.3.4. Исследование и отбор культур по антагонистической активности 73
2.3.5. Изучение основных культуральных, физиологических и биохимических свойств культур лактобацилл и энтерококков 83
2.3.6. Исследование свойств штаммов при пассажах и хранении 89
2.3.7. Схема проведения исследований по разработке технологии пробиотической кормовой добавки 93
2.3.8. Подбор сочетания микроорганизмов для пробиотической кормовой добавки 93
2.3.9. Определение технологических параметров и режимов при получении пробиотической кормовой добавки 100
2.3.10. Исследование готового продукта (пробиотической кормовой добавки) и изменений его свойств при хранении... 106
2.3.11. Клинические исследования и производственные испытания пробиотической кормовой добавки 108
2.3.12. Экономическая эффективность от применения пробиотической кормовой добавки 116
Заключение 118
Выводы 126
Список использованных литературных источнников 127
- Значение нормальной микрофлоры пищеварительного тракта в иммунном статусе теплокровных
- Использование молочной сыворотки и микробных препаратов на основе вторичного молочного сырья в кормлении и профилактике желудочно-кишечных заболеваний сельскохозяйственной птицы
- Обогащение проб, выделение чистых культур и их первичная идентификация
- Селекция штаммов лактобацилл и энтерококков, обладающих пробиотическими свойствами
Введение к работе
Актуальность работы
В промышленном птицеводстве, в последнее время, ведущую роль в гибели молодняка стали занимать желудочно-кишечные заболевания бактериального происхождения (Гусев и др., 2003). Попытки контролировать проблему путем чередования схем применения антибиотиков и химических препаратов, в том числе нового поколения, не только не дали желаемого результата, а напротив, усугубили ее. Мировой опыт применения антибиотиков показал, что в данной ситуации они не обладают должной эффективностью, а штаммы многих возбудителей кишечных инфекций, циркулирующие в хозяйствах, приобрели множественную лекарственную резистентность к антибиотикам (Тараканов, 2000; Малик, Панин, 2001; Schoeni et. al 2002). В свою очередь это влечет к возможности длительного их персистирования в организме птицы и создает предпосылки для передачи возбудителя от птицы к человеку (Клименко, 2002; Булатов, 2003).
Таким образом, проблема профилактики и лечения кишечных инфекций сельскохозяйственной птицы, возбудителями которых являются условно-патогенные микроорганизмы, имеет не только экономическое, но и социальное значение (Хапугин и др., 1999).
Ужесточение требований к экологической безопасности продукции животноводства заставило во всем мире пересмотреть многие методические подходы к вопросам оптимизации контроля над эпизоотическим процессом болезней, возбудителями которых является условно патогенная микрофлора и признать необходимость разработки нового поколения экологически безопасных препаратов, способных занять свое место в системе мероприятий по обеспечению биологической защиты сельскохозяйственных животных и птицы (Лизько, 1999).
Наиболее полно этим требованиям могут отвечать пробиотические кормовые добавки и препараты, в состав которых входят живые бактерии из
-7-числа основных представителей нормального кишечного микробиоценоза животных и птицы, такие как лактобациллы, бифидобактерии, энтерококки (Малик, Панин, 2001; Глушанова, Блинов, 2002; Fuller, Gibson, 1998).
Актуальная потребность в пробиотических кормовых добавках и препаратах привела к тому, что для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний у сельскохозяйственных животных и птицы стали использовать медицинские препараты, содержащие в своей основе штаммы микроорганизмов-пробионтов, выделенных от человека, и показавшие недостаточную эффективность вследствие отсутствия у них видоспецифичности (Павлова, Киржаев, Лапинскайте, 2002).
Ввиду этого представляется целесообразным разработка пробиотических кормовых добавок и препаратов, в том числе и на основе молочного сырья с использованием культур, выделенных от сельскохозяйственных животных и птицы для использования в ветеринарии.
Проблема рационального использования молочного сырья неразрывно связана с эффективной переработкой молочной сыворотки. Данный вопрос рассматривался в Международной молочной федерации (ММФ) и, неоднократно, на международных молочных конгрессах. Молочная сыворотка обладает пищевой и биологической ценностью, является богатой питательной средой для роста микроорганизмов. В то же время промышленной переработке подвергается только около 20% всего объема. Одной из причин такого нерационального использования служит недостаток эффективных технологий ее переработки (Ковтунова, Бушуева, Пинаева, 1985; Храмцов, 1990; Шиллер, 1983; Шильнаиков, Минакова, 1986; Мацерушка, 1998).
Цель работы - создание пробиотической кормовой добавки на основе молочной сыворотки с использованием микроорганизмов с выраженными пробиотическими свойствами из желудочно-кишечного тракта кур для применения в промышленном птицеводстве и разработка экспериментальной технологии ее получения.
-8-Задачи исследования:
Выделить от здоровой птицы активные культуры микроорганизмов-пробионтов родов Enterococcus и Lactobacillus t способных активно развиваться на молочной сыворотке.
Разработать технологию получения пробиотической кормовой добавки на основе молочной сыворотки с использованием отобранных культур микроорганизмов.
Определить эффективность от применения пробиотической добавки на суточных цыплятах-бройлерах в период формирования микрофлоры желудочно-кишечного тракта.
Научная новизна
По разработанным нами схемам впервые выделены штаммы микроорганизмов родов Enterococcus и Lactobacillus от сельскохозяйственной птицы, способные активно размножаться при культивировании на молочной сыворотке и обладающие пробиотическими свойствами.
Разработана экспериментальная технология производства пробиотической кормовой добавки на основе молочной сыворотки с использованием отобранных культур
Определена эффективность от применения пробиотической кормовой добавки на суточных цыплятах-бройлерах в период формирования микрофлоры желудочно-кишечного тракта.
Практическая значимость
Выделены перспективные для разработки пробиотических препаратов и кормовых добавок штаммы культур микроорганизмов родов Enterococcus и Lactobacillus.
Как один из способов рационального использования вторичного молочного сырья разработана экспериментальная технология производства пробиотической кормовой добавки на основе молочной сыворотки (подсырной и творожной) для применения на птицеводческих предприятиях.
-9-Предлагаемая к применению пробиотическая кормовая добавка позволяет снизить гибель цыплят в первые дни жизни и, кроме того, обогатить рацион питания по углеводному компоненту, минеральным солям, биологически активным веществам, микроэлементам и др.
Пробиотическая кормовая добавка использована в работе ОАО «Птицефабрика Михайловская»:
S акт о проведении клинических испытаний экспериментальной
пробиотической кормовой добавки на основе молочной сыворотки от 14
сентября 2003 г;
S акт о внедрении в промышленное птицеводство пробиотической
кормовой добавки на основе молочной сыворотки от 21 сентября 2003 г.
На защиту выносятся следующие положения:
Выделенные от кур штаммы микроорганизмов обладают пробиотическими свойствами и необходимыми ростовыми качествами.
Разработана экспериментальная технология производства пробиотической кормовой добавки на основе молочной сыворотки с использованием отобранных штаммов микроорганизмов.
Исследован процесс формирования отдельных групп нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта цыплят-бройлеров при применении разработанного продукта.
Применение пробиотической кормовой добавки при выращивании суточных цыплят-бройлеров в промышленных условиях показало профилактический и положительный экономический эффект.
Работа выполнена на кафедрах микробиологии и ветсанэкспертизы, и технологии молока и молочных продуктов Саратовского ГАУ им. Н.И. Вавилова в рамках темы основного направления работы кафедры технологии молока и молочных продуктов - «Комплексная переработка вторичного молочного сырья».
-10-Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на Межрегиональной научной конференции молодых ученых и специалистов системы АПК Приволжского федерального округа (Саратов, 2003), на Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов СГАУ, посвященной 115-летию со дня рождения академика Н.И. Вавилова (2002), на Международном симпозиуме Федеральный и региональный аспекты государственной политики в области здорового питания (Кемерово, 2002), на конференции в РосНИПЧИ «Микроб» Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте Микроб (Саратов, 2004).
Материалы диссертации представлены в отчетах НИР ИВМиБ в рамках ассоциации аграрного образования и науки за 2002-2003 г.г.
Публикации
По материалам диссертации опубликованы 5 работ.
Объем и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей материалы и методы, результаты исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Материалы диссертации изложены на 138 страницах машинописного текста, включая 14 рисунков, 23 таблиц. Список использованных литературных источников включает 118 наименований, в том числе 31 зарубежных.
Значение нормальной микрофлоры пищеварительного тракта в иммунном статусе теплокровных
Микрофлора пищеварительного тракта играет важную роль как в иммунном статусе так и в общем метаболизме макроорганизма. Благодаря целому ряду факторов, обусловленных ею, она играет роль барьера на пути проникновения различных инфекционных агентов в организм хозяина. Кроме того, благодаря своим ферментативным свойствам участвует в переработке значительного количества органических веществ, синтезирует белки, полипептиды, аминокислоты, антибиотики, витамины и другие ценные метаболиты (Сизова, 1974; Павлова, Киржаев, Лапинскайте, 1993).
В природных условиях формирование микрофлоры в пищеварительном тракте теплокровных, в том числе и птиц, вскоре после рождения является неизбежным. Однако, несмотря на чрезвычайно важную роль в жизнедеятельности макроорганизма, до настоящего времени нет ее классификации. Одни исследователи, используя в качестве основополагающих критериев количественные аспекты микрофлоры, подразделяют ее на главную, сопутствующую и остаточную (Пинегин и др., 1977). Принимая всю микрофлору, населяющую желудочно-кишечный тракт за 100 %, к главной (в основном бифидобактерии и бактероиды) относят около 90 %, к сопутствующей (лактобактерии, эшерихии, энтерококки и др.) - 10 %, к остаточной (клебсиеллы, цитробактерии, протеи, дрожжи, клостридии, стафилококки, аэробные бациллы и др.) - не более 1 %.
Другие авторы (Блохина, Дорофейчук, 1979) разделяют микроорганизмы, с которыми взаимодействует макроорганизм в процессе его жизнедеятельности, на четыре группы: I - микроорганизмы, появление которых в отдельных полостях носит случайный характер, так как они не способны к длительному пребыванию в таких условиях; II - бактерии, входящие в состав облигатных представителей нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта и выполняющие важную роль в активации метаболических процессов организма хозяина и защиты его от инфекции; III - микроорганизмы, достаточно часто встречающиеся у здоровых людей и животных, - в основном условно-патогенные бактерии, которые считаются представителями нормальной микрофлоры. Однако, при снижении резистентности макроорганизма и радикальных изменениях количественного и качественного состава микрофлоры именно эти бактерии выполняют чрезвычайную роль, они выступают в роли отягощающего звена при отдельных заболеваниях или как этиологический фактор, проводящий к возникновению болезней с разной степенью тяжести; IV - возбудители инфекционных болезней, которые встречаются в латентном или активном состоянии. В условиях резкого снижения количества облигатных видов микроорганизмов в желудочно-кишечном тракте они значительно активируют свои патогенные свойства, при этом основная роль отводится применению антибиотиков и воздействию стресс-факторв (Тимошко, 1990). Микрофлору здорового организма называют аутомикрофлорой, нормальной микрофлорой либо просто микрофлорой. Однако это далеко не одно и то же. О.В. Чахава (1984) предложил называть аутомикрофлорой микробную флору любого состава, имеющуюся у данного хозяина в конкретной ситуации, а нормальной - микрофлору характерную для здоровых представителей данной популяции. Таким образом, аутомикрофлорой является любая - дисбактериозная, нормальная и др. В эволюции взаимоотношений микроба и хозяина в большинстве случаев естественный отбор сохраняет особи, достигшие динамического равновесия между собой. Результат такого отбора - сформированная в филогенезе индигенная, или аутохтонная, часть нормальной микрофлоры, являющаяся открытым биоценозом, в составе которого кроме индигенных всегда находятся случайные и условно-патогенные виды, но в безопасных для здоровья хозяина количествах (Тараканов, 2000). По мнению экологов и микробиологов, микробные популяции подчиняются общим экологическим закономерностям (Clarke, 1977). Симбиоз между бактериями различных видов (например, в кишечнике) имеет многообразные формы: нейтрализм, конкуренция, антагонизм, паразитизм, коменсализм, мутуализм и др. Однако вопреки такому размаху вариабельности взаимоотношений микрофлора быстро превращается в очень стабильную популяцию, которая помогает организму хозяина сохранять устойчивость к желудочно-кишечным инфекциям. Этот феномен, описанный различными авторами, получил название «бактериальный антагонизм», «бактериальное вмешательство», «барьерный эффект», «колонизационная резистентность», «конкурентное исключение» (Платонов, 1975). Многочисленные исследования взаимоотношений макроорганизма и его нормальной кишечной микрофлоры свидетельствует о том, что последняя принимает участие в функциях сердечно-сосудистой, эндокринной, кроветворной, нервной и других систем хозяина. Таким образом, она играет важную роль в поддержании естественной резистентности организма (Воробьева, 1976; Ussier, 1905; Квасникова, 1948; Шубин и др., 1994; 1962; Huang, 1964; Barrow Р.А. et al., 1980; Jin L.Z., Ho Y.M., Abdullah W. 1997; Rigby, Pettet 1979; Rigby et al., 1980).
Известно, что у безмикробных животных кишечная стенка истончена и на треть уменьшена поверхность слизистой оболочки, повышены секреция желудочного сока и выведение ионов натрия. Отмечено снижение основного обмена, активности и скорости миграции эритроцитов по микроворсинкам, нарушены перистальтика и реактивность гладкой мускулатуры, функция гипофиза, надпочечников и поджелудочной железы (Куваева 1976; Панин, Маннапова 1999). Кроме того, у безмикробных животных недоразвита лимфоидная система, меньше иммуноглобулинов и в целом снижена активность иммунной системы из-за недостаточной антигенной стимуляции (Чахава, 1972; Интизаров, 1991).
Нормальная микрофлора желудочно-кишечного тракта большинства теплокровных качественно однотипна, отмечают лишь разное количество микроорганизмов того или иного рода в различных отделах пищеварительного тракта. Основу ее большинства, в том числе и у птиц, составляют неспорообразующие облигатно-анаэробные микроорганизмы. К ним относятся: бифидобактерии, лактобактерии, бактероиды, энтерококки, эшерихии, дрожжеподобные грибы.
Некоторые закономерности динамики заселения желудочно-кишечного тракта человека, животных и птиц микроорганизмами достаточно хорошо изучены. Установлено, что в кишечнике новорожденных в первые дни превалируют кокковая микрофлора и клостридии, затем начинают доминировать неспоровые анаэробные бактерии и к концу первого месяца жизни формируется микробная популяция, сходная с таковой у взрослых особей (Карпуць, 1995; Yeo, Kim, 1977; Шендеров, 1987). При этом большую часть этой популяции (80-90%) у здоровых моногастричных животных всех возрастов, птиц и жвачных животных до становления рубцового пищеварения составляют бифидобактерии. При их исчезновении снижается иммунологическая активность организма из-за нарушения процессов пищеварения, всасывания и всех видов обмена, понижается усвоение железа, кальция, страдает витаминсинтезирующая и ферментная функции кишечной микрофлоры (Пауликас, 1990; Сидоров, Субботин, 2002.).
Преобладание бифидофлоры в кишечнике, как правило, препятствует размножению патогенных и условно-патогенных бактерий, нормализуя микробиоценоз кишечника в целом. Антагонистическая активность бифидобактерии к патогенам определяется рядом факторов: образованием субстанций с антибиотической активностью; уксусной, молочной, муравьиной, летучих жирных кислот; конкурентноспособной адгезией на энтероцитах; иммуномодулирующей активностью. Из синтезируемых бифидобактериями аминокислот, на долю незаменимых приходится около 40% от их общего количества (Красникова, 1992; Костенко, 2002).
Использование молочной сыворотки и микробных препаратов на основе вторичного молочного сырья в кормлении и профилактике желудочно-кишечных заболеваний сельскохозяйственной птицы
Применение молочной сыворотки (в жидком виде) в птицеводстве, по имеющимся литературным данным, можно рассматривать в двух направлениях. Первое направление - это использование ее в качестве питательного компонента, которым можно обогатить рационы кормления, так как в ней содержатся (в зависимости от вида молочной сыворотки) в среднем воды 93±0.15% и сухих веществ, соответственно, - 6,65±0,15%, из которых приходится на долю лактозы - 71,7%, белковых веществ - 14%, минеральных веществ - 7,7%, жира 5,7% и прочих веществ - 0,9%. Кормовая ценность 1 кг свежей сыворотки составляет 0,13 к.е. (Шиловская, Бастрыкина, 1982; Храмцов, 1990).
Второе направление это - использование молочной сыворотки в качестве продукта для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний, обогащенного различными биологически активными веществами (ферментами, витаминами, аминокислотами), микроэлементами, молочнокислыми и другими микроорганизмами, а также их метаболитами, которые в совокупности положительно влияют на иммунный статус организма птицы.
Учитывая это необходимо отметить то, что сухие препараты, содержащие в своей основе обычно только лиофилизированные культуры микроорганизмов, эффективны в меньшем числе случаев их применения при профилактике и лечении желудочно-кишечных инфекций птицы. Кроме того, штаммы микроорганизмов, применяемых сухих препаратов зачастую не видоспецифичны для того организма, которому их вводят в корм, и их эффективность в этом случае зачастую бывает слабовыраженной (Глушанова, Блинов, 2002; Watkins, Kratcer, 1984; Fuller, 1984; Goodling, 1987; Jin, Ho, Abdullah, 1997).
В отличие от сухих жидкие препараты на основе молочного сырья (не обязательно вторичного) благодаря только наличию в них различных биологически активных веществ, и микробных метаболитов, даже при отсутствии видоспецифичности самих культур закваски могут оказывать на иммунный статус положительное действие опосредованно через нормализацию деятельности микрофлоры желудочно-кишечного тракта.
Так, установлено, что обогащение корма птицы (особенно цыплят) молочной кислотой (одним из компонентов кислой молочной сыворотки) способствует снижению рН, стимулирует пищеварение, способствует формированию микробиоценоза из представителей нормальной микрофлоры кишечника данного организма хозяина, оптимизирует витаминный баланс, улучшая, таким образом, усвояемость питательных веществ корма (Соколов, Андреева 1995).
Содержащаяся в молочной сыворотке лактоза (в среднем до 90% от всех углеводов сыворотки), из-за отсутствия у птицы специфического фермента -лактазы, выступает в роли стимулятора (фактора) роста бифидо- и молочнокислой флоры, которая метаболизируя ее в тонком и толстом отделе кишечника продуцирует в первую очередь молочную кислоту, а также другие вещества, способствующие повышению колонизационной резистентности кишечного тракта. Кроме того, лактоза, расщепленная микроорганизмами в желудочно-кишечном тракте на моносахара (глюкоза и галактоза), а также моносахара поступившие с сывороткой частично всасываются кишечником и участвуют в обменных реакциях организма птицы (Мартыненко, 2002).
Помимо упомянутых выше лактозы, глюкозы и галактозы в сыворотке обнаружены и аминосахара, в частности нейраминовая кислота и ее производные, в том числе сиаловая кислота, а также кетопентоза. В сыворотке содержатся серологически активные олигосахариды близкие к групповым веществам (L) крови. Из других углеводов обнаружены арабиноза, лактулоза и амилоид (Храмцов, 1990).
Известно, что аминокислоты, в первую очередь незаменимые, играют первостепенную роль в нормальном росте и развитии любых живых организмов. Установлено, что в молочной сыворотке имеются все незаменимые аминокислоты. Так, в подсырной сыворотке количество свободных аминокислот достигает в среднем 132 мг/л, в том числе незаменимых -51 мг/л, связанных с белками - 6490 мг/л, из них незаменимых - 3326 мг/л, а в творожной сыворотке свободных - 450 мг/л, из них незаменимых - 356 мг/л, связанных с белками - 5590 мг/л, из них незаменимых - 2849 мг/л. Связанные аминокислоты молочной сыворотки входят в состав двух белковых фракций -лактоальбуминовой, представленной р-лактоглобулином и а-лактоальбумином и иммуноглобулиновой. (Дубинская, Мещерякова, Орлянская, 1980; Храмцов, 1990).
В молочной сыворотке содержатся и необходимые для нормального течения всех обменных процессов в организме животного и птицы минеральные вещества и микроэлементы. Минеральный состав молочной сыворотки весьма разнообразен. В сыворотку переходят практически все соли и микроэлементы молока, а также соли, вводимые при выработке основного продукта. Микроэлементный состав молочной сыворотки представлен в первую очередь железом, цинком, медью, кобальтом, а также другими элементами (белее 20 наименований); ультрамикроэлементы - 16 названий. Из катионов в сыворотке преобладают калий, натрий, кальций, магний и железо; из анионов -радикалы лимонной и фосфорной кислот, а также хлор. В целом молочная сыворотка является продуктом с естественным набором жизненно важных минеральных соединений (Храмцов, 1990).
Положительно влияет на биохимические процессы, протекающие организме птицы и молочной жир, находящийся в сыворотке в Является пребиотиком. На ее основе разработана и успешно апробирована в животноводстве и птицеводстве кормовая добавка «Бикодо». диспергированном, а значит и в более физиологически доступном виде, чем в молоке. Его содержание в молочной сыворотке колеблется в пределах 0,05-0,45%, (Храмцов, 1990). В сыворотку переходят водо- и жирорастворимые витамины молока. Следует заметить, что водорастворимые витамины переходят почти полностью, и в подсырной сыворотке их значительно больше чем в творожной. Степень перехода жирорастворимых витаминов напрямую зависит от степени перехода жира. Так, средние значения содержания витаминов (мкг/кг) в творожной и подсырной сыворотке составляют соответственно (через дробь): каротина -75/13, витаминов А - 110/22, Е - 315/227, В2 - 263/315, В2 - 1107/1389, В6 -478/524, холина - 140000/160000, РР - 140/140, С - 500/500. Количество рибофлавина в сыворотке даже несколько больше, чем в молоке, что обусловлено жизнедеятельностью молочнокислых бактерий закваски. В целом молочная сыворотка по набору и абсолютному содержанию витаминов является биологически полноценным продуктом (Храмцов, 1990).
Обогащение проб, выделение чистых культур и их первичная идентификация
Все исследования при подборе культур лактобацилл и энтерококков для приготовления закваски осуществляли в соответствии с методиками, изложенными в справочнике Л.А. Банниковой с соавт. (1987).
Определение взаимоотношений между культурами отдельных штаммов лактобацилл и энтерококков осуществляли при сравнении их роста на обезжиренном молоке в смешанной популяции и в монокультурах. Количество культуры того или иного вида при внесении в молоко были равными и в монокультуре и в смешанной популяции. При этом учитывалось соотношение микроорганизмов в мазках, их количество (по методу Брида). Во внимание принимали сочетания, в которых используемые штаммы стимулировали развитие друг друга в сравнении с монокультурами, а время свертывания молока было на уровне или менее времени свертывания самой активной культуры сочетания (в нашем случае ацидофильной палочки).
Для установления характера влияния совместного выращивания культур (ранее определенных симбиотических сочетаний) на совокупную антагонистическую активность питательной среды (молочной сыворотки) дополнительно проводили исследование свойств антагонизма по одному из вариантов метода диффузии в агар (Гриневич, 1981). Сравнению подлежали активности жидких совместной культуры (сочетания) и монокультуры. Для контроля использовали неактивные культуры лактобацилл и энтерококков. При этом используемые тест-культуры возбудителей кишечных инфекций засевали в расплавленный ПЖА (10 мл) в пробирках и выливали в стерильные чашки Петри. После застывания ПЖА на его поверхности вырезали лунки диаметром 5 мм в которые вносили 0,1 мл испытуемой жидкой культуры (молочной сыворотки без сгустка) от монокультуры или сочетания или от контрольной культуры. Чашки инкубировали при температуре 37 С 24 часа, после чего учитывали результаты. По наличию и величине зоны задержки роста в слое ПЖА судили о присутствии и степени антагонистической активности культур.
Параллельно отобранные сочетания исследовались на предмет стабильности соотношения видов микроорганизмов с целью отбора наиболее стойких и установления возможного количества пересевов данных сочетаний. Для этого ежедневно проводили их пересевы по 1% в стерильное обезжиренное молоко до выявления значительного отклонения в их соотношении, допуская увеличение или снижение титра клеток какого-либо вида в пределах одного порядка. Кроме того отмечали время свертывания молока, что в дальнейшем позволяло судить и о постоянстве кислотообразующих свойств сочетаний. Количественно соотношение микроорганизмов оценивали по микроскопическому препарату, путем подсчета в поле зрения кокковых и палочковых форм.
Для оценки влияния совместного культивирования культур в установленных симбиотических сочетаниях на скорость свертывания молока исследуемую смешанную культуру второй генерации на стерильном обезжиренном молоке в количестве 3% вносили в колбу со стерильны обезжиренным молоком. В качестве контроля также в количестве 3% вносили в другую колбу с молоком монокультуру наиболее активного варианта исследуемого сочетания. После этого осуществляли термостатирование, отмечая время образования сгустка. Во внимание принимались сочетания свертывающие молоко быстрее или на уровне самого активного штамма, входящего в его состав.
С целью интенсификации процесса сквашивания молочной сыворотки нами были исследованы четыре значения температуры сквашивания (38, 40, 42 и 44 С). Контролю подлежали время сквашивания и постоянство соотношения видов испытуемых сочетаний. Во внимание брали температуру при которой процесс сквашивания проходил наиболее быстро, а постоянство соотношения видов сочетаний оставалось относительно стабильным.
При определении количества вносимой закваски по отношению к объему молочной сыворотки и температурного режима сквашивания руководствовались по возможности наиболее коротким временем сквашивания и целесообразностью количества закваски (не более 10%).
Выбор вида и режима тепловой обработки молочной сыворотки был обусловлен санитарными требованиями, предъявляемыми к производству пробиотиков (Степаненко, 2002).
Объем исследуемых образцов сырой молочной сыворотки во всех случаях составлял 100 мл. Эффективность режимов тепловой обработки оценивали по количеству остаточной микрофлоры в образцах, для чего проводили определение посторонней микрофлоры и БГКП по бродильному титру, который допускался не менее 100 мл. Определение посторонней микрофлоры осуществляли по микроскопическому препарату (метод Брида) и высевом на МПБ разведений продукта (101, 102, 103, 104 КОЕ). Все опыты проводились в трех повторностях.
В готовом продукте контролировали кислотность (активную и титруемую), КОЕ микроорганизмов закваски в 1 г продукта по видам, антагонистическую активность продукта в отношении тест-культур возбудителей кишечных инфекций, а также проводили санитарную оценку по результатам определения наличия посторонней микрофлоры и БГКП (по бродильному титру) (Степаненко, 2002; Банникова и др., 1987).
Определение антагонистической активности готовой пробиотической добавки и изменение ее в процессе хранения осуществляли по описанному в п. 2.2.7 варианту метода диффузии в агар.
Возможные сроки хранения пробиотической кормовой добавки устанавливали на основании изменения ее антагонистической активности, КОЕ микроорганизмов-пробионтов, их соотношения, титруемой кислотности в хранении при 4 и 20 С.
Определение безвредности пробиотической кормовой добавки осуществляли при даче ее белым мышам в течение 10-ти дней по 2 мл в день. Контрольная группа мышей получала водопроводную воду. При этом ежедневно отмечали общее состояние мышей, масса, поедаемость корма.
Селекция штаммов лактобацилл и энтерококков, обладающих пробиотическими свойствами
Как видно из приведенной таблицы большинство вариантов культур энтерококков не обладают указанными факторами патогенности в тестах in vitro. Фибринолитическая активность была выявлена только у трех вариантов культур, которые обладали Р-формой гемолитической активности.
Во внимание принимались только те культуры, которые не проявляли ни одной положительной реакции при постановке данных тестов.
Для определения патогенности в тесте in vivo было отобрано 46 культур (27 - Е. faecium 19 - Е. faecalis) давшие отрицательные реакции в тестах in vitro.
В течение 12-ти дней наблюдения за зараженными подопытными мышами падежа не наблюдалось. Общее состояние животных оставалось удовлетворительным. По истечении срока наблюдения производился вынужденный забой мышей. При вскрытии изменений внутренних органов не отмечалось. Патологических изменений состояния кишечника у особей опытных групп в сравнении с контрольными в основной массе (91,9%) не выявлено.
При высеве материала из желудка, тонкого и толстого отделов кишечника на поверхность энтерококкагара в целом в опытной группе отмечался обильный рост типичных колоний энтерококков, в то время как в контрольной был заметно беднее.
У 17 особей (8,1%) отмечалось незначительное вздутие тонкого кишечника и в разной степени гиперемия подходящих к нему кровеносных сосудов. При высеве содержимого тонкого кишечника таких особей на поверхность энтерококкагара в 11 (5,2%) случаях удалось выявить обильный рост типичных колоний энтерококков, что далее было подтверждено наличием роста культур отобранных колоний в МПБ с 40% желчи и рН 9,6 и микроскопией мазков по Граму. Культуры отдельных колоний давали (3-гемолиз.
В шести случаях (2,9%) энтерококки высевались в малых количествах, не давая обильного роста на поверхности среды или образовывали единичные колонии, при этом в двух случаях наблюдалось незначительное количество беловатого экссудата из которого не удалось высеять культуры энтерококков, а при просмотре мазков по Граму была выявлена посторонняя микрофлора.
Выраженного характера патогенности in vivo исследованных вариантов не выявлено. Таким образом, на основании совокупности проведенных тестов определение патогенности было отобрано в совокупности 46 вариантов культур энтерококков (27 - Е. faecium 19 - Е. faecalis) С целью отбора из вариантов лактобацилл и энтерококков активных антагонистов возбудителей кишечных инфекций нами были проведены -исследования на предмет наличия у изучаемых культур данных свойств. В ходе эксперимента по методу отсроченного антагонизма и по методу развивающихся смешанных популяций в сравнении с ростом тест-культур в монокультурах (далее по методу развивающихся смешанных популяций) было исследовано 23 варианта культур лактобацилл и 46 вариантов культур энтерококков. На рисунке 3 для наглядности представлены одни из наиболее показательных результатов полученные по методу отсроченного антагонизма. По результатам исследований антагонистической активности к тест-культурам (возбудителям кишечных инфекций и условно патогенным) исследованные варианты нами были условно разделены по активности. При этом ряд авторов отмечают, что малоактивными считаются культуры, образующие зоны задержки роста тест-культур в пределах 1-7 мм, средней активности - 7-12 мм, высокоактивными - более 12 мм (Гриневич, 1981; Банникова, 1975). При оценке результатов, полученных по методу развивающихся смешанных популяций считается, что малоактивные варианты подавляют развитие тест-культур до тысячи раз; средней активности - до десяти тысяч раз; высокоактивные - до ста и более тысяч раз (Ганина и др., 1999). При сопоставлении полученных данных по результатам двух методов коэффициент корреляции составил 0,87, что говорит о высокой сходимости результатов. Усредненные данные результатов двух методов представлены на рисунке 4. Из приведенного рисунка видно, что среди вариантов культур L. acidophilus наблюдается больший процент (4,58%) высокоактивных антагонистов к тест-культурам, чем среди E.faecium (3,63%) и E.faecalis (0,72%). В частности, по усредненным данным методов, 56,7% вариантов L. acidophilus проявляли выраженный антагонизм к S. aureus. Среди вариантов E.faecium наблюдался достаточно большой процент высокоактивных антагонистов к четырем патогенным серовариантам кишечной палочки: от 12,43% - к Е. coli 0:55 до 23,14% - к Е. coli 0:18 На основании приведенных результатов исследования антагонистической активности нами были отобраны три наиболее активных варианта культур L. acidophilus и восемь вариантов E.faecium. Среди вариантов культур E.faecalis не было обнаружено вариантов с широким спектром антагонистического действия к использованным тест-культурам.
