Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Основные биотехнологические методики производства медицинских иммунобиологических препаратов (обзор литературы) .
1.1. Питательные среды для культивирования микроорганизмов 29
1.2. Варианты глубинного культивирования, применяемые при производстве иммунобиологических препаратов 38
1.3. Ферментационное оборудование для культивирования микроорганизмов 43
1.4. Фильтрационные технологии в производстве МИБП 49
1.5. Современные направления усовершенствования противовирусных препаратов на примере средств для постэкспозиционной профилактики бешенства 60
1.6. Иммуноглобулиновые профилактические препараты: классификация и 66 технологии получения
ГЛАВА 2. Материалы и методы 78
2.1. Материалы 79
2.1.1. Штаммы микроорганизмов 79
2.1.2. Питательные среды, используемые в экспериментах . 79
2.1.3. Экспериментальные животные . 80
2.1.4. Реактивы 80
2.1.5. Приборы и оборудование . 84
2.2. Методы 86
2.2.1. Микробиологические методы 86
2.2.2. Биологические методы . 87
2.2.3. Биохимические методы 87
2.2.4. Химические методы 88
2.2.5. Физические методы 88
2.2.6. Физико-химические методы 89
2.2.7. Методы контроля гетерологичного антирабического иммуноглобулина.. 90
2.2.8. Методы математической и статистической обработки материалов 91
Собственные исследования 92
Глава 3. Конструирование питательных сред на основе сухого автолизата пекарских дрожжей для культивирования производственных штаммов холерного вибриона 92
3.1. Конструирование питательных сред на основе дрожжевого автолизата
для культивирования производственных штаммов V. сholerae 95
3.2. Применение питательных сред на основе дрожжевого автолизата для культивирования производственных штаммов V. сholerae . 101
3.3. Экономическая эффективность питательной среды на основе автолизата пекарских дрожжей 106
ГЛАВА 4. Разработка питательных сред для культивирования производственных штаммов v. cholerae на основе гидролизата фибрина 111
4.1. Получение ферментативного гидролизата фибрина . 113
4.2. Конструирование питательных сред на основе ферментативного гидро-лизата фибрина для культивирования штаммов V. сholerae 117
4.3. Сравнительный анализ питательных сред, полученных на основе гидро-лизата фибрина и традиционных сред в условиях глубинного культивирования 122
4.4. Исследования морфометрических показателей холерного вибриона, культивируемого на экспериментальных питательных средах 126
4.5. Экономическая эффективность питательной среды на основе гидролиза-та фибрина 129
ГЛАВА 5. Разработка биореактора для проведения процессов глубинного культивирования производственных штаммов холерного вибриона 133
5.1. Технические и конструкторские решения при создании экспериментального ферментера на базе реактора РЗРЯ-6/0,63 137
5.2. Определение массообменных характеристик аппарата для ферментации... 142
5.3. Исследование процессов культивирования штаммов холерного вибриона – продуцентов протективных антигенов вакцины холерной бивалентной химической 145
5.4. Сравнительный анализ препаратов протективных антигенов V. сholerae и холерной вакцины, полученных с помощью экспериментального и производственного биореакторов 149
5.5. Изучение физико-химических и иммунобиологических свойств холерной вакцины, произведенной по экспериментальной и традиционной технологиям 154
ГЛАВА 6. Оценка риска как основа обеспечения биобезопасности работ с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства. 157
ГЛАВА 7. Применение современных фильтрационных технологий в производстве антирабического иммуноглобулина и разработка принципиальной биотех нологической схемы, обеспечивающей качество препарата при изготовлении коммерческих серий 166
7.1. Разработка биотехнологической системы предварительной осветляющей фильтрация антирабического иммуноглобулина 167
7.2. Разработка технологического модуля для проведения ультрафильтрации антирабического иммуноглобулина 173
7.3. Конструирование фильтрационной системы для эффективного удаления гемпигмента и пирогенов из полуфабриката антирабического иммуноглобулина 178
7.4. Разработка системы стерилизующей фильтрации антирабического иммуноглобулина . 187
ГЛАВА 8. Разработка технологии получения f(ab’)2-фрагментов антирабического иммуноглобулина 196
8.1. Выбор оптимальных параметров ферментативного гидролиза антираби-
ческого иммуноглобулина 199
8.1.1.Определение оптимальной температуры проведения ферментативного 200
гидролиза антирабического иммуноглобулина .
8.1.2. Определение оптимальной рН реакционной смеси при проведении ферментативного гидролиза антирабического иммуноглобулина 201
8.1.3. Определение условий хроматографического фракционирования анти-рабического иммуноглобулина 202
8.1.4. Концентрирование F(ab2’)-фрагментов антирабического иммуноглобулина 204
8.2. Определение физико-химических показателей препарата антирабическо-го иммуноглобулина, полученного на основе F(ab’)2-фрагментов 207
8.3. Исследование иммунобиологических свойств F(ab’)2-фрагментов анти-рабического иммуноглобулина . 210
8.3.1. Определение специфической активности полученных препаратов . 210
8.3.2. Определение токсигенных и анафилактогенных свойств разработанных иммуноглобулинов 216
ГЛАВА 9. Сравнительное изучение тест-системы для диагностики уровня антирабических антител in vitro на основе дот-иммуноанализа
9.1. Подбор мембран для конструирования диагностической тест-системы на основе дот-иммуноанализа . 233
9.2. Детекция уровня вируснейтрализующих антител в коммерческом анти-рабическом иммуноглобулине и гипериммунных сыворотках в дот-иммуноанализе с использованием разработанного диагностикума . 235
9.3. Определение специфичности тест-систем на основе дот-иммуноанализа для детекции антирабических антител 240
9.4. Изучение стабильности диагностикума в процессе хранения 241
9.5. Экономическая эффективность применения тест-системы на основе дот-иммуноанализа в процессе производства гетерологичного антирабического иммуноглобулина 243 заключение . 246
Выводы 257
Список использованной литературы
- Ферментационное оборудование для культивирования микроорганизмов
- Приборы и оборудование
- Применение питательных сред на основе дрожжевого автолизата для культивирования производственных штаммов V. сholerae
- Сравнительный анализ питательных сред, полученных на основе гидро-лизата фибрина и традиционных сред в условиях глубинного культивирования
Введение к работе
Актуальность проблемы. В современных социально-экономических, миграционных и эпидемиологических условиях при перманентной регистрации новых инфекционных заболеваний, возвращении «старых» нозологий и угрозе их глобального распространения необходимость разработки средств специфической профилактики опасных инфекционных болезней приобретает особую актуальность. Согласно Международным медико-санитарным правилам (2005) легочная чума, холера, желтая лихорадка, геморрагические лихорадки Эбола, Ласса, Марбург и еще целый ряд инфекционных болезней могут спровоцировать чрезвычайную ситуацию международного значения в области общественного здравоохранения. Таким примером является масштабная эпидемия холеры на Гаити в 2010-2013 гг., где зарегистрировано 679637 больных холерой, из которых 8297 умерли ). Практически ежегодно завозные случаи холеры регистрируются в Российской Федерации (доклады Главного государственного санитарного врача за 2000-2011 гг.). В указанных докладах отмечается напряженная эпизоотологическая обстановка в России по бешенству. По данным Роспотребнадзора за антирабической помощью в лечебно-профилактические учреждения страны ежегодно обращаются более 400000 человек.
Таким образом, необходима разработка новой стратегии борьбы с чрезвычайными эпидемическими ситуациями, которая должна вобрать в себя основные достижения теории и практики управления инфекционными болезнями и обогатить их новыми технологиями индикации, дифференцирования и профилактики (Онищенко, 2006; Кутырев, 2006; Щуковская, 2011).
Наиболее эффективными средствами профилактики опасных инфекционных забо
леваний являются медицинские иммунобиологические препараты (Медуницын, 2004;
Кутырев, 2006). Экспертами Всемирной организации здравоохранения на фоне эпиде
мии на Гаити рекомендована вакцинация населения против холеры
(). Для постэкспозиционной профилактики
бешенства предложен антирабический иммуноглобулин в сочетании с культуральной
вакциной. В нашей стране для профилактики холеры применяется вакцина холерная би
валентная химическая, бешенства – гетерологичный антирабический иммуноглобулин
производства ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб».
В настоящей работе подведены итоги научно-экспериментальной работы за период с 1999 по 2012 гг. На начало исследований технология производства холерной вакцины (ХВ) нуждалась в существенной модернизации. Применяемые для производства холерной вакцины биореакторы не обеспечивали необходимый уровень биологической без-
опасности, а объем биомассы, получаемый в процессе глубинного культивирования, не соответствовал планам производства данного профилактического препарата. В производстве ХВ для культивирования штаммов холерного вибриона (Vibrio cholerae) по существующей технологии в основном применяли дорогостоящие питательные среды на основе мясного перевара по Хоттингеру и панкреатического гидролизата казеина с пептоном. Нестандартность исходного сырья не позволяет получать биомассу холерного вибриона и протективные антигены в необходимом количестве. В то же время использование для глубинного культивирования питательных сред импортного производства («Himedia», «Merсk») увеличивает себестоимость холерной вакцины в 1,3 и 1,8 раза, соответственно.
Во исполнение решения межведомственной комиссии Совета Безопасности Российской Федерации по охране здоровья населения (№ 1 от 24.10.2000 г.) и поручения Главного государственного санитарного врача Российской Федерации за № 2510/12020-99-26 от 09.11.99 г. в ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» организовано производство антирабического иммуноглобулина (АИГ). Для получения иммуноглобулина была использована технология фракционирования, разработанная М.А. Селимовым (1957). Применяемые в данной технологии баромембранные процессы не соответствовали современным требованиям производства и не могли гарантировать получение стандартного высококачественного препарата. Апробированные методы работы с фиксированным вирусом бешенства (Rabies virus) не обеспечивали в полной мере требований Санитарных правил 1.3.1285-03. На момент начала работы в Российской Федерации не существовало нормативных документов, детально описывающих операционные процедуры при масштабной производственной работе с фиксированным R. virus. В процессе производства АИГ на этапах контроля сывороток и готового препарата безальтернативно использовали реакцию нейтрализации вируса бешенства на белых мышах, что существенно увеличивало время регламентных процедур и повышало себестоимость конечного продукта.
Таким образом, традиционные технологии выпуска холерной вакцины и антираби-ческого иммуноглобулина не удовлетворяли современным требованиям, предъявляемым к производству медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП).
На основании вышеизложенного, определяющего актуальность выбранного исследования, были сформулированы его цель и задачи.
Цель работы: разработка научно-прикладных направлений совершенствования производства медицинских иммунобиологических препаратов для профилактики особо опасных инфекционных болезней бактериальной и вирусной природы на примерах вакцины холерной бивалентной химической и гетерологичного антирабического иммуноглобулина.
Основные задачи исследования:
-
Сконструировать и апробировать в полупромышленных условиях питательные среды на основе автолизата пекарских дрожжей и гидролизата фибрина для экспериментального культивирования вакцинных вариантов возбудителей особо опасных инфекций бактериальной природы на модели производственных штаммов V. cholerae.
-
Определить условия культивирования и биологические свойства производственных штаммов V. cholerae, а также провести сравнительный анализ уровня продукции протективных антигенов, полученных в условиях глубинного культивирования на сконструированных питательных средах.
-
Спроектировать и сконструировать биореактор с высоким уровнем биологической защиты персонала и окружающей среды при глубинном культивировании производственных штаммов возбудителей особо опасных инфекционных заболеваний на примере вакцинных вариантов холерного вибриона.
4. Провести сравнительную оценку биологических свойств производственных
штаммов V. cholerae, полученных в условиях глубинного культивирования на экспери
ментальном биореакторе, а также изучить иммунохимические, физические и биохими
ческие свойства протективных антигенов, полученных с помощью разработанного фер
ментационного оборудования.
-
Разработать комплекс мер, направленных на обеспечение безопасности экспериментатора и окружающей среды при производстве противовирусных препаратов на модели антирабического иммуноглобулина при работе с фиксированным вирусом бешенства.
-
Сконструировать и апробировать в промышленном производстве эффективную фильтрационную технологическую линию для получения стандартных и качественных коммерческих серий противовирусных медицинских иммунобиологических препаратов на примере гетерологичного антирабического иммуноглобулина.
-
Разработать на базе коммерческого антирабического иммуноглобулина малоре-актогенный препарат на основе F(ab’)2-фрагментов, создать эффективную технологию получения F(ab’)2-фрагментов, провести сравнительную оценку физико-химических и биологических свойств разработанного препарата и экспериментально обосновать перспективу его применения для конструирования профилактического иммунобиологического противовирусного лекарственного средства.
-
Изучить возможность применения тест-систем на основе дот-иммуноанализа в производстве противовирусных препаратов для определения уровня вируснейтрализу-ющих антител у животных-продуцентов на модели гетерологичного антирабического иммуноглобулина.
Научная новизна работы.
На основе изучения культурально-морфологических свойств производственных
штаммов холерного вибриона впервые разработана технология их культивирования,
обеспечивающая получение качественных протективных антигенов. Технология
базируется на применении при глубинном культивировании оригинальных питательных
сред на основе дрожжевого автолизата (оптимальное содержание аминного азота в
питательной среде 0,03-0,05%) и гидролизата фибрина (оптимальное содержание
аминного азота в среде 0,1-0,12%). Приоритетность выполненных исследований по разработке новых питательных сред подтверждена патентом № 2425866 РФ, приоритет от 27.05.2010 г.
Впервые спроектирован и разработан биореактор с верхним магнитным приводом и системой постоянного мониторинга для глубинного культивирования промышленных штаммов холерного вибриона. На основе изучения биологических свойств холерного вибриона и специфической активности протективных антигенов, полученных в результате выращивания штаммов V. cholerae, разработана методика глубинного культивирования (на модели холерного вибриона) промышленных штаммов возбудителей особо опасных инфекционных болезней (патент на полезную модель № 86184 РФ, приоритет от 4.05.2009 г.).
Впервые на модели коммерческого противовирусного препарата (антирабического иммуноглобулина) разработана научно-методическая основа для проектирования и создания универсальной системы каскадной фильтрации. Система включает в себя предварительную, глубинную, депирогенизирующую фильтрации с ультрафильтрационным модулем. С использованием данной технологии противовирусный препарат получается более высокого качества со стандартными спецификационными характеристиками.
Впервые научно обоснован и экспериментально подтвержден комплекс мер, направленных на обеспечение безопасности экспериментатора и окружающей среды при масштабных манипуляциях с фиксированным вирусом бешенства. Дана детальная характеристика фиксированного вируса бешенства, определены наиболее опасные лабораторные манипуляции при выполнении регламентных работ с рабическим антигеном, разработаны стандартные операционные процедуры. Результаты данной работы явились научным обоснованием для разработки методических указаний «Безопасность работы с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства» МУ № 3.3.1.1099.
Впервые разработана и предложена на основе дот-иммуноанализа оригинальная методика оценки уровня вируснейтрализующих антител в сыворотках крови животных-продуцентов, вакцинированных пациентов, а также коммерческом препарате гетероло-гичного антирабического иммуноглобулина (патент на изобретение № 2360252 РФ, приоритет от 09.04.2008 г.). На основе сравнительного анализа впервые определена кор-
реляционная зависимость между результатами традиционной реакции нейтрализации вируса бешенства в тесте in vivo и данными, полученными с помощью сконструированной тест-системы на основе дот-иммуноанализа для применения in vitro. Коэффициент корреляции между тест-системой на основе дот-иммуноанализа и реакцией нейтрализации составил 0,9.
Разработана оригинальная экспериментально-обоснованная эффективная технология получения ареактогенных противовирусных профилактических препаратов (на модели гетерологичного антирабического иммуноглобулина) на основе F(ab’)2-фрагментов, включающая ферментативный гидролиз коммерческого препарата, отделение F(ab’)2-фрагментов от константной части молекулы иммуноглобулина с использованием хроматографии и финишное лиофильное высушивание.
Практическая значимость исследования.
Работа имеет прикладную ориентацию и посвящена совершенствованию действующих производств иммунобиологических препаратов для профилактики холеры и бешенства. Предложены оригинальные технологические и микробиологические решения, внедрение которых в производство МИБП вносит значительный вклад в развитие здравоохранения и укрепления санитарно-эпидемиологического благополучия Российской Федерации. В результате инновационных технологических решений снизилась зависимость Российской Федерации от препаратов импортного происхождения и, следовательно, повысилась лекарственная и экономическая безопасность страны.
Разработана технологическая линия по производству антирабического иммуноглобулина из сыворотки крови лошади, обеспечивающая выпуск качественного препарата. На данный препарат составлена и утверждена нормативно-техническая документация (регламент производства ПР № 01898109-26-10, фармакопейная статья предприятия ФСП 002639/01-250210). Антирабический иммуноглобулин зарегистрирован Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития (регистрационный № 002639/01) и внедрен в практику здравоохранения Российской Федерации. Препарат внесен в перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов, утвержденный распоряжением Правительства Российской Федерации от 11 ноября 2010 г. № 1938-р.
С 2003 по 2013 гг. произведено 138 производственных серий препарата в полном соответствии с нормативно-технической документацией. Все серии соответствуют спе-цификационным свойствам, изложенным в фармакопейной статье (ФСП 002639/01-250210). С 2003 по 2013 гг. выпущено и реализовано в лечебно-профилактические учреждения Российской Федерации более 1900 литров гетерологичного антирабическо-го иммуноглобулина. В результате реализации препарата в федеральный бюджет перечислено более 200 млн. рублей. Препарат применяется с 2003 г. по настоящее время для
постэкспозиционной профилактики бешенства у людей во всех субъектах Российской Федерации.
В рамках направления по повышению биологической безопасности при работе с производственными штаммами разработаны методические указания федерального уровня по обеспечению безопасности работы с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства «Москва» и «CVS», используемыми в процессе изготовления и контроля «Иммуноглобулина антирабического из сыворотки крови лошади жидкого», «Вакцины антирабической культуральной из штамма Внуково-32», «Вакцины концентрированной антирабической очищенной» МУ № 3.3.1.1099.
Сконструирована современная рентабельная тест-система на основе дот-иммуноанализа для определения уровня вируснейтрализующих антител. Одобрены Учёным советом РосНИПЧИ «Микроб» и утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб» методические рекомендации: «Получение F(ab’)2-фрагментов антирабического иммуноглобулина в лабораторных условиях» (протокол № 2 от 17.04.2007 г.); «Определение активности антирабических сывороток и препарата гетерологичного антираби-ческого иммуноглобулина in vitro в дот-иммуноанализе» (протокол № 1 от 09.04.2009 г.) и «Определение уровня антител к вирусу бешенства в сыворотках лошадей-продуцентов и человека в непрямом варианте дот-иммуноанализа с применением неферментного диагностикума» (протокол № 3 от 05.05.2011 г.).
Разработаны методические указания федерального уровня МУ 3.3.2.2124-06 «Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза».
Разработана эффективная технология экспериментально-производственного культивирования производственных штаммов холерного вибриона с использованием новых, эффективных питательных сред. Одобрены Учёным советом и утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб» методические рекомендации: «Приготовление гидролизата фибрина и конструирование на его основе питательных микробиологических сред для культивирования микроорганизмов» (протокол № 2 от 21.04.10 г.).
Спроектированный и сконструированный биореактор использован при производстве холерной вакцины. На разработанном аппарате успешно проведено восемь выращиваний производственных штаммов холерного вибриона. Разработанный биореактор обеспечивает высокую защиту персонала и окружающей среды на этапах глубинного культивирования. Биореактор в соответствии с актом, утвержденным директором института от 28.03.2008 г., введен в эксплуатацию в лаборатории холерных вакцин ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб».
Результаты проектирования и конструирования биореактора явились научным обоснованием для разработки нескольких разделов методических указаний федерально-
го уровня «Биологическая безопасность при глубинном аппаратном культивировании микроорганизмов I-II групп патогенности» МУ 1.3.2411-08.
Одобрены Учёным советом РосНИПЧИ «Микроб» и утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб» методические рекомендации «Оценка эффективности автолиза пекарских дрожжей комплексом физико-химических методов» (протокол № 7 от 27.06.06 г.).
Материалы диссертационной работы используются при чтении лекций на курсах профессиональной переподготовки и усовершенствования врачей по особо опасным инфекциям при РосНИПЧИ «Микроб».
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Питательные среды на основе дрожжевого автолизата и гидролизата фибрина (содержание аминного азота в среде 0,03–0,05% и 0,1-0,12%, соответственно) эффективны при культивировании производственных штаммов V. сholerae 569В Инаба и М41 Огава.
-
Необходимый уровень биологической защиты персонала и окружающей среды обеспечивает сконструированный ферментер на основе реактора РЗРЯ-6/0,63 с верхним магнитным приводом при глубинном культивировании производственных штаммов V. сholerae 569В Инаба и М41 Огава.
-
Производственные штаммы V. сholerae 569В Инаба и М41 Огава, полученные при глубинном культивировании на экспериментальном биореакторе РЗРЯ-6/0,63 с магнитной мешалкой, соответствуют требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам холерного вибриона.
-
Разработанные нормативные документы, регламентированные лабораторные методики, установленное технологическое оборудование и высокие квалификационные требования к персоналу лаборатории создали эффективную систему биологической безопасности при производстве антирабического иммуноглобулина.
-
Система каскадной фильтрации, состоящая из предварительной, осветляющей, депирогенизирующей, ультра- и стерилизующей фильтрации, применяемая в производстве коммерческих серий антирабического иммуноглобулина, позволяет получить стандартный качественный препарат с высокими потребительскими свойствами.
-
Разработанная технологическая схема позволяет получать малореактогенный препарат на основе F(ab’)2-фрагментов антирабического иммуноглобулина, обладающий высокой вируснейтрализующей активностью.
-
Разработанная тест-система на основе дот-иммуноанализа с использованием гидрозоля золота с размером частиц 15-17 нм, связанных сорбционно с антигеном, является высокочувствительной и специфичной при определении уровня вируснейтрализу-
ющих антител в сыворотках крови лошадей-продуцентов и готовом препарате антира-бического иммуноглобулина.
Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнялась в ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» в рамках плановых научно-исследовательских работ № 26-2-05: «Разработка и внедрение в производство новых МИБП для профилактики и диагностики возбудителей инфекционной и вирусной природы» (номер госрегистрации: 0120.05044663) и № 40-2-09 «Оптимизация технологических этапов производства МИБП и разработка новых препаратов для диагностики ООИ» (номер госрегистрации: 0120.0853923). Вклад автора в представленные результаты заключается в личном участии во всех теоретических и экспериментальных исследованиях, обработке результатов и формулировании выводов. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, идея которых принадлежит автору данной работы и в получении которых роль диссертанта была определяющей. Часть исследований выполнена в соавторстве с сотрудниками ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» М.В. Антонычевой, И.М. Жулидо-вым, А.В. Комиссаровым, А.Ю. Ульяновым, С.А. Ереминым, Е.Г. Абрамовой, М.Н. Ки-реевым, С.В. Генераловым, Н.А. Шараповой, О.А. Волох.
Автор лично принимал участие в определении направлений, планировании и выполнении исследований: по конструированию питательных сред для культивирования производственных штаммов холерного вибриона; по разработке требований к приборному и аппаратному оформлению биореактора с высоким уровнем биологической безопасности. Автор руководил и принимал непосредственное участие в научно-практических работах: по определению и оценке рисков при манипуляциях с фиксированным вирусом бешенства; по разработке наиболее адекватной биотехнологической модели использования фильтрационных процессов в процессе производства антираби-ческого иммуноглобулина. Планировал, координировал и руководил исследованиями, направленными на совершенствование производства антирабического иммуноглобулина: конструирование препарата на основе F(аb’)2-фрагментов; разработка тест-систем на основе дот-иммуноанализа.
Апробация работы. Материалы, вошедшие в диссертационную работу, были доложены и обсуждены на ежегодных научно-практических конференциях «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в РосНИПЧИ “Микроб”» (2005–2012 гг.). В виде тезисных работ материалы были представлены на: VI Межгосударственной научно-практической конференции «Санитарная охрана территории государств – участников содружества независимых государств: Проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005); II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инфекции, обусловленные иерсиниями» в НИИЭМ им. Пастера (Санкт-Петербург,
2006); всероссийском научном форуме «Инновационные технологии медицины XXI века» (Москва, 2006); научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2006); IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств - участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах – участниках СНГ» (Саратов, 2007); II Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Рязань, 2007); VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах–участниках СНГ» (Саратов,2007); совещании проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы» (Ростов-на-Дону, 2008); международной научно-практической конференции «Биотехнология в Казахстане: проблемы и перспективы инновационного развития», посвящённой 50-летию НИИ проблем биобезопасности НЦБ МОН РК (Алма-Аты, 2008); V международной конференции «Проблемы обращения с отходами лечебно-профилактических учреждений» (Москва, 2009); международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями» в ФГУН НИИЭМ им. Пастера Роспотребнадзора (Санкт-Петербург, 2010); международной научно-практической конференции «Вавиловские чтения-2010» (Саратов, 2010); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вакцинология 2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2010); 15 международной школе-конференции молодых ученых «Биология – наука ХХI века» (Пущино, 2011); на проблемной комиссии Координационного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации (Ростов-на-Дону, 2011).
Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 58 опубликованных работах (в научных журналах, рекомендуемых ВАК – 18 статей, 1 статья в нерецензи-руемом журнале, в материалах международных конференций – 21, всероссийских – 9, отраслевых – 9), а также в 6 нормативных документах (регламентах производства, фармакопейных статьях), 6 методических рекомендациях и указаниях и в 3 патентах РФ на изобретения.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», 7 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы. Она изложена на 309 страницах, содер-
Ферментационное оборудование для культивирования микроорганизмов
На основе изучения культурально-морфологических свойств производственных штаммов холерного вибриона впервые разработана технология культивирования возбудителей особо опасных инфекционных болезней на модели эталонных штаммов холерного вибриона, обеспечивающая получение качественных протективных антигенов. Технология базируется на применении при глубинном культивировании оригинальных питательных сред на основе дрожжевого автолизата (оптимальное содержание аминного азота в питательной среде 0,03-0,05%) и гидролизата фибрина (оптимальное содержание аминного азота в среде 0,1-0,12%). Приоритетность выполненных исследований по разработке новых питательных сред подтверждена патентом № 2425866 РФ, приоритет от 27.05.2010 г.
Впервые спроектирован и разработан биореактор с верхним магнитным приводом и системой постоянного мониторинга для глубинного культивирования промышленных штаммов холерного вибриона. На основе изучения биологических свойств холерного вибриона и специфической активности протектив-ных антигенов, полученных в результате выращивания штаммов V. cholerae, разработана методика глубинного культивирования (на модели холерного вибриона) промышленных штаммов возбудителей особо опасных инфекционных болезней (патент на полезную модель № 86184 РФ) приоритет от 4.05.2009 г.
Впервые на модели коммерческого противовирусного препарата (антира-бического иммуноглобулина) разработана научно-методическая основа для проектирования и создания универсальной системы каскадной фильтрации. Система включает в себя предварительную, глубинную, депирогенизирующую фильтрации с ультрафильтрационным модулем. С использованием данной технологии противовирусный препарат получается более высокого качества со стандартными спецификационными характеристиками.
Впервые научно обоснован и экспериментально подтвержден комплекс мер, направленных на обеспечение безопасности экспериментатора и окружающей среды при масштабных манипуляциях с фиксированным вирусом бешенства. Дана детальная характеристика фиксированного вируса бешенства, определены наиболее опасные лабораторные манипуляции при выполнении регламентных работ с рабическим антигеном, разработаны стандартные операционные процедуры. Результаты данной работы явились научным обоснованием для разработки методических указаний «Безопасность работы с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства» МУ № 3.3.1.1099.
Впервые разработана и предложена на основе дот-иммуноанализа оригинальная методика оценки уровня вируснейтрализующих антител в сыворотках крови животных-продуцентов, вакцинированных пациентов, а также коммерческом препарате гетерологичного антирабического иммуноглобулина (патент на изобретение №2360252 РФ) приоритет изобретения от 09.04.2008 г. На основе сравнительного анализа впервые определена корреляционная зависимость между результатами традиционной реакции нейтрализации вируса бешенства в тесте in vivo и данными, полученными с помощью сконструированной тест-системы на основе дот-иммуноанализа для применения in vitro. Коэффициент корреляции между тест-системой на основе дот-иммуноанализа и реакцией нейтрализации составил 0,9.
Разработана оригинальная экспериментально-обоснованная эффективная технология получения ареактогенных противовирусных профилактических препаратов (на модели гетерологичного антирабического иммуноглобулина) на основе F(ab )2-фрагментов, включающая ферментативный гидролиз коммерческого препарата, отделение F(ab )2-фрагментов от константной части молекулы иммуноглобулина с использованием хроматографии и финишное лиофильное высушивание.
Работа имеет прикладную ориентацию и посвящена совершенствованию действующих производств иммунобиологических препаратов для профилактики холеры и бешенства. Предложены оригинальные технологические и микробиологические решения, внедрение которых в производство МИБП вносит значительный вклад в развитие здравоохранения и укрепления санитарно-эпидемиологического благополучия Российской Федерации. В результате инновационных технологических решений снизилась зависимость Российской Федерации в препаратах импортного происхождения, а следовательно повысилась лекарственная и экономическая безопасность страны.
Во исполнение решения Межведомственной комиссии Совета Безопасности Российской Федерации по охране здоровья населения (№1 от 24.10.2000 г.) и поручения Главного государственного санитарного врача Российской Федерации за № 2510/12020-99-26 от 09.11.99 г. разработана технологическая линия по производству антирабического иммуноглобулина из сыворотки крови лошади, обеспечивающая выпуск качественного препарата. На данный препарат составлена и утверждена нормативно-техническая документация (регламент производства ПР № 01898109-26-10, фармакопейная статья предприятия ФСП 002639/01-250210). Антирабический иммуноглобулин зарегистрирован Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития (регистрационный № 002639/01) и внедрен в практику здравоохранения Российской Федерации. Препарат внесен в перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов, утвержденный распоряжением Правительства Российской Федерации от 11 ноября 2010 г. №1938-р.
С 2003 по 2013 г.г. произведено 138 производственных серий препарата в полном соответствии с нормативно-технической документацией. Все серии со 18 ответствуют спецификационным свойствам, изложенным в фармакопейной статье (ФСП 002639/01-250210). С 2003 по 2013 г.г. выпущено и реализовано в лечебно-профилактические учреждения Российской Федерации более 1900 литров гетерологичного антирабического иммуноглобулина. В результате реализации препарата в федеральный бюджет перечислено более 200 млн. рублей. Препарат применяется с 2003 г. по настоящее время для постэкспозиционной профилактики бешенства у людей во всех субъектах Российской Федерации.
В рамках направления по повышению биологической безопасности при работе с производственными штаммами разработаны методические указания по обеспечению безопасности работы с производственными штаммами фиксированного вируса бешенства «Москва» и «CVS», используемыми в процессе изготовления и контроля «Иммуноглобулина антирабического из сыворотки крови лошади жидкого», «Вакцины антирабической культуральной из штамма Внуково-32», «Вакцины концентрированной антирабической очищенной» МУ № 3.3.1.1099.
Приборы и оборудование
В своей работе мы использовали производственные штаммы холерного вибриона: V. cholerae штамм М-41 серовар Огава и V. cholerae штамм 569 В се-ровар Инаба. В экспериментах по контролю иммуногенности холерной вакцины использовали агаровые культуры (3-5 часовые) V. cholerae еltor 3122-Р (Oгава) и V. cholerae еltor 879-М (Инаба). Для проверки эффективности разработанных питательных сред использовали тест-штамм V. cholerae О1 Р-1 (145). Все штаммы получены из Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб».
В исследованиях по совершенствованию производства антирабического иммуноглобулина использовали штаммы фиксированного вируса бешенства Virus fixe штамм Москва 3253 и Virus fixe штамм СVS, предоставленные ФГБУ «НЦ ЭСМП Минздравсоцразвития».
Питательные среды, используемые в экспериментах Плотные и жидкие питательные среды на основе серий сухого автолизата пекарских дрожжей и гидролизата фибрина, полученных реакторным и лабораторным способом, готовили по общепринятой методике (Козлов Ю.А., 1950; Биргер М.О., 1982).
Для выращивания производственных штаммов V. cholerae 569В и М-41 в условиях биореактора использовали жидкую питательную среду на основе гид-ролизата казеина с добавлением 1±0,2% пептона, 0,5±0,1% натрия хлорида и 0,05±0,01% фосфата натрия двузамещенного, рН 8,2±0,2.
В качестве контрольных сред при выращивании штаммов холерного вибриона применяли жидкие и плотные питательные среды по Хоттингеру, с содержанием аминного азота в среде соответственно 1,0%. Контрольные питательные среды были изготовлены в отделе питательных сред и проконтролированы на базе ОБТК ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб».
Экспериментальные животные В работе для определения иммуногенности холерной вакцины использовали беспородных белых мышей (Mus musculus) обоего пола, массой 10±1 г, для проведения испытаний на токсичность массой 19±1 г. Кроликов (Оryctolagus cuniculus) породы советская шиншилла массой 2,75-±0,25 кг использовали для определения антигенной активности вакцины холерной и определения пиро-генности антирабического иммуноглобулина.
Использовали белых мышей (M. musculus) обоего пола линии BALB/c массой 10-12 г для постановки реакции нейтрализации фиксированного вируса бешенства. Для осуществления испытания АИГ на токсичность использовали беспородных морских свинок (Cavia porcellus) обоего пола массой 250-350 г и беспородных белых мышей массой 18-20 г.
Мышей, морских свинок и кроликов получали из питомника ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб». В опытах использовали животных после прохождения карантина. Кормление, уход и содержание экспериментальных животных проводили в строгом соответствии с действующими Санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев), (1992). Кормление животных осуществляли согласно приказу МЗ СССР № 1179 (1983). Все процедуры на экспериментальных животных проводили согласно рекомендациям В.В. Карпенко и В.И. Сачкова (1985).
Вода очищенная (ФС 42-2619-97) – для приготовления растворов. Вода для инъекций ФС 42-2620-97, натрий хлористый (NaCI), хч, ГОСТ 4233-77, натрий фосфорнокислый двузамещенный (Na2НРО42Н2О), хч, MERCK, калий фосфорнокислый однозамещенный (КН2РО42Н2О), хч, ГОСТ 4198-75 – для приготовления коррегирующих буферных растворов. Хлороформ (CHCI3), чда, ТУ 2631-066-444-931-79-01 – для предупреждения контаминации микроорганизмами элюата и питательной основы. Tween 80 (полиэтиленгликоль сорбит моноолеат), ICN Biomedicals, Span 20 (сорбитан моноолеат), Serva – детергенты.
Набор реагентов «Общий белок – 01-Витал» (ООО «Витал Диагностикс СПб») ТУ 9398-002-52145831-2004 – для измерения содержания белка в препарате биуретовым методом.
Монореагент (10-кратный концентрат): KH2PO4 – 10 ммоль/л, K3[Fe(CN)6] – 6 ммоль/л, ацетонциангидрин (АЦГ) – 12 ммоль/л, детергент; контрольные растворы гемоглобина (3 флакона с разной концентрацией гемоглобина) (ООО «Медиакор – СПб») – набор реагентов для определения концентрации гемоглобина.
Натрий хлористый (NaCI), хч, ГОСТ 4233-77, краситель амидо черный (Applichem, Германия), барбиталовый буферный раствор (рН 8,6), этиловый спирт (ГОСТ Р 51652-2000), уксусная кислота (ГОСТ 61-75) – для проведения электрофореза на ацетатцеллюлозных пленках.
Натрий углекислый (Na2CO3), хч, ГОСТ 83-79, натрий углекислый кислый (NaHCO3), хч, ГОСТ 4201-79 – для приготовления 1 М карбонат-бикарбонатоного буфера (рН 9,9±0,1). Натрий уксуснокислый трехводный (CH3COONa3Н2О), хч, ГОСТ 199-78, кислота уксусная ледяная (CH3COOH), хч, ГОСТ 61-75 – для приготовления 2 М ацетатного буфера (рН 4,5±0,1). Риванол (Liaoyuan Silver Eagle Pharmaceutical Co.Ltd, Китай) – для осаждения альбуминовой, -и -глобулиновых фракций иммунной сыворотки. Спирт этиловый ректификованный 96% из пищевого сырья, ГОСТ Р 51652-2000 – для осаждения -глобулиновой фракции иммунной сыворотки.
Антигенный диагностикум на основе наночастиц коллоидного золота – для определения активности антирабических сывороток и иммуноглобулина in vitro в дот-иммуноанализе.
Отраслевой стандартный образец содержания белка в иммуноглобулине ФГБУ «НЦ ЭСМП Минздравсоцразвития» ОСО 42-28-340-09/П, стандартный образец предприятия содержания белка в иммуноглобулине СОП 42-28-05-04-09 – для определения содержания белка в препарате.
Применение питательных сред на основе дрожжевого автолизата для культивирования производственных штаммов V. сholerae
Ферментеры, сконструированные для выращивания вакцинных штаммов возбудителей особо опасных инфекционных заболеваний, должны обладать дополнительным набором технических решений, повышающих уровень биологической безопасности процесса производства. Такими решениями являются: способность всех агрегатов и технических блоков ферментера выдержать многократную химическую стерилизацию; полное отсутствие в культуральном сосуде приспособлений для осуществления слива реакторной биомассы; гарантируемая конструкторскими решениями герметичность особо критических узлов ферментера; возможность поддержания герметичности внутри сосуда для культивирования при перепаде давления от -100±10 кПа до 360±10 кПа (Васин Ю.Г. с соавт., 1984; 1993).
В работе А.Ю. Винарова с соавт. (2005) наиболее полно даны представления о конструктивных особенностях ферментеров, классифицируемых по способу подвода энергии, с детальным их описанием.
Перед началом выполнения данного этапа работы мы проанализировали нормативные документы, в которых регламентируются требования к технологическому оборудованию. Базируясь на требованиях, предъявляемых к технологическому оборудованию в руководящих документах (см. главу 1), мы сформулировали основные критерии к разрабатываемому биореактору: конструкция ферментера должна гарантировать условия асептичности и стерильности в процессе длительной эксплуатации; технологические узлы биоректора: не должны подвергаться коррозии и выделять вещества, которые могут негативно повлиять на качество препарата; не должны усиливать пирогенную нагрузку на препарат, быть токсичными, обладать поверхностной активностью, негативно влияя на его качество; должны быть выполнены из современных материалов, не ингибирующих активность полуфабрикатов и готового препарата; монтажная схема должна гарантировать асептические условия каждой точки внутренних полостей аппарата, трубопроводов, запорной и регулирующей аппаратуры; во время поведения технологического процесса должны быть обеспечены условия, предупреждающие перекрестную контаминацию, биологические и химические выбросы в окружающую среду.
Следующим этапом наших исследований была адаптация требований, предъявляемых к биореакторам, к объему и особенностям производства вакцины холерной бивалентной химической. На основе проведенного анализа были установлены следующие требования к разрабатываемому ферментеру: общий рабочий объем - 0,5 - 1,0 м3; давление в рабочей камере - не менее 3,0 кг/см2; проектная температура в культуральной емкости - не менее 150 0С; давление в рубашке аппарата для культивирования - не менее 3,5 кг/см2; проектная температура рубашки реактора - не менее 150 0С; материал рабочей камеры - сталь 12Х18Н10Т (316L); интервал мониторинга за температурой - 0150 0С; отсутствие в рабочей камере биореактора нижнего слива для культуральной жидкости; использование сильфонной или мембранной запорной арматуры на технологических линиях, имеющих прямой контакт с культуральной средой; конструкция системы аэрации ферментера должна гарантировать подачу в культуральную жидкость стерильной газовой среды и не оказывать негативное влияние на культивируемый объект. Данная система должна состоять из: барботера обеспечивающего подачу воздуха и стерилизуемого фильтрэлемента с размерами пор 0,2 мкм; модуль для стерилизации выходящего из ферментера воздуха должен состоять из конденсора, изготовленного из нержавеющей стали и стерилизуе 136 мого паром фильтра с порогом отсечения 0,2 мкм, комплектуемый необходимой арматурой и трубами для проведения процесса стерилизации; перемешивающее устройство должно обеспечивать число оборотов мешалки в интервале - от 50 до 800 об/мин с возможностью корректировки на любой фазе культивирования; контрольно-измерительное оборудование должно иметь возможность постоянного мониторинга оптической плотности биомассы в культуральной среде и измерения уровня рН; реактор должен быть укомплектован стерилизуемой системой для подачи в полость ферментера корригирующих растворов; на вал перемешивающего устройства должна осуществляться передача крутящего момента через расположенную на верхней крышке ферментера магнитную муфту; обязательное наличие системы механического пеногашения; биореактор должен иметь комплект разрешительных и сертификационных документов и комплектоваться паспортом на сосуд, работающий под давлением.
Целью данного этапа являлась разработка и конструирование аппарата для глубинного культивирования производственных штаммов холерного вибриона. Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи: выполнить конструирование, изготовление и установку биореактора на тезнологической линии (участке культивирования) производства химической холерной вакцины; доказать возможность проведения масштабного перехода условий культивирования штаммов V. cholera для экспериментального биореактора; провести промышленное выращивание вакцинных вариантов холерного вибриона в условиях периодического глубинного культивирования; изучить спецификационные свойства стандартных нативных О-АГ и холерогена; изучить физиологические и морфологические свойства производственных штаммов холерных вибрионов в ходе их глубинного культивирования на производ ственном и разработанном биореакторах; провести сравнительный анализ биохимических, физических и иммунохимических свойств протективных антигенов холерного вибриона, полученных с помощью экспериментального биореактора и по регламентной технологии; изучить иммунобиологические и физико-химические свойства холерной химической бивалентной вакцины, произведенной с применением разработанного аппарата для культивирования.
Сравнительный анализ питательных сред, полученных на основе гидро-лизата фибрина и традиционных сред в условиях глубинного культивирования
В качестве базисной модели для создания биореактора был выбран химический реактор РЗРЯ-6/0,63. Он соответствовал ряду выше обоснованных критериев, а именно: обладал необходимым для производства полезным объемом; имел достаточные проектные давление и температуру емкости и рубашки; у него отсутствовал нижний слив. Кроме того, данный реактор имел разрешение Ростехнадзора на использование в качестве сосуда, работающего под избыточным давлением и был укомплектован соответствующим паспортом. На рисунке 5.1 представлена схема сконструированного ферментера.
Сконструированный ферментер базируется на модели реактора РЗРЯ-6-0,63 с рабочим объемом 0,63 м3, состоит из реакторной емкости из нержавеющей стали 1, сверху закрытой крышкой 2. В крышку конструкционно интегрированы фланцы, штуцера и запорная арматура для присоединения сосуда для культивирования к материальным трубопроводам. Реактор оборудован краном разрыва 3, сифонной трубкой 4, барботером 5 и датчиками давления и температуры. Наверху реактора расположен электродвигатель 6 с регуляцией числа оборотов. Двигатель передает крутящий момент на вал мешалки за счет магнитной муфты 7. Для соблюдения требований герметичности и биологической безопасности муфта снабжена разделительной мембраной 8. В качестве средств механического пеногашения реактор укомплектован специальной крыльчаткой 138 9, расположенной на валу перемешивающего устройства. На валу также размещена турбинная мешалка 10.
Схема разработанного биореактора (пояснения по схеме изложены в тексте) Вал перемешивающего устройства установлен вертикально и закреплен в верхней и нижней опорах корпуса на подшипниках скольжения. Для повышения массообменных процессов в культуральном сосуде и оптимального аэрирования питательной среды турбинная мешалка изготовлена в виде цилиндра с лопатками и снабжена перфорированной сеткой по периферии.
Процесс культивирования микроорганизмов обеспечивают следующие инженерные системы: - подачи воздуха 11 с фильтрами тонкой очистки 12 (с размерами пор 0,2 мкм), расходомер 13; 139 - очистки отходящего из ферментера воздуха 14, укомплектованная кон денсатосборником 15, каскадом теплообменников 16 и стерилизуемых филь тров из нержавеющей стали 17 (с размером пор 0,2 мкм); - вакуумная линия, состоящая из вакуумного насоса 18; - материальная линия для подачи корригирующих растворов 19, состоящая из емкости 20 для хранения данных веществ, оборудованную фильтрами 21, перистальтических насосов 22; - контроля физико-химических параметров культуральной среды и процессов выращивания 23 состоит из кюветы 24, с размещенными в ней датчиками кислорода, рН, рО2, кюветы для определения оптической плотности культу-ральной среды 25. - поддержания оптимального температурного диапазона 27, состоящая из емкости с термонагревательными элементами 28, датчиками температуры 29 и укомплектованная циркуляционным насосом 30.
Для забора проб с целью мониторирования за процессом культивирования реактор снабжен насосом с магнитным приводом 26, патрубком с сильфонным вентилем и укомплектованным силиконовым шлангом.
Важнейшим требованием при проектировании и конструировании ферментера было повышение биологической безопасности за счет внедрения современных технологий. Технологической особенностью разработанного биореактора является отсутствие в конструкции сальниковых и торцевых уплотнений перемешивающего устройства. Вместо традиционной системы уплотнений была разработана оригинальная конструкция верхнего осевого магнитного привода.
Герметичность аппарата для культивирования достигается конструкционной особенностью ферментера, а именно – его рабочая камера отделена от окружающего пространства герметичной гильзой.
Остановимся подробнее на особенностях системы термостатирования в разработанном биореакторе. Периферическими приборами системы термоста 140 тирования являются датчики уровня которые соединены с прибором автоматического управления М6 фирмы «Овен, Россия», контроль температуры в термо-статирующей емкости осуществляет прибор «Термодат, Россия», а в полости ферментера – «Элемер, Россия». На указанных приборах контроля температуры инсталируется предельный диапазон температур отдельно для реакторной емкости и отдельно для термостатирующей.
Регулировка температуры осуществляется через реле, нагревательные элементы и электромагнитные клапана. Указанная система гарантирует необходимый температурный режим культивирования холерных вибрионов.
При культивировании микроорганизмов давление в ферментере устанавливают ниже атмосферного посредством регулирования расхода воздуха в системах подачи воздуха и очистки отработанного воздуха. Так как технологический узел стерилизации выходящего из ферментера воздуха имеет постоянную производительность - в реакторной емкости создается разряжение. Данная система очистки комплектуется высокоэффективными фильтрами, что позволяет повысить уровень биологической безопасности аппарата для культивирования.
Отличительной особенностью разработанного биореактора является возможность проведения стерилизации питательной среды, внутренней полости реактора, соединительных штуцеров и патрубков, присоединительных элементов на рабочем месте. Данное конструкторское решение упрощает и ускоряет процесс стерилизации оборудования и питательной среды. Кроме того, нет необходимости использовать вспомогательное оборудование (парогенератора, систем очистки пара).
Оригинальное техническое решение было найдено для системы мониторинга физико-химических показателей процесса культивирования – контрольные датчики размещены в небольшой легкодоступной для профилактического осмотра кювете, обеспечивая постоянный проток через нее культуральной жидкости. Преимущества данного конструктивного решения следующие: облегчается градуировка измерительных электродов и, в процессе эксплуатации, дан ный узел может оснащаться дополнительными электродами или датчиками. Во время установки или демонтажа не требуется дополнительных защитных приспособлений.
Схема проточной кюветы представлена на рисунке 5.2. Кювета представляет собой металлический стакан, крепящийся при помощи фланцевого соединения на выходном штуцере насоса. В стакан герметично вмонтирована пустотелая гильза с электродами.
