Введение к работе
Актуальность проблемы. Со второй половины XX века для решения многих теоретических и практических задач медицинской науки и здравоохранения начали активно использовать метод мониторинга (Стародубов В И. с соавт, 2003, Щепин О П., 2001, Петров Р В , 1995)
В медицине понятие мониторинг подразумевает систему наблюдений, анализа, оценки и прогноза состояния здоровья населения и среды обитания человека, а также определение причинно следственных связей между состоянием здоровья человека и воздействием факторов среды обитания человека (Стародубов В И с соавт., 2003)
Метод мониторинга широко используется при иммунологических исследованиях на популяционном уровне Петров Р В, Хаитов Р М. и их коллеги (Петров РВ. с соавт, 1992, 1995, Хаитов РМ с соавт., 1995, Орадовская ИВ, 1991, Черешнев В А, 2000) положили начало проводимым в разных регионах России исследованиям в области экологической иммунологии Результаты этих исследований позволят разрабатьшать методы предупреждения критических (неблагоприятных) воздействий разнообразных факторов внешней среды на здоровье людей, проживающих и работающих на территориях разного масштаба (предприятие, город, регион)
По результатам мониторинга, итогом вакцинопрофилактики в последние десятилетия XX века стала ликвидация полиомиелита в России, превращение массовых детских инфекций (дифтерия, коклюш, корь) в спорадические, а также существенное снижение заболеваемости вирусным гепатитом В, краснухой, паротитом (Покровский ВИ, Онищенко ГГ., Черкасский Б.Л, 2003г) Однако проблема инфекционных заболеваний как серьезной угрозы здоровью населения сохраняется и по прогнозам специалистов будет существовать впредь (Онищенко Г Г, 2007)
В последние годы возрастает внимание к условно патогенным микроорганизмам (УПМ), которые являются этиологическими возбудителями заболеваний человека. Так, Ecoli ассоциирована с 80% циститов в России (Страчунский Л С с соавт., 2002) S pneumoniae является возбудителем
внебольничных пневмоний в 30,5% случаев (Щерба Ю В. Гончарова И.В, 2005) По данным официальной статистики в нашей стране ежегодно регистрируется от 30 до 50 тыс случаев внутрибольничных инфекций, возбудителями которых, как правило, являются УПМ (Семина Н А с соавт, 2000, Ясинский А А с соавт, 2005)
В настоящее время хорошо аргументирована связь инфекционного процесса с пуском аутоиммунных реакций (Behar SM, Porcelh SA., 1995, Anders HJ et al, 2005; Fae K.C et al, 2005). Полагают, что условно патогенным микроорганизмам принадлежит существенная роль в индукции многих аутоиммунных состояний (Malkiel S. et al, 2000, Caballero E et al, 2001, Snider LA., Swedo SE, 2003, Gangi E et al, 2004, Newkirk MM. et al, 2005)
В свете изложенного становится очевидным, что мониторинг инфекций, вызываемых условно патогенными микроорганизмами, и исследование вероятности развития при этом аутоиммунных процессов представляет как теоретический, так и практический интерес Однако к началу наших исследований такого рода работы практически не проводились, поскольку не было системы, позволяющей одновременно определять антитела (AT) к широкому спектру УПМ и аутоантигенам основных органов человека Решению сформулированной проблемы посвящена наша работа При этом мы исходили из предположения, что решение такой задачи возможно при использовании твердофазного ИФА с сорбцией на отдельных стрипах полистирольного планшета различных антигенных (АГ) препаратов, что позволяет проводить комплексную оценку уровня антибактериальных антител и аутоантител
Целью исследования явилось создание и оценка эффективности иммуноферментной системы для одновременного мониторинга антител к антигенам условно патогенных бактерий и аутоантител к антигенам основных органов-мишеней и органонеспецифическим антигенам человека
Задачи исследования
1 Сформулировать и обосновать принципы создания скрининговых иммуноферментных тестов для мониторинга специфических IgG антител к
бактериальным и тканевым антигенам
2 Разработать на основе сформулированных принципов
иммуноферментную тест-систему для мониторинга IgG антител к условно
патогенным бактериям
3 Разработать иммуноферментную тест-систему для мониторинга IgG
антител к различным антигенам тканей органов человека и
органонеспецифическим антигенам
4. Провести мониторинг антител к условно патогенным бактериям и тканевым антигенам в различных группах клинически здоровых людей и работающих в экологически неблагоприятных условиях
5 Провести мониторинг антител к условно патогенным бактериям и тканевым антигенам в группах больных различными формами соматической и аутоиммунной патологии
Научная новизна
1 Впервые определены, научно обоснованы и реализованы принципы
разработки иммуноферментной системы для мониторинга широкого спектра
антител.
-использование в едином тесте модулей различной специфичности,
-применение антигенов, обладающих видовой (клеточные стенки условно
патогенных бактерий) и органной (микросомальные субклеточные фракции)
специфичностью,
-применение единого внутреннего контроля;
-применение единого способа выражения и оценки результатов ИФА
-
Впервые разработана система для мониторинга антител к условно патогенным бактериям и к тканевым антигенам Максимально унифицированная система впервые дает возможность определять специфические IgG антитела в едином тесте к антигенам 14-ти видов условно патогенных бактерий, 4-м органонеспецифическим и 11-ти антигенам органов-мишеней
-
Продемонстрирована перспективность использования разработанной
системы для мониторинга IgG антител у клинически здоровых людей, лиц,
работающих в экологически неблагоприятных условиях, лиц 65 лет и старше,
пациентов с различными формами соматической, аутоиммунной и эндокринной патологии
4. Впервые определены нормальные уровни IgG антител для каждого из антигенов системы, которым соответствуют показатели разности оптической плотности (ДОП) в сыворотках 90% клинически здоровых людей от -0,1 до +0,1 для тканевых и от -0,2 до +0,2 для бактериальных антигенов Показатели выше нормы были характерны не более чем для 5% лиц этой группы
-
Впервые показано, что разработанная система может быть использована для оценки влияния экологически неблагоприятных факторов Обследование работников подземных сооружений Московского метрополитена выявило двукратное увеличение частоты обнаружения повышенных уровней IgG антител одновременно к бактериальным и тканевым антигенам (у работников метрополитена 16,4% против 8,2% у доноров, р<0,05)
-
Впервые дана комплексная характеристика спектра антибактериальных и противотканевых антител при различных видах соматической и аутоиммунной патологии
показано преимущественное наличие повышенных уровней антител к конкретным видам условно патогенных микроорганизмов и/или тканевым антигенам;
выявлено наличие повышенных уровней антител к трем и более бактериальным и/или тканевым антигенам (от 17,0% до 34,4% при различных заболеваниях против 5,2% у здоровых к бактериальным и от 13,3% до 30,2% против 0% у здоровых к тканевым антигенам),
- выявлено наличие одновременно повышенных уровней антител к
бактериальным и тканевым антигенам (35,1% при аутоиммунных заболеваниях
против 8,2% у здоровых)
7 Показано, что аутоиммунные процессы являются составляющей патогенеза многих соматических заболеваний бронхолегочных, желудочно-кишечных, сердечно-сосудистых, мочевыводящей системы При этих заболеваниях наличие аутоантител сочеталось с выявлением антител к условно патогенным бактериям (например у больных колитом определяли антитела к
антигенам тканей толстого кишечника-58,8%, тонкого кишечника-41,2%,
почек-52,9% и клеточным стенкам Ecoh-23,5%, Р aeruginosa-41,2%, Р mirabihs-5%,%%)
8 Разработанная система позволила установить полиорганный характер органоспецифических аутоиммунных заболеваний выявлен высокий уровень аутоантител не только к антигенам органа-мишени, но и к другим органам и тканям
при сахарном диабете I типа- антитела к антигенам микросомальной фракции ткани поджелудочной железы, коллагену, эластину, почек, щитовидной железы, желудку, надпочечников,
при аутоиммунных заболеваниях щитовидной железы — антитела к эластину, коллагену, а также к микросомальным фракциям тканей щитовидной железы, желудка, надпочечников, поджелудочной железы
Практическая ценность
Разработана скрининговая тест-система для определения IgG антител- к антигенам клеточных стенок (КС) 14 представителей условно патогенных бактерий (S aureus, S epidermidis, S saprophyticus, Spneumoniae, Streptococus sp, Mluteus, Ecoli, P vulgaris, Pmirabihs, P aeruginosa, H influenzae, К pneumoniae, Y enterocohtwa, M catarrhahs); к 4 органонеспецифическим антигенам (н-ДНК, д-ДНК, эластин, коллаген), к 11 органоспецифическим антигенам (миокард, легкое, почки, печень, тонкий и толстый кишечник, желудок, гипофиз, щитовидная железа, поджелудочная железа, надпочечник)
Разработанную тест-систему можно использовать для контроля содержания антител к антигенам условно патогенных бактерий в сыворотке крови доноров, для эколого-иммунологического мониторинга лиц, проживающих и работающих в неблагоприятных условиях, выявления неблагополучия в состоянии иммунитета у лиц с различными заболеваниями, для наблюдения за эффективностью проводимого лечения, для выявления распространенности аутоиммунного процесса и его преимущественной направленности, в научных исследованиях в области биологии и медицины
Система прошла экспертизу и контроль в ГИСК им Тарасевича
Рекомендована Комитетом иммунобиологических препаратов к регистрации в
РФ (протокол №10 от 24 12 2003 г) Документация и система полностью готовы к производственному выпуску Лабораторные серии системы использованы для научных исследований в ГУ гематологический научный центр РАМН, ФГУ МНИИ глазных болезней им. Гельмгольца Росздрава и др Основные положения, выносимые на зашиту
1 Основными принципами создания систем для мониторинга IgG
антител к бактериальным и тканевым антигенам являются использование
широкого спектра антигенов, позволяющих проводить комплексную оценку
специфического гуморального иммунитета (мультимедийность); применение в
качестве антигенов условно патогенных бактерий клеточных стенок,
содержащих видовые антигены, а в качестве тканевых антигенов -
микросомальных фракций, содержащих основные органоспецифические АГ,
использование единого внутреннего контроля и единого способа выражения
результатов ИФА, позволяющих унифицировать оценку результатов
определения антител любой специфичности
-
Разработанная иммуноферментная система на основе антигенов 14 представителей условно патогенных бактерий, 4 органонеспецифических и 11 антигенов органов мишеней, обладает высокой чувствительностью (>90%), специфичностью (>95%) и надежностью (коэффициент вариации < 8%)
-
Мониторинг сывороток клинически здоровых людей свидетельствует, что более 90% сывороток имеют показатели разности оптической плотности (ДОП) от -0,1 до +0,1 для тканевых антигенов, и от -0,2 до +0,2 для бактериальных антигенов, что позволило принять указанный диапазон за норму Повышенный уровень AT к бактериальным, а также к тканевым АГ наблюдается, как правило, не более, чем в 5% случаев
4 Показатели адаптивного иммунитета у людей, больных
различными заболеваниями, достоверно отличаются от таковых у клинически
здоровых по спектру определяемых антител, по существенно меньшей доле
людей с нормальными показателями уровня антител к бактериальным и
тканевым антигенам (от 22,9% до 42,8% у больных и 67,5% у здоровых); по
количеству людей с повышенным уровнем антител к трем и более
бактериальным (от 17,0% до 34,4% у больных и 5,2% у здоровых) или
тканевым антигенам (от 11,6% до 30,2% у больных и 0% у здоровых), по частоте одновременного определения высокого уровня антител к бактериальным и тканевым антигенам (в 35,1% у больных АИЗ и в 8,2% у здоровых).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 51 печатная работа, из них 23 в журналах, рекомендованных ВАК РФ, получены 4 патента РФ на изобретения
Основные результаты работы доложены и обсуждены на Международном конгрессе «Современные методы диагностики и лечения аллергии, астмы и иммунодефицитов» (Тбилиси, Грузия, 1999 г.), III съезде иммунологов России (Сочи, 2000 г), заседании секции медицинской микробиологии и химиотерапии в МНИИЭМ им Габричевского (Москва, 2001г); 5-м конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2002 г), 3-ем Международном конгрессе по аутоиммунитету (Женева, Швейцария, 2002г); научно-практической конференции «Актуальные вопросы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия и охраны здоровья населения центрального региона России» (Смоленск, 2002 г), Российской научно-практической конференции «Эпидемиологический надзор и социально-гигиенический мониторинг» (Москва, 2002 г), IV, V и XI Всероссийских научных конференциях «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (С-Петербург, 2002, 2003, 2007гг); Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке» (Пермь, 2003 г), Объединенном иммунологическом форуме (Екатеринбург, 2004 г), 1-ой Международной научной конференции «Донозология 2005» (Санкт-Петербург, 2005 г), 1-ой Московской международной конференции «Естественный аутоиммунитет в норме и патологии» (Москва, 2005 г), 5-й международной конференции «Актуальные аспекты экстракорпорального очищения крови в интенсивной терапии» (Москва, 2006 г.); 6-м съезде гематологов и трансфузиологов Республики Беларусь (Минск, 2007 г)
Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 239
