Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Роль микрофлоры ЖКТ в жизнеобеспечении человека и методы коррекции ее нарушений в свете современных знаний (обзор литературы) 19-62
1.1 . Качественный и количественный состав микрофлоры ЖКТ и функции, которые она выполняет 19-34
1.2.Последствия нарушений микробиоты ЖКТ и способы ее коррекции 34-41
1.3. Свойства бифидобактерий и процесс становления бифидофлоры ЖКТ в онтогенезе 41 -62
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 63-83
2.1. Материалы 63
2.1.1. Штаммы микроорганизмов, используемые в работе 63-66
2.1.2. Питательные среды 66-68
2.2. Методы исследования 68-83
2.2.1. Метод выделения чистой культуры бифидобактерий 68-69
2.2.2. Метод биохимической идентификации бифидобактерий 69-70
2.2.3. Молекулярно- генетическое типирование бифидобактерий 71
2.2.4. Определение чувствительности к антибиотикам диско-диффузионным методом 71 -73
2.2.5. Определение антагонистической активности 73
2.2.6. Определение безвредности бактериальных культур штаммов бифидобактерий и лактобацилл 73-74
2.2.7. Активация культуры при подготовке к культивированию 74
2.2.8. Метод глубинного культивирования 74-75
2.2.9. Определение числа жизнеспособных бифидобактерий и лактобацилл методом конечных разведений 75-76
2.2.10. Количественное определение ацидофильных лактобацилл 76-77
2.2.11. Контроль микробной культуры (препарата) на наличие посторонней микрофлоры 77-78
2.2.12. Изучение морфологии клеток 78
2.2.13. Определение активности кислотообразования 78-79
2.2.14. Сушка-гранулирование в псевдоожиженном слое (ПС) 79-80
2.2.15. Распылительная сушка с низкой температурой теплоносителя 80-82
2.2.16. Статистические методы обработки материалов исследований 82-83
ГЛАВА 3. Выделение, изучение и отбор производственно-перспективных штаммов 84-106
3.1. Изучение морфологических свойств 84-89
3.2.Изучение биохимических свойств 89-96
3.3 Идентификация молекулярно-биологическими методами 96-99
3.4. Изучение чувствительности к антибиотикам 99-103
3.5. Изучение антагонистических свойств 103
3.6.Изучение культуральных свойств 103-106
ГЛАВА 4. Изучение динамики глубинного культивирования бифидобактерий с целью их производственного использования 107
4.1 .Изучение динамики культивирования отдельных культур 107-111
4.2. Изучение динамики культивирования бифидобактерий в составе многовидовой ассоциации 111-115
4.3. Изучение пребиотических свойств растворимых пищевых волокон
4.3.1. Изучение пребиотических свойств топинамбура 116-120
4.3.2. Изучение пребиотических свойств цикория и смолы акации 120-123
ГЛАВА 5. Разработка режимов новых методов обезвоживания бифидобактерий - распылительного высушивания при низкой температуре теплоноситеносителя и сушки-гранулирования в псевдоожиженном слое 124
5.1. Изучение отдельных технологических параметров распылительной сушки при низкой температуре теплоносителя 125-135
5.1.1. Изучение влияния фазы развития культуры на качество целевого продукта 126-127
5.1.2. Изучение влияния состава питательной среды на качество целевого продукта 127-130
5.1.3. Оценка выживаемости бифидобактерий в сухих препаратах 130-132
5.1.4. Влияние пектина на результаты хранения препаратов 132-135
5.2. Разработка методических подходов к высушиванию пробиотических микроорганизмов сушкой-гранулирования в псевдоожиженном слое 135-136
5.2.1. Влияние состава среды на процесс сушки и качество конечного продукта 136-138
5.2.2. Влияние защитных сред на эффективность процесса сушки и качество конечного продукта 138-140
5.2.3. Сравнительное изучение влияния различных носителей на процесс сушки и качество конечного продукта 140-141
ГЛАВА 6. Разработка рецептуры и технологической документации препаратов- синбиотиков 142
6.1. Серия биологически активных добавок к пище «Бифидум-Мульти».142-153 6.2.Серия биологически активных добавок к пище «Нормоспектрум».. 153-164
ГЛАВА 7. Результаты изучения эффективности препаратов-синбиотиков —биологически активных добавок к пище «Бифидум-Мульти» и «Нормоспектрум» при использовании в профилактической и восстановительной медицине 165
7.1. Изучение эффективности и безопасности «Нормоспектрум» и «Бифидум-Мульти-3» у взрослых с вторичными дисбиозами 165-171
7.2. Изучение корригирующего влияния на микрофлору ЖКТ детей синбиотиков «Бифидум-Мульти-1» и «Бифидум-Мульти-2» 172-177
7.3. Изучение корригирующего влияния на микрофлору ЖКТ детей синбиотика «Нормоспектрум для детей» 177-187
7.4. Результаты применения БАД «Бифидум-Мульти-1» у детей первого года жизни с нарушениями микроэкологического и функционального состояния ЖКТ 187-191
7.5. Применение БАД «Бифидум-Мульти-2» и «Нормоспектрум для детей» в детских дошкольных учреждениях с целью профилактики заболеваемости у часто болеющих детей 191 -203
7.6. Результаты профилактики эндогенных и экзогенных инфекций в неонатологии с применением «Бифидум-Мульти-1» 203-214
7.7. Использование БАД «Нормоспектрум для взрослых» для профилактики госпитальных гнойно-септических осложнений у больных с колоректальным раком 214-221
Заключение 222
Выводы 247
- Качественный и количественный состав микрофлоры ЖКТ и функции, которые она выполняет
- Штаммы микроорганизмов, используемые в работе
- Изучение чувствительности к антибиотикам
- Изучение динамики культивирования бифидобактерий в составе многовидовой ассоциации
Введение к работе
Актуальность проблемы
В настоящее время становится реальностью нависшая над планетой угроза глобального экологического кризиса, существование в условиях которого приводит к развитию нарушений микробной экологии человека, сопровождающихся возникновением иммунодефицитных состояний, нарушением метаболических процессов и аллергизацией макроорганизма.
Наиболее восприимчивым к этим воздействиям является микробиоценоз кишечника, который реагирует на неблагоприятные факторы задолго до клинических проявлений снижением уровня индигенной микрофлоры и возрастанием содержания условно-патогенных микроорганизмов, т.е. состоянием дисбаланса микрофлоры — дисбиозом ( Куваева И.Б., 1991, Пинегин Б.В., 1984, Воробьев А.А.,1997, Шендеров Б.А, 1998, Коршунов В.М., 2000, Eckburg Р.В., 2005, Бондаренко В.М., 2007). Дисбиотические состояния широко распространены, имеют тяжелые последствия для здоровья, поэтому препараты для коррекции нарушенной микробиоты занимают одно из ведущих мест в комплексной терапии и профилактике заболеваний, при которых регистрируется дисбиоз. Ведущее место среди них принадлежит препаратам на основе микроорганизмов - представителей нормофлоры, что обусловлено их многофункциональным воздействием, включая нормализацию микробиоценоза, иммунного и метаболитного статуса организма, процессов электролитного обмена и т.д. (Поспелова В.В., 2000, Онищенко Г.Г., 2002, Воробьев А.А., 2004, Грачева Н.М., 2004, Мазанкова Л.Н., 2004, Новокшенов А.А., Учайкин В.Ф., 2004, Кафарская Л.И., 2005, Осипова И.Г., 2006, Парфенов А.И., 2006, Бондаренко В.М., 2007, Феклисова Л.В., 2007 г., Лахтин В.М., 2008, Callaway T.R, 2008, Fotiadis C.I, 2008, Francavilla R.,2008, Myllyoma E., 2008).
9 В связи с широкой распространенностью дисбиотических состояний важное научное и прикладное значение имеет установление закономерностей, связанных с процессами формирования и стабилизации нормобиоценоза, причин, вызывающих его нарушения. Вместе с тем, в настоящее время наши представления об индигенной микрофлоре в полной мере не отражают как всего многообразия отношений внутри микробного сообщества биотопа, так и его взаимосвязей с макроорганизмом.
Так, рациональный подход к конструированию и применению новых средств коррекции микрофлоры должен учитывать такое явление, как аутогенная сукцессия — последовательность смены биоценозов в определенной экологической нише (Сукачев В.Н., 1964, Бигон М., Харпер Дж., 1989, Рыбальченко О.В., 2008). В ходе этого процесса в видовом сообществе происходит последовательное вытеснение одних видов другими вследствие их биоэкологических преимуществ в определенных условиях. При этом образуется так называемый сукцессионный ряд с образованием конечного - устойчивого биоценоза. Все биоценозы в живой природе развиваются по законам сукцессии (Разумовский СМ., 1999). Что касается микроэкологии человеческого организма, данная закономерность прослеживается в смене видового состава бифидофлоры в процессе онтогенеза, совпадающего с критическими периодами развития в детском и подростковом возрасте: становлением иммунной и ферментативной систем, изменением гормонального фона, сменой пищевого рациона. В то же время, видовой состав бифидофлоры взрослых людей относительно стабилен (Гончарова Г.И., 1982; Козлова Э.П., 1986, Леванова Л.А., 2003, Rambaud J.C. et al., 2006, Лахтин В.М., 2008).
Важно отметить при этом, что вмешательство неблагоприятных внешних факторов, таких как отсутствие грудного вскармливания, эндогенные инфекции, неблагоприятная экология* и пр. могут нарушить естественный ход развития микробиоценоза (Соколова К.Я., 1999, Мухина Ю.Г., 2005, Кафарская Л.И., 2006, Smehilova, 2008). Становление микробиоценоза ЖКТ в
10 младенческом возрасте во многом определяет физиологический и иммунный статус организма в будущем, поэтому нарушения в ходе этого процесса требуют коррекции. Конструирование препаратов, представляющих собой ассоциации доминирующих микроорганизмов, которые максимально приближены по составу к естественному микробиоценозу ЖКТ человека в определенный возрастной период, является обоснованным подходом к решению данной актуальной проблемы.
Усиление эффекта применяемых средств можно прогнозировать также от сочетанного использования рационально подобранного состава пробиотических микроорганизмов, пребиотиков и функционально активных ингредиентов, дефицит которых является следствием дисбиоза (Gibson G.R., 1995, Тутельян В.А., 2002, Лахтин В.М., 2008, Шендеров Б.А., 2008). Такие препараты относятся к группе синбиотиков (Collins M.D., 1999). Данное перспективное направление также открыто для дальнейших исследований.
Таким образом, выбор темы настоящего исследования определяется актуальностью разработки высокоэффективных средств нового поколения для коррекции микроэкологических нарушений у детей и взрослых.
Цель исследования
Научное обоснование, биотехнологическая разработка и клинико-лабораторное подтверждение эффективности новых подходов к коррекции дисбиотических нарушений ЖКТ с помощью препаратов-синбиотиков на основе консорциумов бифидобактерий, комплементарных микробиоценозу различных возрастных групп людей, лактобацилл, пребиотиков и функционально значимых ингредиентов, дефицит которых возникает при дисбиозе.
Задачи исследования:
1. Изучить биологические, культуральные, физиолого-биохимические и молекулярно-генетические характеристики штаммов бифидобактерий, оценить
их производственную перспективность и отобрать виды, которые относятся к основным представителям бифидофлоры ЖКТ человека.
2. Разработать условия совместного культивирования биомассы
бифидобактерий, имеющей многовидовой состав.
3. Оптимизировать методы обезвоживания биомассы бифидобактерий и
лактобацилл - распылительного высушивания при низкой температуре
теплоносителя и сушки-гранулятора в псевдоожиженном слое.
Изучить пребиотические и технологические свойства различных растворимых пищевых волокон и оценить перспективность их включения в состав препаратов-синбиотиков.
Разработать рецептуру, технологическую документацию, изготовить экспериментально-производственные серии препаратов-синбиотиков. Оценить микробиологические, санитарно-гигиенические характеристики, сохранность всех компонентов препаратов при хранения. Осуществить их санитарно-гигиеническую экспертизу и государственную регистрацию на Федеральном уровне.
6. Изучить эффективность и безопасность разработанных препаратов при
использовании в практике профилактической и восстановительной медицины у
людей, относящихся к различным возрастным категориям.
Научная новизна
Впервые предложен алгоритм рецептуростроения препаратов нормофлоры, основанный на принципе видового доминирования бифидобактерий в ЖКТ у различных возрастных групп людей (Патенты РФ 2180348, 2180914, 2180915). Разработаны биотехнологические приемы конструирования препаратов-синбиотиков нового поколения «Бифидум-Мульти» и «Нормоспектрум» на основе консорциумов бифидобактерий, лактобацилл и ингредиентов, обладающих иммуностимулирующим, метаболическим и пребиотическим действием.
12 Теоретическая значимость
Выявленная в научных исследованиях смена видового состава бифидо-флоры в процессе онтогенеза явилась теоретическим обоснованием нового подхода к конструированию и применению средств коррекции дисбиотических нарушений ЖКТ — использованию консорциумов микроорганизмов нормофлоры, видовой состав которых моделирует сукцессионные ряды, меняющиеся в течение жизни человека. Это обеспечивает их комплементарность микробиоценозам ЖКТ конкретных возрастных групп пациентов и обеспечивает высокую эффективность при применении.
Практическая значимость
Разработаны и внедрены в практику новые оригинальные препараты-синбиотики, высокоэффективные при коррекции дисбиотических нарушений ЖКТ и дифференцированно подобранные для различных возрастных групп людей. Разработаны новые биотехнологические приемы совместного культивирования консорциумов бифидобактерий. Разработаны методы распылительного высушивания при низкой температуре теплоносителя и сушки-гранулятора в псевдоожиженном слое для получения препаратов с высоким содержанием пробиотических микроорганизмов, длительно сохраняющих жизнеспособность. Подтверждена пребиотическая активность ингредиентов - источников пищевых волокон (порошок клубней топинамбура, цикория, яблочного пектина) и показана их технологическая значимость для увеличения сроков и температурного диапазона хранения препаратов.
Проведенные исследования и разработанные на их основе рецептурный состав, санитарно-гигиенические документы и производственные регламенты позволили обеспечить прохождение процедуры независимой экспертизы продукции и документации и государственной регистрации Федеральной службой Роспотребнадзора с внесением в Государственный реестр биологически активных добавок к пище:
«Бифидум-Мульти-1» для детей от рождения до 3-х лет -СЭЗ № 7.99.03.919.Б.000085.10.05.
«Бифидум-Мульти-2» для детей от 3-х до 12-ти лет -СЭЗ № 7.99.03.919.Б.000086.10.05.
«Бифидум-Мульти-3» для взрослых - СЭЗ № 77.99.03.919.Б.000087.10.05 ( ТУ 9197-003-38989935-03, изменения к ТУ 9197-003-38989935-03 № 1.
«Нормоспектрум для детей» - СГР № 77.99.23.3.У. 10079.9.05
«Нормоспектрум для взрослых и детей старше 14-ти лет»
- СГР № 77.99.23.3.У.10080.9.05 - ( ТУ 9197-004-38989935-05)
Впервые организовано производство и начат серийный выпуск перечисленных
препаратов на предприятии биотехнологического профиля «Амфита».
Внедрение в практику
Разработанные препараты используются с профилактической целью и для реабилитации пациентов в следующих учреждениях:
«Бифидум-Мульти-1» в ГУ « Федеральное агентство высокотехнологичной медицинской помощи Научный Центр Акушерства, гинекологии и перинатологии» с целью профилактики эндогенных и экзогенных инфекций у новорожденных детей группы риска.
«Бифидум-Мульти-1» в условиях детской консультации для профилактики микроэкологических и функциональных нарушений ЖКТ у детей первых 18 месяцев жизни.
3. «Бифидум-Мульти-1» в условиях стационара НИИ детской
гастроэнтерологии (г. Нижний Новгород) у детей с нарушениями пищеварения
и микрофлоры кишечника.
4. «Бифидум-Мульти-1,2,3» в аллергологическом Центре КНИИЭМ (г.Казань) у
детей с аллергодерматозами.
«Бифидум-Мульти-2» и «Нормоспектрум для детей» для профилактики острых респираторных заболеваний у часто болеющих детей, посещающих детские дошкольные учреждения.
«Бифидум-Мульти-1,2,3» в отделениях детских и взрослых инфекций клинической инфекционной больницы № 1 (г. Москва) для восстановления микрофлоры и функционального состояния ЖКТ у детей и взрослых пациентов с дисбактериозами, возникшими на фоне различных заболеваний.
7. «Нормоспектрум для детей» и «Нормоспектрум для взрослых» в отделениях
детских и взрослых инфекций клинической инфекционной больницы
№ 1 (г. Москва) для восстановления микроэкологии и функционального
состояния ЖКТ у детей и взрослых пациентов с дисбактериозами, возникшими
на фоне различных заболеваний.
8. «Бифидум-Мульти-1,2» в Оренбургской государственной медицинской
академии в комплексной схеме восстановления микрофлоры у девочек с
неспецифическими вульвовагинитами.
«Нормоспектрум для взрослых» в Федеральном агентстве «НИИ иммунологии» для коррекции дисбиотических нарушений у больных после перенесенных аллергических заболеваний (г. Москва).
«Нормоспектрум для взрослых» на кафедре гастроэнтерологии ФГУ «УНМЦ» Управления делами Президента РФ для коррекции микрофлоры ЖКТ у пациентов с функциональными заболеваниями кишечника (синдром раздраженного кишечника, функциональный запор) с синдромом дисбактериоза.
«Нормоспектрум для взрослых» в клинической онкологической больнице № 62 (г. Москва ) для профилактики ГГСИ у больных, оперированных по поводу колоректального рака.
12. «Нормоспектрум для взрослых» в Астраханской государственной
медицинской академии для восстановления микрофлоты ЖКТ у больных
язвенной болезни желудка, язвенной болезни двенадцатиперстной кишки,
15 гастродуоденита после проведения специфической антихеликобактериальной терапии.
Анализ результатов данных исследований приведен в клинических отзывах, актах внедрения, актах клинических наблюдений.
Награды за разработку и внедрение:
Получены: знак РОСТЕСТ ГОССТАНДАРТА РОССИИ - За высокое качество с правом маркировки продукции «ЗНАКОМ КАЧЕСТВА «ВСЕ ЛУЧШЕЕ ЗДОРОВЬЮ»; золотая медаль ВВЦ, 2002 г.; золотая медаль им. И.И.Мечникова Российской Академии естественных наук «За практический вклад в укрепление здоровья нации» - 2003 г.; серебряная медаль III Московского международного салона инноваций в области биотехнологии -2003 г.; серебряная медаль Всероссийского научно-промышленного форума «Россия-единая - 2003»; золотая медаль Московского международного салона инноваций в области биотехнологии - 2004 г.; бронзовая медаль Московского международного салона инноваций в области биотехнологии, 2006 г.; золотая медаль Московского международного салона инноваций в области биотехнологии, 2008 г.; медаль Международного фонда биотехнологий им. академика И.Н.Блохиной за участие в конкурсе «Биотехнологические проекты для повышения качества жизни человека».
Апробация работы
Диссертация апробирована на заседании Ученого совета ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, протокол № 1 от 24 января 2008 г. Основные результаты исследований доложены и обсуждены на российских и международных конференциях:
Международная научно-практическая конференция «Пробиотические
микроорганизмы — современное состояние вопроса и перспективы
использования» (Москва, 2002);
Всероссийский симпозиум «Современные аспекты здорового образа жизни» (Москва, 2003);
Всероссийский форум «Великие реки» в рамках конкурса «Биотехнологические проекты для повышения качества жизни человека» (Нижний Новгород, 2003);
Международная конференция «Технологии и продукты здорового питания» (Москва, 2003);
7-ой Международный Конгресс «Здоровое питание» (Москва, 2003);
Международная научно-практическая конференция «Пробиотики,
пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания.
Современное состояние и перспективы» (Москва, 2004);
6-ая Международная ассамблея «Новые медицинские технологии»
(Москва, 2006);
Международный конгресс «Новые технологии в детском питании» (Москва, 2006);
Международный научно-практический конгресс «Человек в экстремальных условиях: здоровье, надежность и реабилитация» (Москва, 2006);
Международный симпозиум «Иммунобиологические препараты в педиатрии» (Москва, 2006);
Всероссийская конференция детских инфекционистов (Санкт-Петербург, 2006);
Международный конгресс «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические проблемы» (Санкт-Петербург, 2007);
Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» (Москва,
2007, 2008, 2009);
17 Международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009).
Положения, выносимые на защиту
Отбор видов, бифидобактерий по признаку доминирования в микробиоценозе ЖКТ различных возрастных групп людей представляет собой новый концептуальный подход к конструированию препаратов для коррекции микрофлоры кишечника.
Устойчивые консорциумы — продукт совместного культивирования симбиотической ассоциации технологичных и высокоэффективных видов бифидобактерий являются основой для получения препаратов нового поколения.
3. Распылительная сушка при низкой температуре теплоносителя и сушка-
гранулирование в псевдоожиженном слое перспективны для получения
высокоактивных- препаратов на основе пробиотических микроорганизмов
длительного хранения в широком диапазоне температур.
4. Новый.концептуальный подход в,разработке и принципе рецептуростроения
оригинальных препаратов-синбиотиков «Бифидум-мульти» и
«Нормоспектрум».
5. Преимущества по клинико-лабораторным показателям синбиотиков.
«Бифидум-Мульти» и «Нормоспектрум» при использовании в
профилактической и восстановительной медицине у разных возрастных групп
пациентов по сравнению с аналогичными препаратами моновидового состава.
Публикации
Основное содержание работы отражено в 64 научных публикациях: в статьях, в том числе, в рекомендованных ВАК РФ — 8, в других изданиях - 43, в патентах на изобретение - 12, в методических указаниях -1.
18 Объем и структура диссертации
Работа состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы из 416 наименований, в том числе, 208 зарубежных и 208 отечественных работ. Диссертация изложена на 280 страницах основного текста, содержит 31 рисунок и 79 таблиц.
Хочу почтить светлую память основателя лаборатории биологии бифидобактерий д.б.н., профессора Гончаровой Галины Ивановны, внесшую огромный вклад в развитие данного направления науки.
Приношу искреннюю благодарность сотрудникам лаборатории биологии бифидобактерий Жиленковой О.Г., Лисуновой С.А., Зубковой Е.С., Кураленко А.А., Мешковой Л.С. за участие в проведении данной работы.
Всем коллегам, принимавшим участие в проведении этого многопланового исследования, выражаю искреннюю признательность.
Качественный и количественный состав микрофлоры ЖКТ и функции, которые она выполняет
Окружающий нас мир населяет огромное множество микроорганизмов -бактерии, вирусы, простейшие. Только бактерии насчитывают более 5200 видов, однако, их численность постоянно растет [145]. Организм человека также заселяют микроорганизмы. По одним данным, это около 500 различных видов бактерий, не считая персистирующих вирусов, простейших, а также грибов. [40, 45, 76, 406]. При анализе результатов исследований, полученных путем секвенирования различных микроорганизмов мукозной микрофлоры ЖКТ, показано, что она состоит из 395 филогенетически обособленных групп, из которых 62% являются новыми. При этом подавляющее большинство этих микроорганизмов не культивируется на известных питательных средах ни в аэробных, ни в анаэробных условиях [244, 262, 267, 314. 373].
Большие возможности для изучения микробиоты открыл метод газовой хроматографии - масс-спектрометрии (ГХ-МС), позволяющий детектировать микроорганизмы по нелетучим жирным кислотам. Метод ГХ-МС, база данных и программа расчета обеспечивают количественный мониторинг более 1000 видов бактерий, грибов и актиномицетов микробиоты в любом субстрате по различным вариантам профиля 20 человеческих жирных кислот [147, 150]. В настоящее время суммарное количество ранее известных и вновь выявленных видов приближается к 1500 и требует уточнения [25, 204, 382].
Человек и окружающая среда представляют единую экологическую систему, находящуюся в состоянии биологического равновесия между макро- и микроорганизмами, строго адаптированными друг к другу. Видовой состав микрофлоры качественно и количественно формируется в зависимости от характера микроэкологии в биотопах, поскольку каждый вид микроорганизмов требует оптимальных для своей жизнедеятельности условий, обеспечивающих удовлетворение его биологических потребностей, а также адаптацию к тому окружению, которое складывается в местах его обитания [24]. В процессе эволюции в результате взаимодействия между организмом хозяина и окружающими его микроорганизмами происходил отбор определенных видов микробов, способных к колонизации слизистых соответствующих экологических ниш и использующих макроорганизм как новую среду обитания. Так сформировались симбиотические ассоциации, составляющие нормальную микрофлору человека и животных [23, 45, 402, 404, 415].
Показано, что организм взрослого человека состоит примерно из 10 клеток, в то время как в органах, тканях, а также в полостях человека обитает до 10 -10 , а при некоторых патологических состояниях — до 10 особей микроорганизмов [153, 165, 187, 198, 201, 284, 301, 306].
Нормальной микрофлорой (нормофлорой) называется качественное и количественное соотношение в отдельных органах и системах разнообразных популяций микробов, поддерживающих биохимическое, метаболическое и иммунное равновесие макроорганизма, необходимое для сохранения здоровья человека [144].
Термин «микробиота», предложенный T.Rosebury в 1962 г., наиболее принят в современной зарубежной литературе [405] и несет ту же смысловую нагрузку, что принятое в ОСТ 91 500.11.0004-2003 обозначение «нормофлора». Аналогами также являются термины «нормобиоценоз», «нормальная микрофлора», «микробиоценоз», «микробная экология» [157, 179, 350, 36, 379].
Микробиота - это эволюционно сложившееся сообщество разнообразных микроорганизмов, населяющих открытые полости организма человека, определяющее биохимическое, метаболическое и иммунологическое равновесие макроорганизма. Микробиота человека представляет собой симбиотическую систему, взаимодействующую на принципах комменсализма и мутуализма — высшей формы взаимовыгодных симбионтных взаимоотношений [77, 203]. Взаимно дополняя друг друга, макроорганизм и сопровождающие его бактерии образуют единую систему. При этом макроорганизм представляет не только среду обитания, находясь в состоянии динамического равновесия с собственной микрофлорой, но и является частью этой системы [7, 43, 112, 214, 215,218,220,236,244,350].
Это следует, прежде всего, из того, что микрофлора генетически связана с макроорганизмом и способна оказывать влияние на все функции хозяина [265]. Суммарный микробный геном в кишечнике человека - микробном более чем в 100 раз превышает количество генов в геноме человека [373]. Общее разнообразие метаболических путей бактерий — метабол ом - также в 100 раз превышает таковой у человека, при этом реализуя необходимые для человека структурные и регуляторные функции, которые сам человеческий организм не может синтезировать [336].
Результаты расшифровки генома бактерий и человека показали, что организм последнего содержит нуклеотидные последовательности, характерные более, чем для 200 бактериальных генов, а также для 500 видов ретровирусов, которые, очевидно, заимствованы у микроорганизмов в процессе филогенеза [76, 314]. Благодаря координированной работе эволюционно сложившихся систем регуляции симбиоза осуществляется согласованное взаимодействие генов эукариотических клеток и геномов многочисленных симбиотических микроорганизмов [24, 262].
Процесс внутрипопуляционного информационного обмена бактериальных клеток между собой получил название «quorum sensing» (чувство кворума, QS) [50]. Микроорганизмы резидентной микрофлоры, находясь между собой в разнообразных, сложных и противоречивых взаимоотношениях (нейтрализм, конкуренция, мутуализм, синергизм, комменсализм, паразитизм и т.д.) без системы регуляции в условиях сравнительно ограниченного пространства существования и лимитированного количества энергетических, пластических и регуляторних субстанций вступали бы в конкурентные взаимоотношения, которые приводили бы к гибели. Недостаток или избыток того или иного субстрата или метаболита, также как и изменение окружающей среды, служат сигналом для адаптивных или необратимых изменений в соответствующем звене микроэкологической системы [ 187, 197, 199]. Взаимоотношения внутри этой системы, осуществляющиеся с помощью «quorum sensing», который представляет собой специфический вариант регуляции экспрессии генов, т.е. механизм, посредством которого микроорганизмы способны осваивать окружающую их среду, которой является человеческий организм [151, 189].
Штаммы микроорганизмов, используемые в работе
При воздействии на микробиоту человека различных экзо- и эндогенных факторов могут происходить качественные и количественные изменения микробиоты, превышающие нормативные показатели. Эти изменения могут быть кратковременными и исчезнуть после устранения фактора, но зачастую они не проходят бесследно и приводят к состоянию дисбиоза [23, 199,201, ].
Под дисбиозом понимают клинико-лабораторный синдром, связанный с изменением качественного и/или количественного состава микрофлоры кишечника и последующим развитием метаболических и иммунологических нарушений, а также желудочно-кишечных расстройств [148]. Формирование дисбиозов ЖКТ различной этиологии характеризуется снижением облигатной микрофлоры - бифидобактерий и лактобацилл, кишечной палочки и выраженным увеличением УПМ, относящихся к семейству энтеробактерий, лактозонегативных и гемолизин-продуцирующих эшерихий, псевдомонад. Эти бактерии становятся доминирующими в микрофлоре кишечника. Значительно повышаются уровни энтерококков, и других стрептококков, коагулазопозитивных стафилококков, дрожжеподобных грибов рода Candida, лецитиназопозитивных клостридий, бацилл, происходят качественные и количественные изменения среди бактероидов, фузобактерий и неспорообразующих и анаэробных кокков, проявляющиеся в увеличении представительства тех видов, которые в норме не являются доминирующими [7, 37, 38, 40, 61, 72, 100, 113, 115] . Параллельно с этим происходит контаминация тонкой кишки «фекальными» микроорганизмами, обладающими патогенными свойствами, и распространение их за пределы кишечника (транслокация), с последующим заселением внутренних органов и других нехарактерных для них ниш, в которых даже безопасные микроорганизмы, такие как лактобациллы, могут вызывать формирование патологических процессов [30, 31, 27, 123, 131, 163, 219, 242, 321, 376]. Бактериальная контаминация тонкой кишки способствует развитию различных патологических состояний, проявляющихся в виде таких синдромов, как малабсорбция, стеаторея и др. Нарушения нормальной микрофлоры кишечного тракта при дисбиозах приводят к функциональным изменениям и соматическим нарушениям в кишечнике. В результате снижения уровня бифидобактерий нарушаются процессы пищеварения: всасывания питательных веществ, усвоения железа, кальция, синтез эндогенных витаминов; утрачивается способность к активации различных ферментов и их субстратов в кишечном содержимом, развиваются гипопротеинемия и бактериемия. Элиминация лактобактерий приводит к сдвигу рН в кишечнике в щелочную сторону и снижению уровня ферментативной активности этих микроорганизмов в кишечнике, что ведет к торможению процессов утилизации организмом человека биологически активных соединений. Уменьшение количества бифидобактерий и лактобацилл понижает в значительной степени устойчивость кишечника к заселению его УПМ, присутствующими в норме в небольших количествах в толстой кишке у людей. УПМ, в свою очередь, вызывают нарушения всасывания углеводов, жирных кислот, аминокислот, азота, витаминов, успешно конкурируют с организмом хозяина за утилизацию и усвоение питательных веществ, поступающих с пищей. Продукты метаболизма и токсины УПМ снижают детоксикационную способность печени, нарушают проницаемость кишечной стенки, подавляют регенерацию слизистого слоя кишки, тормозят перистальтику и приводят к развитию диспепсического синдрома, диареи [25, 31, 38, 88, 224, 226, 230, 231, 250]. Одним из наиболее распространенных и значимых нарушений кишечного микробиоценоза является недостаточность бактерий нормофлоры, в первую очередь, бифидобактерий, дефицит которых усугубляется с утяжелением характера патологического процесса, как в толстой кишке (неспецифический язвенный колит) и вышерасположенных отделах ЖКТ (язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки), так и при тяжелых заболеваниях других органов и систем. Снижение их количества ассоциировано с ростом УПМ, что, как известно, является признаком глубины дисбиотических нарушений [230, 238, 251, 371, 372]. В настоящее время перечень заболеваний, основные звенья патогенеза которых так или иначе связаны с качественными и количественными нарушениями микрофлоры кишечника, продолжают расширяться. К ним относятся заболевания органов пищеварения (СРК, хронические воспалительные заболевания кишечника, хронический гастрит, язвенная болезнь, хронический панкреатит), сердечно-сосудистые заболевания, болезни обмена веществ (сахарный диабет, ожирение, мочекаменная болезнь), онкопатологические процессы, аллергические и аутоиммунные заболевания (бронхиальная астма, ревматоидный артрит), гинекологические заболевания и многие другие клинические синдромы и патологические состояния. [6, 8, 17, 26, 31, 38, 125, 146, 153, 167, 182]. Можно с большой долей вероятности утверждать, что любая патология внутренних органов сопровождается изменениями кишечного микробиоценоза [175, 186]. В свою очередь, сопутствующие дисбиотические изменения кишечника, достигающие определенного уровня, ухудшают клиническое течение основного заболевания. В этих условиях нарастает выраженность клинических симптомов, удлиняются сроки, утяжеляется общее состояние, ухудшаются показатели лечения и качество жизни пациентов. Важно, что, если в ходе лечения не удалось добиться оптимизации состояния кишечного микробиоценоза, чаще отмечаются осложненное течение основного заболевания и наступают рецидивы [77].
Распространенность дисбиотических изменений среди населения различных возрастных групп чрезвычайно высока. По некоторым данным, дисбиоз той или иной степени определяется у 90% населения России — как у условно здоровых людей, так и с различными патологиями. Принимая во внимание создавшуюся ситуацию, становится очевидным, насколько важна проблема восстановления микроэкологического статуса жителей нашей страны и проведение системы научных и биотехнологических исследований, разработке средств, направленных на решение этой важной проблемы [198].
В настоящее время-одним из наиболее доступных и эффективных способов» экологической реабилитации является-использование пробиотиков — продуктов, биологически активных добавок и фармацевтических препаратов на основе полезных микроорганизмов; прежде всего, бифидобактерий, оказывающих многофакторное регулирующее и стимулирующее воздействиие на организм человека, укрепляющих иммунную систему, защищающих от болезнетворных микроорганизмов [16, 33, 34]. В основе действия препарата-пробиотика лежат такие свойства, как способность входить в состав транзиторной микрофлоры, проявление антагонистической активности в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий и гнилостной флоры и удалении их из кишечника. При их назначении в короткие сроки восстанавливается бифидо- и лактофлора, улучшается пищеварение, обменные процессы, нейтрализуются токсины, снижается уровень аллергических реакций, стимулируется иммунитет.[27, 28]
Изучение чувствительности к антибиотикам
Состояние микробиоценоза кишечника имеет важное физиологическое значение для жизнедеятельности растущего детского организма: аутофлора, приобретенная на самых ранних этапах жизни ребенка существенно влияет на его физиологический и иммунный статус, определяя общую резистентность его организма [ПО, 135, 144, 148 ]. Так, С. Romond et al при обследовании 640 грудных детей, из которых 235 вскармливались грудью и 296 находились на смешанном или искусственном вскармливании, показали, что в первой группе заболеваемость кишечными инфекциями не превышала 2,9 %, в то время как во второй она достигала 24,8%. На втором году жизни процент тех же детей, страдающих кишечными инфекциями, составил 16% в первой группе; во второй группе — 53%. Авторы установили корреляцию между заболеваемостью кишечными инфекциями и наличием в кишечнике бифидобактерий: в первой группе они выделялись у 94 % , во второй - у 72 %. Чаще всего выделялся вид B.bifidum (в первой - 72%, во второй - 13%; на втором месте - B.longum — 28% и 60 % соответственно).
Несмотря на то, что в последние годы определяется тенденция к снижению уровня бифидобактерий в кишечнике, в норме количество бифидобактерий у грудных детей должно составлять от 10 10 -10 и КОЕ/г фекалий [24]. Снижение содержания бифидобактерий в составе кишечной микрофлоры грудных детей отмечала еще в 1980-е г.г. Г.И. Гончарова [57]. Она показала, что лишь у 75,3% детей, получавших грудное молоко, бифидобактерий высевались из оптимальных 10"9-10"10 разведений фекалий и составляли 85-90% всей микрофлоры толстой кишки. Кроме того, по ее мнению, многолетнее применение антибиотиков привело к тому, что у здоровых доношенных детей, находящихся на грудном вскармливании, стабильное преобладание бифидофлоры над аэробными микроорганизмами наступало к 8-9 суткам жизни вместо 3-4 [15]. Еще одним неблагоприятным фактором, который отмечают многие авторы, является сокращение числа выделяемых видов бифидобактерий. Так, в работе Т. Mitsuoka показано, что у 71% детей, получавших материнское молоко, изолировали бифидобактерий двух видов, а среди младенцев, вскармливаемых искусственными смесями, таких было только 29% [339, 340]. Аналогичные данные получены Е.А.Е. Mevissen-Verhage: у детей на грудном вскармливании выделяли в среднем 2,9 вида от ребенка, а у младенцев на искусственной диете только 1,4 вида [335]. Результаты исследований, проведенных Г.И. Гончаровой, показали, что у 87% детей, питавшихся грудным молоком, изолируемые бифидобактерий были представлены одним видом бактерий [15]. Результаты, полученные S.L. Young et al [406] также показали, что у каждого из обследованных грудных детей были выделены бифидобактерий только одного вида. Сроки формирования бифидофлоры, по мнению разных авторов, также зависят от характера питания и составляют от 3-5 дней у грудных детей и до 2-3 недель у детей на искусственном вскармливании [24, 178]. У детей старшего возраста и у взрослых содержание бифидобактерий ниже и составляет 10 9-10 10 КОЕ/г.
Изменение микрофлоры ЖКТ кишечника новорожденных связано с явлением естественной сукцессии нормальной микрофлоры. Аутогенная сукцессия - это последовательность смены биоценозов в определенной экологической нише [14, 164, 179]. В ходе этого процесса в видовом сообществе происходит последовательное вытеснение одних видов другими вследствие их биоэкологических преимуществ в определенных условиях. При этом образуется так называемый сукцессионный ряд с образованием конечного — устойчивого биоценоза. Все биоценозы в живой природе развиваются по законам сукцессии. Что касается микроэкологии человеческого организма, данная закономерность прослеживается в смене видового состава бифидофлоры в процессе онтогенеза. По мнению одних авторов, этот процесс затрагивает только первые два года жизни человека. Так, считают, что процесс сукцессии проходит 4 стадии: 1 — до начала прикорма, 2 — после начала прикорма, 3 — после начала дачи твердой пищи, 4 - после прекращения грудного вскармливания. Это, по мнению авторов, свидетельствует о необходимости оценивать состояние симбиотической микрофлоры новорожденных и детей до двух лет с учетом возраста, характера питания и стадии сукцессии [175]. Помимо этого, изменения в составе микрофлоры совпадают с критическими периодами развития в детском и подростковом возрасте: становлением иммунной и ферментативной систем, изменением гормонального фона, сменой пищевого рациона. В то же время, видовой состав бифидофлоры взрослых людей относительно стабилен [56, 85, 108, 111, 393].
Изучение микробного пейзажа детей и взрослых, проведенное отечественными исследователями [56, 87] показало, что бифидобактерии в кишечнике здорового человека представлены сразу несколькими видами, каждый из которых имеет свои биохимические и физиологические особенности. Вид B.bifidum выявляется у здоровых людей всех возрастных групп; у детей на грудном вскармливании он является преобладающим и выделяется у 70% обследованных, до 40% - у детей 4-6 лет и до 15-20% - у взрослых. Вид B.longum также характерен для детей и взрослых и выделяется у 40-60% детей первого года жизни и у 70-75% детей старшего возраста и взрослых людей среднего возраста; у пожилых людей он выделяется в 30% случаев. Вид B.adolescentis свойственен взрослым людям и детям старшего возраста и обнаруживается у них в 60-65% случаев. Этот вид становится преобладающим у пожилых людей (85%). Виды B.infantis и В.breve и их подвиды обнаруживаются преимущественно у детей грудного возраста (рис. 3). Аналогичные результаты получены в исследованиях зарубежных ученых: [339, 340], которые отмечали В. infantis как преобладающий вид у детей грудного возраста; вид В. breve считали вторым по частоте встречаемости у детей.
Изучение динамики культивирования бифидобактерий в составе многовидовой ассоциации
Следует отметить, что длительность экспоненциальной фазы различалась у всех изучаемых штаммов и составляла у различных культур от 6 до 12 часов. Судить об ее окончании можно было по отсутствию прироста оптической плотности.
Так, если у штамма B.longum В379М равномерный прирост оптической плотности бактериальной суспензии наблюдался на протяжении всего срока культивирования - в течение 12 часов, то у штамма B.adolescentis ГО-13 отсутствие такового было отмечено через 6 часов.
Как видно на рисунках 6,7,8, в течение этого времени происходил равномерный прирост биомассы, что подтверждалось наблюдающейся корреляцией в нарастании оптической плотности, активной кислотности и данными по числу КОЕ/мл бифидобактерий.
При этом следует отметить, что для каждой культуры в идентичных условиях была характерна своя динамика роста. Так, для каждого штамма было отмечено свое значение соотношения числа КОЕ/мл к оптической плотности, что связано с морфологическими и физиологическими особенностями каждой культуры.
Нами было отмечено, что большое значение имеет возраст и количество посевного материала: оптимальным вариантом является засев инокулятом в экспоненциальной фазе роста (6-8 часовая культура). Посевной материал, взятый на более поздней фазе роста, негативным образом влияет на адаптацию и развитие культуры. Это можно объяснить накоплением в культуральной жидкости рост-лимитирующих веществ, что согласуется с данными других авторов [10, 34]. Интересно отметить, что поздняя экспоненциальная фаза роста культуры имеет ступенчатый характер, что можно так же объяснить продукцией метаболитов, тормозящих рост.
Важным является наблюдение, что при культивировании в аппарате, в отличие от стационарных условий, уменьшается вязкость культуральной жидкости, которая сопровождается изменением морфологии клеток бифидобактерий. Скорее всего, это связано с усилением массообменных процессов вследствие постоянного перемешивания при ведении процесса. При микроскопировании культур в мазках были видны клетки, в виде палочек, расположенных цепочками, отмечалась более однородная структура микробной культуры, уменьшение количества крупных клеточных ассоциаций - «бифидопластов». Это имеет важное биотехнологическое значение на дальнейших стадиях производственного процесса, таких, как высушивание биомассы. Таким образом, полученные нами данные культивирования различных штаммов бифидобактерий показали, что, каждый из них имеет свои особенности культивирования, которые проявляются, прежде всего, в длительности экспоненциальной фазы развития перед выходом на стационарную фазу. Если процесс не подвергается искусственной регуляции, пределом развития популяции является содержание бифидобактерий в 1 мл не более lg 9 КОЕ/мл. Процесс развития популяции заканчивался, когда значение рН устанавливалось в пределах 4,0-4,7. Полученные данные согласуются с литературными данными [34, 151] о том, что ауторегулятором процесса культивирования являются низкомолекулярные - вещества, преимущественно, органические кислоты. В нашем случае - это уксусная и молочная кислоты Iкак основные продукты метаболизма бифидобактерий. По имеющимся данным [145] их соотношение в культуре составляет примерно 2:1, но индивидуально для каждого штамма. Вероятно, накопление этих веществ, их соотношение влияют на ход процесса культивирования. Регулируя значение1 рН, тем самым подавляя рост-лимитирующие факторы, можно увеличить выход активной биомассы за определенный период времени культивирования и добиться более высокой концентрации клеток. 4.2. Изучение динамики культивирования бифидобактерий в составе многовидовой ассоциации Решение данной задачи представляет большую важность как с технологической, так и с медико-биологической точек зрения. С одной стороны, совместное культивирование существенно удешевляет и упрощает производственный процесс. С другой, медико-биологической позиции, пример препаратов на основе симбиоза (консорциумов) пробиотических штаммов, оказывающих взаимное синергидное действие на этапах изготовления препарата и в условиях последующего персистирования in vivo является приоритетным в создании микробных биопрепаратов. Правомочность такого подхода подтверждает высокая эффективность средству сконструированных с учетом межвидового и межродового синергизма (например, Ацилакт, Бификол). В работе были использованы те же штаммы, что и в предыдущем исследовании. Выбор модели был основан, во-первых, на том, что это были штаммы пяти основных видов бифидобактерий — представителей нормофлоры человека. Кроме того, культуры данных штаммов отличаются морфологией колоний, выросших на полужидкой среде, настолько, что их дифференциация в составе смешанной популяции не вызывает затруднений и делает возможным количественный учет результатов культивирования в эксперименте (табл. 15). Для проведения совместного культивирования подбирали строго количественно соотношение посевного материала каждого из штаммов. По оптическому стандарту мутности устанавливали концентрацию ОЕ/мл, равную 1 млрд клеток бифидобактерии. Выращивание проводили на ГМ-среде. Посев культур в ферментер проводили поэтапно, с периодичностью в 1 час, коррегируя рН культуральной жидкости 20% NaOH перед засевом нового штамма до 6,7. Очередность засева зависела от длительности экспоненциальной фазы роста каждого из штаммов и была следующей: 1 час - Bifidobacterium longum В379М; 2 час - Bifidobacterium breve 79-119; З час - Bifidobacterium infantis 73-15; 4 час - Bifidobacterium bifidum 791; 5 час - Bifidobacterium adolescentis ГО-13. Процесе культивирования вели 12 часов при стандартных условиях (рис.9). Как видно из представленных на рис. 9 данных эксперимента, при предложенной схеме внесения посевного материала не происходило взаимного ингибирования культур. Кроме того, у отдельных культур (B.breve, В.infantis, B.adolescentis) показатели числа КОЕ/мл были несколько выше, чем при раздельном выращивании (р 0,05). Число КОЕ/мл бифидобактерии в консорциуме составило 5,6x109, т.е. сумму из числа КОЕ/мл каждой из пяти культур. При этом отмечалась тенденция к синергидному эффекту.
