Введение к работе
Актуальность темы.
Бактерии Bacillus cereus относятся к грамположительным факультативно-анаэробным, подвижным, спорообразующим, палочковидным бактериям, широко распространенным в окружающей среде (почве, пресной и морской воде, кишечнике беспозвоночных, на растениях и т.д.) и имеющим фенотипические и генетические (16S рРНК) признаки, сходные с рядом других видов бактерий рода Bacillus: B. mycoides, B. pseudomycoides, B. thuringiensis и B. anthracis (Rasko et al., 2005; Han et al., 2006; Auger et al., 2009). Бактерии B. cereus способны при определенных условиях вызывать у человека широкий спектр заболеваний, включающих пищевые токсикоинфекции, системные и местные гнойные инфекции, в т.ч. молниеносный сепсис, менингит, абсцесс мозга, эндофтальмит, пневмонию, эндокардит, остеомиелит, кожную инфекцию по типу газовой гангрены и т.д., а у животных – мастит крупного рогатого скота (Musa et al., 1999; Brett et al., 2005; Darbar , Harris and Gosbell, 2005; Avashia et al., 2007; Abusin et al., 2008; Orthop et al., 2008). Основные факторы патогенности B. cereus связаны с выделением разрушающих ткани реактивных экзоферментов: гемолизинов, фосфолипаз, токсина вызывающего рвоту и энтеротоксинов (HBL, NHE, и цитотоксина K) (Ghelardi et al. 2007; Arnesen et al., 2008; Edward, 2010).
Для подтверждения наличия бактерий B. сereus в пищевых продуктах и клинических образцах зарубежом пытаются использовать серологические (ИФА) и молекулярно-генетические (ПЦР) методы (Jung et al., 2011; Tallent et al., 2012). Наиболее распространенный (классический) метод идентификации этого вида бацилл основан на выделении чистой культуры на MYP среде Мозеля – желточный агар с маннитом, полимиксином и феноловым красным, и ее последующем биохимическом тестировании (Schulten et al., 2000; Food, 2000; Rhodehamel, Harmon, 2001). Однако нестабильность ферментативных реакций B. cereus затрудняют межвидовую дифференциацию бактерий первой морфологической группы рода Bacillus и, кроме того, требуют серьезных временных затрат (Глинская, Пермякова, 2004; Селенинов, 2008; Ефимочкина, 2010). В связи с этим, вопрос о разработке ускоренного достоверного метода идентификации бактерий B. cereus все еще остается актуальным.
Начиная с 2006 года сначала в США, а потом и в Европе все более широкое распространение получает теория использования бактериофаг-опосредованного биоконтроля в сфере санитарно-эпидемиологических мероприятий, проводимых в сельском хозяйстве, пищевой промышленности, пунктах общественного питания, ЛПУ и организованных коллективах (Алешкин и др., 2012). W.J. Lee (2011) и J.H. Lee (2012) продемонстрировали возможность включения специфических бактериофагов, литически активных в отношении бактерий B. cereus, в процедуры по деконтаминации продуктов питания. В Российской Федерации на сегодняшний день отсутствуют данные о созданных фаговых биопрепаратов, в том числе диагностических, специфичных в отношении бактерий B. cereus. Разработка бактериофаговой тест-системы позволит не только ускорить процедуру по идентификации бактерий B. cereus в продуктах питания и клинических образцах, но и даст возможность дифференцировать бациллы внутри данного вида на фаговары и фаготипы.
Цель работы – разработка системы фаговаров бактерий B. cereus для идентификации и мониторинга бактерий B. cereus в объектах санитарного надзора.
Задачи исследования:
-
Изучить биологические свойства, отработать методы идентификации и с их помощью определить уровень распространенности бактерий B. cereus в пищевых продуктах и объектах внешней среды.
-
Разработать оптимальную схему выделения бактериофагов B. cereus и изолировать с ее помощью новые штаммы.
-
Изучить основные биологические свойства (морфологию негативных колоний, литическую активность и ее спектр, специфичность, изменение литической активности при хранении) выделенных бактериофагов.
-
Разработать систему фаговаров B. cereus для идентификации и мониторинга данного микроорганизма.
-
Отработать пилотную технологию и произвести опытную партию набора диагностических биопрепаратов на основе бактериофагов B. cereus для определения фаговаров указанных бактерий.
-
Сконструировать алгоритм ускоренной идентификации бактерий B. cereus в пробах пищевых продуктов, включающий использование набора диагностических биопрепаратов на основе бактериофагов.
Научная новизна. Модифицирована схема выделения бактерий B. cereus и с ее помощью изучены показатели распространённости этого вида бацилл в пищевых продуктах и объектах внешней среды. Разработан способ выделения бактериофагов, позволивший изолировать новые штаммы, активные в отношении бактерий B. cereus. Создана система из 18 фаговаров бактерий B. cereus для идентификации и мониторинга данных микроорганизмов в объектах санитарного надзора. Отработана пилотная технология получения линейки диагностических биопрепаратов для определения фаговаров B. cereus.
Практическая значимость
Усовершенствованная схема классической идентификации бактерий B. cereus позволяет определять возбудителя с высокой достоверностью в срок, не превышающий установленный в ГОСТе 1044.8-88 «Продукты пищевые. Методы определения Bacillus cereus».
Разработанный алгоритм диагностики бактерий B. cereus с помощью набора специфичных биопрепаратов бактериофагов, не только сокращает до 52 часов процедуру идентификации, но и предполагает дополнительное типирование данного вида бацилл на фаговары.
Полученные в соответствии с пилотной технологией фаговые биопрепараты прошли производственные испытания в аккредитованной лаборатории ОГУ «Ульяновская областная ветеринарная лаборатория» и подтверждены актом производственных испытаний (30.10.2012), утвержденным директором Юсуповым Р.М.
Алгоритм ускоренной диагностики бактерий B. cereus с помощью специфичных бактериофагов послужил основой для разработки «Методических рекомендаций по ускоренной идентификации бактерий B. cereus в объектах санитарного надзора с применением специфических бактериофагов», рассмотренные на научно-техническом совете и утвержденные первым проректором – проректором по научной работе ФГБОУ ВПО «УГСХА им. П.А. Столыпина» (14.11.2012).
На основании отработанной пилотной технологии получения бактериофаговых биопрепаратов создана «Временная инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии индикаторных бактериофагов B. cereus» (14.11.2012), утвержденная первым проректором – проректором по научной работе ФГБОУ ВПО «УГСХА им. П.А. Столыпина».
Материалы диссертационных исследований используются при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий по биотехнологии, вирусологии, микробиологии для студентов факультета ветеринарной медицины, биотехнологического факультета Ульяновской ГСХА, а также размещенны в виде электронного ресурса на сайте научной библиотеки ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина».
Положения, выносимые на защиту:
-
Модифицированная схема выделения и идентификации B. cereus, позволившая изучить распространённость этого вида бацилл в пищевых продуктах и объектах внешней среды.
-
Методика выделения бактериофагов B. cereus, создание линейки фаговых биопрепаратов для выявления фаговаров указанных бактерий и пилотная технология их получения.
-
Алгоритм идентификации бактерий B. cereus с помощью специфичных бактериофагов, сокращающий процедуру идентификации до 52 часов и позволяющий типировать данный вид бацилл на 18 фаговаров.
Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А. Столыпина». Исследования были поддержаны: грантом Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере «Участник молодежного научно-инновационного конкурса» («УМНИК 2010»), грантом Федеральной целевой программы «Поддержка научных исследований, проводимых коллективами научно-образовательных центров по научному направлению «Наука о жизни (Живые системы)»» (Шифр лота 2012-1.1-12-000-2008, наименование «Бактериофаги, как природные биосенсоры для индикации и идентификации бактериальных агентов, вызывающих пищевые инфекции и порчу пищевого сырья»).
Апробация работы. Материалы диссертации были предъявлены на: I Международной научно – практической конференции молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» (Краснодар, 2007), Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы аграрной науки и образования», посвященной 65-летию Ульяновской ГСХА (Ульяновск, 2008), научно-практической конференции «Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных» (Покров,2008), Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения» (Ульяновск, 2009), конференции молодых ученых «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины» (Покров, 2009), 12-й региональной научной школе-семинаре «Актуальные проблемы физической и функциональной электроники» (Ульяновск, 2009), III Международной научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь и наука ХХI века» (Ульяновск, 2010), Международной научно-практической конференции «Задачи ветеринарной науки в реализации доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации» (Ульяновск, 2011), Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов прошлое, настоящее, будущее» (Москва, 2011), Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина ХХI века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения» (Ульяновск, 2011), III Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения» (Ульяновск, 2011), Международной научной конференции «Актуальные проблемы современной микробиологии» (Оренбург, 2011), конференции молодых ученых «Актуальные проблемы инфекционных патологий в ветеринарной медицине» (Покров, 2012).
Публикации. По теме диссертации опубликованы 17 работ, из них 3 статьи в журналах рекомендованных ВАК РФ.
Личный вклад соискателя состоит в планировании и проведении экспериментальных исследований в рамках диссертационной работы, обработке и интерпретации полученных результатов, подготовке публикаций.
Структура и объём диссертации. Работа изложена на 179 страницах текста, содержит 18 таблиц и 43 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающей объекты, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключения, выводов, практических предложений, перечня сокращений и условных обозначений, списка литературных источников (208 наименований, в том числе 89 отечественных авторов) и приложения.
