Введение к работе
Актуальность проблемы. Инфекции, вызванные условно патогенными микроорганизмами, в том числе Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus spp. в настоящее время представляют существенную проблему, как с клинических, так и с эпидемиологических позиций. Традиционными препаратами этиотропной терапии гнойно-воспалительных заболеваний являются антибиотики. Однако, применение антибиотиков сопряжено не только с гибелью патогенных агентов, поддерживающих инфекционный процесс, но и с подавлением нормальной микрофлоры человека, ее адгезивных свойств (Трапезов и др., 1990; Кушнарева, 2000). Вопрос об успешной профилактике и терапии гнойно-септических инфекций приобретает чрезвычайную актуальность в условиях формирования полирезистентности микроорганизмов к антибиотикам (Навашин, 1997; Савицкая и др., 2001; Green, 2001; Ducki et al, 2002; Clarke, 2003). В связи с этим интенсифицируются исследования по совершенствованию и разработке альтернативных методов лечения, в частности фаготерапии. Основными достоинствами препаратов бактериофагов являются высокая чувствительность патогенной микрофлоры к бактериофагам, сочетаемость со всеми видами традиционной антибактериальной терапии, отсутствие противопоказаний к фагопрофилактике и фаготерапии (Иванов, 2000; Лазарева, 2003; Sulakvelidze etal, 2001).
В сфере фагового производства актуальны задачи, связанные с конструированием новых препаратов и усовершенствованием технологического процесса, включая отбор и использование высокочувствительных штаммов-продуцентов, разработку питательных сред для культивирования бактериофагов, изготовление более широкой номенклатуры лекарственных форм. В условиях полиэтиологичности многих заболеваний, вызванных условно патогенными микроорганизмами, наиболее целесообразно создание поливалентных комбинированных бактериофагов (Бухарин, 1999; Рафиев, Сатаров, 2001; Хайруллин, 2003). Распространенными формами выпуска препаратов бактериофагов являются жидкие лекарственные формы и таблетированные фаги кишечной группы. В последние годы на фоне значительного увеличения объемов выпуска препаратов ведутся работы по созданию новых лекарственных форм (Георгадзе и др., 1997; Ананьев и др., 1999; Маркоишвили и др., 1999; Чубатова и др., 2000; Thacker, 2003; Sulakvelidse et al, 2004). Среди различных способов введения лекарств широкое распространение в медицинской практике получает ректальный способ, преимуществами которого являются: попадание лекарственного вещества непосредственно в общий кровоток, увеличение скорости
всасывания, уменьшение частоты аллергезирующего действия, простота, безболезненность введения, а также удобство использования в детской практике (Козлова и др., 1992). Целесообразность выпуска лекарственных форм бактериофагов для ректального введения, в том числе суппозиториев, диктуется также необходимостью сохранения литической активности фагов, так как при пер оральном приеме они в значительной степени инактивируются соляной кислотой желудочного сока.
Цель настоящей работы - создание композиции, изучение биологических свойств и разработка лекарственных форм комплексного фагового препарата на основе отобранных из клинического материала условно патогенных микроорганизмов-продуцентов бактериофагов.
Основные задачи исследования
Детально исследовать морфо-физиологические свойства выделенных из клинического материала штаммов-продуцентов бактериофагов (Е. coli, К1. pneumoniae, Pr. vulgaris, Pr. mirabilis, Ps. aeruginosa, St. aureus, Streptococcus spp.) и создать коллекцию из перспективных в производственном отношении микроорганизмов.
Оптимизировать и унифицировать условия производственного процесса репродукции бактериофагов.
Разработать способ получения комплексного фагового препарата и охарактеризовать его биологические свойства.
Получить лекарственную форму комплексного фагового препарата для ректального введения (суппозитории), исследовать ее фармакодинамику и эффективность применения в клинической практике.
Научная новизна. Проведено изучение морфологических, культуральных, биохимических свойств большой группы условно патогенных микроорганизмов, выделенных из клинического материала лечебных учреждений Пермского края. Произведен отбор штаммов - потенциальных продуцентов бактериофагов. Оптимизирован и унифицирован процесс репродукции бактериофагов на основе использования универсальной питательной среды (Патент RU 2247151 «Способ получения полибактериофага», приоритет от 06.05.2002). На основе высоковирулентных фагов (стафилококкового, стрептококкового, синегнойного, клебсиеллезного, протейного, коли) сконструирован поливалентный комплексный 6-компонентный препарат Секстафаг с широким спектром и высоким уровнем антибактериальной активности. Изучена фармакодинамика различных лекарственных форм Секстафага при пероральном и ректальном путях введения препарата.
Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представление о методических подходах к конструированию и изготовлению фаговых препаратов, включая постоянное обновление коллекции штаммов-продуцентов с изучением их свойств, репродукцию бактериофагов на универсальной питательной среде и особенности создания на их основе лекарственных форм.
Практическая значимость работы определяется разработанными эффективными микробиологическими и технологическими приемами, позволяющими адаптировать процессы изготовления бактериофагов к условиям массового производства препаратов, а также созданием нового комплексного фагового препарата, расширяющего арсенал антибактериальных лекарственных средств. Сформирована коллекция производственных микроорганизмов-продуцентов для изготовления моно - и комплексных препаратов бактериофагов. Разработана универсальная казеиново-кислотная среда, позволяющая получать препараты бактериофагов со сниженным содержанием балластных веществ. Предложен способ получения комплексного препарата, включающий раздельное культивирование отдельных компонентов с последующим объединением высокоактивных монофагов с заданными свойствами. Получены лекарственные формы препарата Секстафаг: жидкий препарат во флаконах и суппозитории ректальные на основе жидкого концентрата. Созданная технология используется в производстве препарата Секстафаг жидкий (получено более 270 промышленных серий). Результаты научной работы отражены в нормативной документации (регламент производства № 1105-01, фармакопейная статья предприятия 42-00282322-02 на бактериофаг стрептококковый жидкий; регламент производства № 1103-01, ФСП 42-0028270502 на Секстафаг (пиобактериофаг поливалентный) жидкий; экспериментально-производственный регламент, проект ФСП и проект инструкции по применению на Секстафаг суппозитории ректальные (пиобактериофаг поливалентный).
Положения, выносимые на защиту
Использование коллекции региональных штаммов-продуцентов бактериофагов (Е. coli, К1. pneumoniae, Pr. vulgaris, Pr. mirabilis, Ps. aeruginosa, St. aureus, Streptococcus spp.) и универсальной казеиново-кислотной питательной среды обеспечивает получение фаговых препаратов, обладающих высокой специфической активностью и низким содержанием балластных веществ.
Предложенный способ раздельного культивирования монофагов (стафилококкового, стрептококкового, синегнойного, клебсиеллезного, протейного, коли) с последующим объединением в единую лекарственную форму
с активностью не ниже 10" каждого компонента обеспечивает получение комплексного высоковирулентного препарата, обладающего выраженным этиотропным действием по отношению к условно патогенным микроорганизмам.
3. Лекарственная форма препарата Секстафага для ректального
применения (суппозитории), полученная по разработанной технологии, оказывает терапевтический эффект в лечебной практике и обладает более длительной динамикой выведения, чем жидкий препарат.
Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Научно - практической конференции «Вакцинопрофилактика в XXI веке», Пермь, 2000; Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», Томск, 2001; Международной научной конференции «Перспективы развития естественных наук в высшей школе», Пермь, 2001; Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке», Пермь, 2003; Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов», Томск, 2004; Всероссийской научной конференции «Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке: разработка, производство и применение», Уфа, 2005; Научно-практической конференции «Современная вакцинопрофилактика: проблемы и перспективы развития», Пермь, 2005; Научной конференции «Актуальные вопросы клинической медицины», Пермь, 2005; Научно-практической конференции «Трудные и нестандартные ситуации в хирургии. Новые технологии в медицине», Ижевск, 2006; Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование», Пермь, 2006; Международной научной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий», Томск, 2006; Международной Российско-китайской научной конференции по фармакологии «Fundamental pharmacology and pharmacy-clinical practice», Пермь, 2006; Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 2006.
По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ. Полученные результаты защищены патентом на изобретение РФ.
Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена на базе отделения бактериофагов и лаборатории бактериофагов в
соответствии с планом НИР филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед» (номер госрегистрации: 01.9.90 002643).
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 150 страницах, содержит 24 таблицы и 25 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, трех глав экспериментальных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 271 источник, из них 173 отечественных и 98 иностранных авторов.
